Dispositivo separador, dispositivo de deposición y sistema para manipular embriones vegetales somáticos.

Un procedimiento para separar embriones vegetales suspendidos en fluido de tejido embriogénico inmaduro,

que comprende las etapas de:

a) proporcionar un contenedor separador (5) adecuado, conteniendo dicho contenedor fluido que tiene una densidad inferior a la de los embriones a separar, teniendo una forma esencialmente cilíndrica, teniendo una pared inferior esencialmente plana (6) y un eje esencialmente vertical; y

comprendiendo además un conducto (7) en comunicación con el fluido en el contenedor en la región axial de la pared inferior (6) durante la operación y

un medio de inducción de un flujo de rotación (18) axisimétrico que es un objeto en rotación colocado dentro del contenedor (5);

b) crear un vórtex colector en la región axial de la pared inferior (6) drenando fluido de dicho conducto (7); e

inducir un flujo de rotación axisimétrico en el fluido relativo a la pared inferior (6) mediante el medio de rotación (18), de modo que:

i) se cree una capa límite viscosa (20) en la pared inferior (6); y

ii) se cree un gradiente de presión radial en el contenedor separador (5);

c) introducir los embriones suspendidos en fluido y el tejido embriogénico inmaduro a separar en fluido presente en el contenedor separador (5) en una ubicación alejada de la pared inferior (6), de modo que:

i) los embriones sedimenten más rápido que el tejido embriogénico inmaduro;

ii) dejar que los embriones puedan entrar en la capa límite viscosa (20), mientras no dejan que el tejido embriogénico inmaduro pueda entrar en la capa límite viscosa (20);

iii) arrastrar los embriones que entran en la capa límite viscosa (20) dentro de la región axial de la pared inferior (6) y

d) recoger embriones de dicha región axial de la pared inferior (6) en el fluido drenado del conducto (7);

por lo que los embriones recogidos se separan esencialmente del tejido embriogénico inmaduro.

Dispositivo separador, dispositivo de deposición y sistema para manipular embriones vegetales somáticos Antecedentes de la invención Introducción general al área del problema

La embriogénesis somática en plantas es un proceso en el que se forman embriones somáticos a partir de un explante inicial que es una célula en un tejido vegetal. Los embriones somáticos formados son copias genéticamente idénticas de la planta que proporciona el explante inicial. De este modo, el proceso de embriogénesis somática ofrece una herramienta para obtener un gran número de plantas genotípicamente idénticas para la multiplicación de genotipos seleccionados de interés comercial, para la conservación de especies en peligro o para generar material vegetal genéticamente uniforme con fines de investigación.

Antecedentes fisiológicos de los procedimientos relacionados con el problema

Para producir plantas a partir de embriones somáticos de coniferas se aplica un procedimiento de múltiples etapas para cumplir las necesidades fisiológicas de las diferentes etapas de desarrollo, como se describe más adelante y se muestra en la figura 1. El inicio de la embriogénesis somática comienza con la inducción de embriones somáticos a partir de un explante inicial, normalmente un embrión cigótico inmaduro, en un medio de cultivo solidificado que contiene regulador del crecimiento de plantas. Los embriones somáticos siguen formándose, normalmente en el mismo medio de cultivo de la composición, y una forma de cultivo embriogénico en proliferación. En la etapa de proliferación tienen lugar varias de las características clave consideradas generalmente beneficiosas para el proceso de la embriogénesis somática: (i) la propagación de masa de propágulos genotípicamente idénticos mediante una multiplicación sin límites de tejido embriogénico inmaduro; (ii) el almacenamiento criogénico de embriones en proliferación confirma un almacenamiento prácticamente eterno de clones, es decir se establece un banco de clones, (iii) la modificación transgénica del embrión somático inmaduro permite la propagación a gran escala de propágulos mejorados genéticamente.

En la etapa siguiente del procedimiento, el embrión somático en proliferación se somete a un medio de crecimiento que desencadena que el desarrollo del embrión progrese a la etapa de maduración. La conversión de proliferación en maduración sólo se produce en una fracción de los embriones en proliferación en el cultivo: Se encuentran índices de conversión bajos con más frecuencia en genotipos de especies de coniferas recalcitrantes, pero son frecuentes en todas las especies de coniferas así como en otras especies de plantas. El trabajo manual necesario para recoger embriones aumenta con la disminución del índice de conversión y, de este modo, el coste y el riesgo de contaminación y otras inexactitudes. El índice de conversión bajo de proliferación a maduración es un cuello de botella principal para las aplicaciones comerciales a gran escala de procedimientos de embriogénesis somática. Para la germinación, los embriones somáticos maduros se someten a diferentes regímenes de cultivo para inducir la formación de raíces y de brotes, en una serie de etapas diferentes; desecación, tratamiento con sacarosa, inducción con luz roja y estimulación con luz azul. Después, los embriones germinados que se estime que se han desarrollado adecuadamente se transfieren a un material de abono y se transfieren gradualmente a un ambiente ex vitro durante el cual se reduce el contenido en sacarosa. Los diferentes tratamientos durante la germinación en una planta requieren la manipulación manual repetida de germinantes y plantas individuales, lo que añade un coste considerable al procedimiento global.

Producción de plantas a partir de embriones somáticos

El procedimiento de la técnica anterior para producir plantas a partir de embriones somáticos requiere la manipulación manual en varias etapas, lo que hace que el procedimiento requiera tiempo y sea caro e impreciso.

Para las especies de coniferas, los procedimientos estándar usados implican varias etapas cuando se requiere manipulación manual. El procedimiento general se indica en la figura 1 (véase, por ejemplo, von Arnold S, Clapham D. Spruce embryogenesis. 28. Methods Mol Biol. 28; 427:31-47; Belmonte M F, Donald G, Reíd D M, Yeung E C y Stasolla C. 25. Alterations of the glutathione redox State improve apical meristem structure and somatic embryo quality in white spruce (Picea glauca). J Exp Bot, vol. 56, n.2 419, págs. 2355-2364).

Hay cuatro etapas que dependen de la manipulación manual para obtener una planta pequeña del embrión somático maduro como se observa en la Figura 1. La primera interacción manual se produce cuando [1] el embrión maduro se aísla de embriones inmaduros (12) y se coloca horizontalmente en un contenedor de plástico en condiciones estériles; la segunda [2] se produce tras 3-7 días de reposo (13), después, el embrión maduro se transfiere a un medio de cultivo en gel para el inicio de los procesos de germinación. El embrión somático germinado iniciará, en la composición del medio de cultivo y las condiciones de luz adecuadas, raíces (14). La tercera transferencia manual [3] es cuando el germinante que ha formado una raíz pequeña se transfiere a una posición vertical con la raíz parcialmente sumergida en medio de germinación líquido (15). La cuarta [4] y última transferencia es cuando el embrión germinado tiene una raíz primaria y pequeñas raíces laterales, después se transfiere a un sustrato sólido en

una maceta para la formación de la planta posterior (16). Tabla 1 Lista de designaciones pertenecientes a la figura 1.

En el procedimiento disponible hasta la fecha para producir plantas a partir de embriones somáticos, los embriones se recogen manualmente del tejido embriogénico inmaduro. Esto requiere tiempo y es ineficaz. Los documentos US6684564 y US756839 de la técnica anterior enseñan la automatización de las transferencias manuales que sustituyen al ojo humano, el brazo humano y las pinzas con sistemas de visión, cintas transportadoras y brazos robóticos automatizados con puntas de succión para recoger los embriones de cintas transportadoras porosas para depositarlos en un destino de un modo muy similar a como lo hace el ser humano. No obstante, este enfoque, análogo a la automatización del movimiento de un ala de un ave, por alas de robot para el vuelo, es demasiado complejo y poco práctico por varios motivos, como se indica más adelante. Por tanto, sería deseable proporcionar un modo simple y práctico para realizar la separación y la deposición de los embriones más rápido y más eficientemente. Los embriones somáticos maduros producidos están pegados inicialmente con tejido embriogénico inmaduro en racimos. Esto hace el proceso más complejo, ya que primero se tienen que separar los embriones del tejido embriogénico inmaduro en el racimo rompiendo el racimo. La técnica anterior no enseña cómo romper los racimos embriogénicos de un modo automático.

Rotura de los racimos mediante un dispersor

En la solicitud de patente PCT/US9/39981 se divulga un procedimiento de romper rápidamente los racimos basado en la suspensión de dichos racimos en medio líquido, tal como agua, y forzar los racimos en al menos una secuencia de dispersión, en la que los racimos de masa embriogénica quedan expuestos a fuerzas de flujo dinámico que causan la rotura de los racimos y la dispersión de los embriones individuales.

Segregación de embriones mediante un separador

Cuando la masa embriogénica se dispersa en un líquido de acuerdo con el procedimiento presentado anteriormente, una mezcla de embriones inmaduros y maduros y tejido embriogénico inmaduro se suspenden en el medio líquido. En muchas aplicaciones es muy deseable segregar y recoger los embriones de la masa embriogénica dispersada antes del procesamiento adicional posterior. Por... [Seguir leyendo]

Un procedimiento para separar embriones vegetales suspendidos en fluido de tejido embriogénico inmaduro, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un contenedor separador (5) adecuado, conteniendo dicho contenedor fluido que tiene una densidad inferior a la de los embriones a separar, teniendo una forma esencialmente cilindrica, teniendo una pared inferior esencialmente plana (6) y un eje esencialmente vertical; y comprendiendo además un conducto (7) en comunicación con el fluido en el contenedor en la región axial de la pared inferior (6) durante la operación y

un medio de inducción de un flujo de rotación (18) axisimétrico que es un objeto en rotación colocado dentro del contenedor (5);

b) crear un vértex colector en la región axial de la pared inferior (6) drenando fluido de dicho conducto (7); e inducir un flujo de rotación axisimétrico en el fluido relativo a la pared inferior (6) mediante el medio de rotación (18), de modo que:

i) se cree una capa límite viscosa (2) en la pared inferior (6); y

ii) se cree un gradiente de presión radial en el contenedor separador (5);

c) introducir los embriones suspendidos en fluido y el tejido embriogénico inmaduro a separar en fluido presente en el contenedor separador (5) en una ubicación alejada de la pared inferior (6), de modo que:

i) los embriones sedimenten más rápido que el tejido embriogénico inmaduro;

ii) dejar que los embriones puedan entrar en la capa límite viscosa (2), mientras no dejan que el tejido embriogénico inmaduro pueda entraren la capa límite viscosa (2);

¡ü) arrastrar los embriones que entran en la capa límite viscosa (2) dentro de la región axial de la pared inferior (6) y

d) recoger embriones de dicha región axial de la pared inferior (6) en el fluido drenado del conducto (7); por lo que los embriones recogidos se separan esencialmente del tejido embriogénico inmaduro.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende

a) proporcionar un contenedor separador adecuado (5) que además comprende un conducto (7) en comunicación con el fluido en el contenedor en la región axial de la pared inferior (6) durante la operación, en el que el conducto (7) está colocado y dimensionado de un modo tal que los embriones arrastrados dentro de la región axial de la pared inferior (6) durante la operación entren en el conducto (7) mediante sedimentación gravitacional; y

b) recoger embriones de dicho conducto (7).

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además la etapa de modular la velocidad de sedimentación de los embriones en el conducto (7) por medio de inducción del flujo del fluido a través del conducto (7) hacia el interior del contenedor separador (5).

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el procedimiento está adaptado para operar de forma discontinua y comprende además recolectar selectivamente los embriones durante un periodo de tiempo tras la sedimentación de los embriones pero antes de que el tejido embriogénico inmaduro haya tenido tiempo de sedimentar.

El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el procedimiento está adaptado para operación continua de un modo tal que comprende alimentar fluido en el contenedor separador (5) a una velocidad que supera la velocidad del flujo de fluido del conducto (7).

Un dispositivo para separar entre sí embriones vegetales suspendidos en fluido y tejido embriogénico inmaduro, que comprende:

a) un contenedor separador (5), que, durante la operación, contiene fluido que tiene una densidad menor que la densidad de los embriones a separar, teniendo dicho contenedor una forma esencialmente cilindrica, teniendo una pared inferior esencialmente plana (6), un eje esencialmente vertical y comprendiendo un

7.

8.

conducto de fluido (7) en comunicación con el interior del contenedor, localizado en la región axial de la pared inferior (6);

b) un medio de inducción de un flujo de rotación axisimétrico en el fluido relativo a la pared inferior (6) que es un objeto en rotación colocado dentro del contenedor (5), de modo que durante la operación:

i) se crea una capa límite viscosa (2) en la pared inferior (6);

ii) se crea un gradiente de presión radial en el contenedor separador (5);

c) medios de introducción de los embriones suspendidos en fluido y el tejido embriogénico inmaduro a separar en el fluido presente en el contenedor separador (5) en una ubicación alejada de la pared inferior (6), de modo que durante la operación:

i) los embriones sedimentan sustancialmente más rápido que el tejido embriogénico inmaduro;

ii) los embriones entran en la capa límite viscosa (2) mientras que el tejido embriogénico inmaduro permanece sustancialmente fuera de la capa límite viscosa (2);

¡ii) los embriones que entran en la capa límite viscosa (2) se extraen dentro de la región axial de la pared inferior (6) y hacia el interior del conducto (7); y

d) medios para recoger embriones de dicho conducto (7);

de modo que los embriones recogidos se separan esencialmente del tejido embriogénico inmaduro.

El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 6, en el que:

i) el conducto (7) está colocado y dimensionado de forma tal que los embriones que son arrastrados dentro de la región axial de la pared inferior (6) durante la operación entran en el conducto (7) por sedimentación gravitacional.

El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que el medio recolector de embriones comprende medios de recolección de embriones del conducto (7) sin alterar sustancialmente el volumen de fluido en el contenedor.

9. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que

i) el dispositivo comprende medios de drenar fluido de dicho conducto (7), en el que durante la operación se

crea un vórtex colector en la región axial de la pared inferior (6); y

ii) el medio de recolección de embriones comprende medios de recolección de embriones del vórtex colector en el fluido drenado del conducto (7).

1.

11.

12.

13.

El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que el dispositivo está adaptado, para operar de forma discontinua y comprende además medios de recolección selectiva de embriones durante un periodo de tiempo tras la sedimentación de los embriones pero antes de que el tejido embriogénico inmaduro haya tenido tiempo de sedimentar.

El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-1, en el que el dispositivo comprende medios de drenar fluido de la región axial de la pared inferior (6) durante la operación, comprendiendo un conducto extendido desde arriba o en cualquier otra dirección hacia las proximidades de la región axial de la pared inferior (6).

El dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en el que los medios de introducción de embriones y tejido se localizan en una ubicación axial cerca de la superficie del fluido.

Un sistema para procesar embriones de plantas suspendidos en un fluido, que comprende un dispositivo separador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-12 y al menos uno de los siguientes:

a) una unidad dispersora (22) para dispersar los embriones y el tejido embriogénico suspendido en un fluido, localizado corriente arriba del dispositivo separador (23) y, opcionalmente, un biorreactor (2), como fuente de embriones, localizado corriente arriba de la unidad dispersora (22);

b) unidad de orientación y clasificación (25) para orientar y clasificar los embriones suspendidos en un fluido, localizado corriente abajo del dispositivo separador; y opcionalmente, un dispositivo de deposición,

localizado, preferentemente, corriente abajo de la unidad de orientación y clasificación.

Un sistema que comprende un dispositivo separador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6- 12; y

un dispositivo para depositar embriones vegetales suspendidos en fluido al tiempo que se mantiene la orientación del embrión, que comprende

i) un canal de flujo dimensionado de modo que los embriones puedan desplazarse con el fluido que fluye a través del canal pero que estén restringidos a desplazarse en una orientación de la primera corona o la última corona por restricciones dimensionales, emanando dicho canal de flujo a una salida (365);

ii) un receptor de embriones (34); y

l¡¡) medios de formar un chorro libre (37) de fluido que emana de la salida, en el que el chorro libre durante la operación se alinea con un receptor de embriones (34) lo cual permite depositar los embriones suspendidos en el fluido en el receptor de embriones (34);

en el que

los medios de formar un chorro libre comprenden una sección de canal de flujo (38) inmediatamente corriente arriba de la salida (365), teniendo una sección recta (37) con una longitud al menos igual a la dimensión interna transversal más grande del canal de flujo (38).