Señuelos de factores de transcripción,composiciones y métodos.

Un polinucleótido señuelo para uso en el tratamiento de infecciones bacterianas,

en el que el polinucleótido comprende un sitio de unión para un factor de transcripción y el sitio de unión no está unido operativamente a un gen.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2008/003353.

Solicitante: PROCARTA BIOSYSTEMS LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: NORWICH BIOINCUBATOR NORWICH RESEARCH PARK NORWICH NR4 7UH REINO UNIDO.

Inventor/es: MCARTHUR,MICHAEL.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/21 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/10 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/66 C12N 15/00 […] › Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C40B40/06 C […] › C40 TECNOLOGIA COMBINATORIA.C40B QUIMICA COMBINATORIA; BIBLIOTECAS, p. ej. QUIMIOTECAS (bibliotecas combinatorias in silico de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos G16B 35/00; química combinatoria in silico G16C 20/60). › C40B 40/00 Bibliotecas per se , p. ej. arrays, mezclas. › Bibliotecas que contienen nucleótidos o polinucleótidos, o sus derivados.

PDF original: ES-2389129_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Señuelos de factores de transcripción, composiciones y métodos

Campo de la invención

La invención proporciona métodos y composiciones para identificar secuencias reguladoras en cis. La invención también se refiere a métodos y composiciones para modular específicamente fenotipos celulares, tales como fenotipos procariotas, mediante la alteración de la asociación de factores de transcripción a elementos reguladores en cis in vivo con una alteración simultánea en el patrón de la expresión génica.

Antecedentes de la invención

La expresión génica es un determinante principal del fenotipo de una célula y, a su vez, las interacciones ADNproteína determinan en gran medida los patrones de la expresión génica. La modificación de la expresión génica para influir en el fenotipo es un objetivo principal de la biología y la medicina, ya sea en microbios industriales, modelos experimentales, patógenos o para abordar una enfermedad humana. En este contexto, las secuencias reguladoras en cis en el genoma, el componente de ADN de la maquinaria transcripcional, son dianas atractivas para intervenir. En comparación con abordar proteínas, el trabajo con el ADN es mucho más fácil: la secuenciación está muy automatizada y es relativamente económica, y el ADN puede manipularse fácilmente y amplificarse o sintetizarse fácilmente. Las terapias basadas en ADN también han surgido como una nueva clase excitante de agentes terapéuticos. En comparación con los compuestos farmacéuticos tradicionales, productos o moléculas pequeñas naturales, el ADN es un tipo atractivo de agente terapéutico ya que puede:

diseñarse por un proceso racional, lo más sencillamente examinando datos de secuencia; fabricarse de manera económica a escala, por síntesis química de oligonucleótidos o replicación biológica;

predecirse que tiene una toxicidad baja, ya que el ADN es un compuesto “natural” y no induce, en y por sí

mismo, típicamente respuestas inmunogénicas, y la especificidad puede controlarse por secuencia de la terapia basada en ADN;

reducir en gran medida el gasto de I+D, ya que todas las etapas del desarrollo de fármacos convencionales (identificación de diana, descubrimiento de compuesto líder, química médica) están truncadas.

Norris et al (Gene Therapy (2000) 7, p. 723-725 discuten el uso de un sistema de administración de un agente letal del bacteriófago PI para el tratamiento de tratamiento bacteriano resistente a múltiples fármacos.

El reto se convierte en cómo identificar los elementos reguladores en cis clave. Las tecnologías y experiencia que se han desarrollado en paralelo con los proyectos de secuenciación del genoma, tales como análisis de expresión génica paralela masiva usando micromatrices de ADN y el uso de bioinformática para registrar las bases de datos de los genomas, no son suficientes para identificar todos los elementos reguladores en cis ni para atribuir una función a los que ya se conocen. En 2003, el National Institute of Health en los EEUU lanzó el proyecto ENCODE para catalogar el 1% de los elementos reguladores en cis en el genoma humano (Science (2004) 306: 636-640; Nature (2007) 447: 799-816) y para desarrollar tecnologías de alto rendimiento como plataformas de descubrimiento. Los procedimientos desarrollados incluyeron el uso de inmunoprecipitación de cromatina, el sondeo de sensibilidad hipersensibilidad a digestión in vivo con ADNasaI (con micromatrices de ADN, PCR cuantitativa de alto rendimiento y bibliotecas genómicas) y el desarrollo de nuevos algoritmos para la detección bioinformática. Aunque estas técnicas tienen el potencial de acelerar mucho la velocidad de descubrimiento de elementos reguladores en cis, no darán lugar necesariamente a su caracterización funcional: el resultado del proyecto es un catálogo exhaustivo de estos elementos. Aun así, a partir de dicho trabajo, es probable que la especificidad de tejido de la mayoría de los elementos se conozca y su distancia de un gen y clasificación según qué tipo de factor que actúa en trans se une a ellos, esto no será suficiente para determinar cuál es la función biológica real del elemento. Una desventaja adicional común a todos estos procedimientos es que se basan en el genoma del organismo que se está secuenciando. Además, la estrategia usando hipersensibilidad a la digestión con ADNasaI tiene la desventaja adicional de que es específica para las células eucariotas, ya que, en este contexto, la ADNasaI es una sonda de la estructura de la cromatina y no existe una estructura comparable en los procariotas.

Además, hasta ahora no hay medios para cribar rápidamente un gran número de secuencias para secuencias reguladoras en cis potenciales.

Resumen de la invención

Los inventores abordaron estos problemas en la técnica proporcionando nuevos métodos para identificar y caracterizar secuencias reguladoras en cis tanto en organismos procariotas como eucariotas.

Una manera de identificar y caracterizar la función de elementos reguladores en cis individuales es usar señuelos de factores de transcripción (TFD) . Los oligonucleótidos señuelo se diseñan para mimetizar los sitios de unión de los factores de transcripción y evitar que estos últimos se unan a sus dianas genómicas afines, con una modificación consecuente de la expresión génica. Como tales, representan una herramienta sencilla y genérica para manipular las interacciones ADN-proteína que regulan genes específicos y que consecuentemente determinan los fenotipos. Su utilidad se ha demostrado principalmente en sistemas eucariotas, en los que un estímulo para su desarrollo ha sido su potencial para funcionar como nuevas clases de agentes terapéuticos (Mann y Dzau (2000) J. Clin. Investigation 106: 1071-1075) . Para este objetivo, se han usado oligonucleótidos señuelo para demostrar que el factor de transcripción EF2 reprime la proliferación de músculo liso en ratas (Morishita et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5855-5859) ; para bloquear la proliferación mediada por STAT3 de carcinomas (Leong et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 4138-4143) ; y para mostrar que el direccionamiento del elemento de respuesta AMPc puede controlar la proliferación del cáncer in vivo (Park et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 1573-1580) .

Sin embargo, no se ha desarrollado ningún sistema para usar TFD, a gran escala, que sea capaz de cuestionar cada aparición de una secuencia en un fragmento genómico o genoma completo. Tal y como está actualmente, esto requeriría la síntesis de grandes números de oligonucleótidos señuelo y un programa experimental costoso que implica su transfección y cribado para cambio fenotípico.

La invención descrita aquí aborda esta necesidad mediante el desarrollo de un sistema basado en una biblioteca portada en plásmidos capaz de ensayar sistemáticamente grandes números de secuencias para determinar si actúan en el genoma como reguladores en cis y asociarlas con un efecto fenotípico específico. Nos referimos a este

sistema en la presente memoria como “n[snare]”.

Además, una vez que se han encontrado las secuencias reguladoras en cis relevantes, estas secuencias pueden usarse para crear TFD que pueden usarse para modificar la expresión génica y obtener control sobre el fenotipo. Por varias razones, aunque los señuelos se desarrollaron para uso en células de mamíferos, son mucho más adecuados para uso en bacterias. Conseguir que los señuelos funcionen en eucariotas puede ser problemático ya que pueden degradarse rápidamente en el suero y extractos nucleares (Chu y Orgel (1992) Nucl. Acids. Res. 20: 5857-5858) , la captación celular del señuelo y su transición a través de la membrana nuclear puede ser ineficaz (Griesenbach et al. (2002) Gene Therapy 9: 1109-1115) y algunos tratamientos pueden desencadenar efectos no específicos o tóxicos. El uso de señuelos en procariotas debería evitar muchos de estos problemas y como tales podría demostrarse que son una herramienta eficaz para la identificación rápida de secuencias reguladoras que actúan en cis, tales como sitios de unión de factores de transcripción que controlan tanto genes específicos como redes reguladoras mayores. Una demostración exitosa de la estrategia fue el uso de un señuelo rico en AT para alterar la expresión de genes que responden a CO2 en Cyanobacterium (Onizuka et al. (2003) FEBS Lett. 542: 42-46) . En este sistema, los oligonucleótidos complementarios... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polinucleótido señuelo para uso en el tratamiento de infecciones bacterianas, en el que el polinucleótido comprende un sitio de unión para un factor de transcripción y el sitio de unión no está unido operativamente a un gen.

2. Un polinucleótido señuelo según la reivindicación 1, en el que el factor de transcripción es un regulador de la expresión de uno o más genes de resistencia a antibiótico en un procariota o eucariota.

3. Un polinucleótido señuelo según la reivindicación 2, en el que el uno o más genes resistentes a antibiótico son resistentes a un antibiótico seleccionado de uno o más: los aminoglicósidos; los carbapenemos; las cefalosporinas; los glicopéptidos; las penicilinas; los antibióticos polipeptídicos; las quinolinas; las sulfonamidas; o las tetraciclinas.

4. Un polinucleótido señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tratamiento de la infección bacteriana comprende el uso de uno o más antibióticos.

5. Un polinucleótido señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la infección bacteriana es:

(a) una bacteria gram positiva de un género seleccionado de: Actinomyces; Streptomyces; Mycobacteria; Clostridium; Bacillus; Listeria; Staphylococcus; Streptococcus; Enterococcus;

o

(b) una bacteria gram negativa de un género seleccionado de: Enterobacteriaceae; Pseudomonas; Moraxella; Helicobacter; Stenotrophomonas; Bdellovibio, bacterias de ácido acético; Legionella; Cyanobacteria; Spirochaetes; Bacterias verdes del azufre; y Bacterias verdes no del azufre,

preferiblemente la infección bacteriana es un patógeno seleccionado de: Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium bovis; Mycobacterium africanum; Mycobacterium microti; Mycobacterium leprae; Clostridium difficile; Clostridium botulinum; Clostridium perfingens; Clostridium tetani; Salmonella sp.; Escherichia coli; Enterococcus faecium; Enterococcus faecalis; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria meningitides; Moraxella catarrhalis; Hemophilus influenza; Kebsiella pneumoniae; Legionella penumophila; Pseudomonas aeruginosa; Proteus mirabilis; Enterobacter cloacae; Serratia marcescens; Helicobacter pylori; Salmonella enteritidis; y Salmonella typhi.

6. Un polinucleótido señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la infección bacteriana es un patógeno resistente a vancomicina o un modelo no patogénico de resistencia a vancomicina.

7. Un polinucleótido señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polinucleótido señuelo comprende: ADN bicatenario circular o un oligonucleótido lineal, preferiblemente una estructura en forma de mancuerna circular; y/o al menos un elemento de estructura secundaria; y/o más de una copia del sitio de unión del factor de transcripción; y/o secuencia adicional al sitio o sitios de unión; y/o bases o azúcares modificados para incrementar la resistencia a nucleasas del polinucleótido; y/o un plásmido o biblioteca de plásmidos.

8. Un polinucleótido señuelo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sitio de unión del factor de transcripción en el polinucleótido señuelo comprende la secuencia de SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 26.

aCuando se han descrito sistemas de eflujo en artículos previos de revisión, éstos se resaltan aquí, de otra manera se citan los artículos originales. bEste sistema de eflujo multifármaco se identificó originalmente como el exportador de cloranfenicol Cmr/CmIA. cCepas mutantes de P. aeruginosa que sobreexpresan MexEF-OprN se seleccionan fácilmente in vitro usando cloranfenicol.78-80 dCuando se ensayaron, los sistemas de eflujo tipo RND que estimulan resistencia a cloranfenicol también estimulan resistencia a florfenicol (por ejemplo, AcrAB-TolC75 y AcrEF-TolC86 en S. enterica serovar Thyphimurium) . eEl eflujo se ha demostrado aunque no se ha identificado un sistema de eflujo. fEl gen o genes de eflujo no se han identificado aunque se ha confirmado su movilidad. gCepas mutantes de P. aeruginosa que sobreexpresan MexCD-OprJ pueden seleccionarse in vitro usando eritromicina (Poole, resultados no publicados) . hLa exportación de macrólidos, lincosamidas y estreptograminas por sistemas de eflujo multifármaco de tipo RND de tres componentes puede explicar la falta de susceptibilidad de muchas bacterias Gram-negativas a estos agentes. i Cepas mutantes de P. aeruginosa que sobreproducen MexAB-OprM pueden seleccionarse in vitro usando tetraciclina. 78, 132, 133 jAsociado con resistencia a ampicilina en cepas clínicas. 331 kImplicado en resistencia a meropenem322 y ticarcilina323, 324 en aislados clínicos. lAunque muchos sistemas de eflujo multifármaco de tipo RND se adaptan a -lactamas (véase el texto) , pocos están implicados como determinantes principales de resistencia, en aislados de laboratorio o clínicos. mEl gen clonado estimula incrementos muy modestos en MIC para el antimicrobiano indicado. nMuestran una contribución modesta a la resistencia intrínseca a aminoglicósido y sólo se observa en medios con baja fuerza iónica.

aExcluyendo la familia MATE de exportadores multifármaco. bNOR, norfloxacina; CIP, ciprofloxacina; MOX, moxifloxacina; GAT, gatifloxacina; SPR, esparfloxacina; OFL, ofloxacina; NAL, ácido nalidíxico; FQ, fluoroquinolonas cResistencia mediada por eflujo observada pero el determinante específico no se ha indentificado; no NorA. d Resistencia mediada por eflujo observada pero el determinante específico no se ha indentificado; no PmrA. e Resistencia mediada por eflujo observada pero el determinante específico no se ha indentificado. fSistema de eflujo de tipo ABC asociado a la membrana citoplásmica ensamblado de 2 subunidades. g Sistema de eflujo de tipo ABC asociado a la membrana citoplásmica ensamblado de 3 subunidades. h Se adapta a fluoroquinolonas aunque no hay indicaciones de fluoroquinolonas seleccionando mutantes que sobreproducen MexXY in vitro o in vivo. iCodifica un componente ABC-MFP de un probable sistema de exportación multifármaco ABC-MFP-OMF.


 

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