Selección y aislamiento de células vivas usando sondas que se unen a ARNm.

Un método para generar líneas celulares que expresan un primer ARN de interés,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar células vivas que se sospecha que expresan dicho primer ARN de interés;

(b) exponer dichas células vivas a una primera baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho primerARN de interés;

(c) detectar las células que presentan fluorescencia de dicha primera baliza molecular;

(d) aislar dichas células detectadas que fluorescen; y

(e) generar líneas celulares a partir de las células aisladas.

Selección y aislamiento de células vivas usando sondas que se unen a ARNm

Antecedentes de la invención Una baliza molecular es una sonda de ácido nucleico que reconoce e informa de la presencia de una secuencia de ácido nucleico específica. Las sondas son secuencias con forma de horquilla con una cadena central de nucleótidos complementaria a la secuencia diana y extremos que comprenden secuencias cortas mutuamente complementarias. Un extremo está unido covalentemente a un fluoróforo y el otro a una resto apantallador. Cuando está en su estado nativo con los extremos hibridados, la proximidad del fluoróforo y el apantallador es tal que no se produce fluorescencia. La baliza experimenta un cambio conformacional fluorogénico espontáneo cuando hibrida con su ácido nucleico diana. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. 5.925.517.

Esta propiedad ha permitido a los investigadores detectar ácidos nucleicos específicos principalmente en reacciones in vitro y, en algunos casos, incluso en células vivas. La visualización in situ de ARN mensajero se ha conseguido usando balizas moleculares administradas a células vivas en liposomas (Matsuo, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1379: 178-184) .

Además, se ha discutido la detección en tiempo real de la hibridación ADN/ARN en células vivas usando balizas moleculares (Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 11538-11543 (1998) ) .

Los estudios que implican células han empleado, hasta la fecha, balizas generadas con el fluoróforo muy débil EDANS ya que éste era el único conocido que se apantallaba por el apantallador EDAC. Los resultados aunque discernibles apenas lo son y la aplicabilidad de esta línea de investigación para la detección in vivo no fue prometedora.

Resumen de la invención La presente invención proporciona particularmente un método para generar líneas celulares que expresan un primer ARN de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar células vivas que se sospecha que expresan dicho primer ARN de interés;

(b) exponer dichas células vivas a una primera baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho primer ARN de interés;

(c) detectar las células que presentan fluorescencia de dicha primera baliza molecular;

(d) aislar dichas células detectadas que fluorescen; y

(e) generar líneas celulares a partir de las células aisladas, así como un método para aislar células vivas que expresan al menos dos ARN de interés, que comprende las etapas de:

(a) introducir en células vivas ADN que codifica un primer ARN de interés y ADN que codifica un segundo ARN de interés;

(b) exponer dichas células vivas a una primera baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho primer ARN de interés;

(c) exponer dichas células vivas a una segunda baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho segundo ARN de interés;

(d) detectar las células que presentan fluorescencia de ambas dicha primera baliza molecular y dicha segunda baliza molecular; y

(e) aislar dichas células detectadas que fluorescen.

Además, también se describe un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con al menos una construcción de ADN que codifica al menos una proteína preseleccionada y al menos un marcador de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco frente al que dicho marcador confiere resistencia, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células seleccionadas a una primera baliza molecular que fluoresce después de hibridar con un transcrito de ARN de la al menos una proteína preseleccionada;

d) aislar las células que fluorescen;

e) generar una línea celular que expresa la al menos una proteína preseleccionada creciendo las células aisladas.

El método mencionado anteriormente puede llevarse a cabo usando tecnología de separación de células activada por fluorescencia. En un aspecto adicional, la línea celular puede prepararse para expresar una segunda proteína preseleccionada llevando a cabo etapas adicionales incluyendo transfectar la línea celular con una segunda construcción de ADN que codifica una segunda proteína preseleccionada y un segundo marcador de resistencia a fármacos; seleccionar las células que expresan el segundo marcador; exponer las células a una segunda baliza molecular que fluoresce después de hibridar con un transcrito de ARN de la segunda proteína preseleccionada y aislar las células que presentan fluorescencia de cada uno de los al menos uno y el segundo transcritos de ARNm. Las líneas celulares que expresan más de dos proteínas pueden proporcionarse repitiendo las etapas. El método para introducir la segunda proteína puede realizarse bien simultáneamente o secuencialmente. Si el primer y segundo marcadores de resistencia a fármacos son los mismos, la selección simultánea puede conseguirse incrementando el nivel del fármaco.

En la presente memoria también se describe un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con al menos una construcción de ADN que codifica la al menos una proteína preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y al menos una primera etiqueta de epítopo;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco frente al que dicho marcador confiere resistencia, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células a una primera baliza molecular que fluoresce después de hibridar con el transcrito de ARN de la primera etiqueta de epítopo;

d) aislar las células que fluorescen; y

e) generar una línea celular que expresa la al menos una proteína preseleccionada creciendo las células aisladas.

El método mencionado anteriormente puede llevarse a cabo usando tecnología de separación de células activada por fluorescencia. La parte de ADN de la construcción que codifica la etiqueta de epítopo puede estar en marco o fuera de marco con la parte de la construcción de ADN que codifica la al menos una proteína. En una realización adicional, la línea celular puede prepararse para expresar al menos una segunda proteína preseleccionada; incluyendo además las etapas transfectar la línea celular con una segunda construcción de ADN que codifica la segunda proteína preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos y una segunda etiqueta de epítopo, seleccionar las células que transcriben el segundo marcador; exponer las células a una segunda baliza molecular que fluoresce después de hibridar con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta de epítopo y aislar las células que presentan fluorescencia de cada una de la primera y la segunda etiqueta de epítopo. En el caso de dos proteínas, la parte de la secuencia de ADN que codifica la segunda etiqueta de epítopo también puede estar en marco o fuera de marco con la parte de la secuencia de ADN que codifica la segunda proteína. La segunda proteína preseleccionada puede transfectarse bien simultáneamente o secuencialmente con la primera. Si el método se realiza simultáneamente, y se usa el mismo marcador de resistencia a fármacos para ambas construcciones, puede usarse un nivel más alto de fármaco para seleccionar las células que expresan ambas construcciones. Además, pueden proporcionarse más de dos proteínas en la línea celular repitiendo las etapas mencionadas anteriormente.

En la presente memoria se describe además un método para generar una línea celular que expresa una molécula de ARN antisentido preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con una construcción de ADN que codifica la al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada y al menos un gen de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco frente al que dicho marcador confiere resistencia, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células a una baliza molecular que fluoresce después de hibridar con la molécula de ARN antisentido;

d) aislar las células que fluorescen; y

e) generar una línea celular que expresa la secuencia de ARN antisentido preseleccionada creciendo las células aisladas.

El aislamiento de las células que fluorescen puede llevarse a cabo usando tecnología de separación de células activada por fluorescencia. La línea celular puede prepararse... [Seguir leyendo]

1. Un método para generar líneas celulares que expresan un primer ARN de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar células vivas que se sospecha que expresan dicho primer ARN de interés;

(b) exponer dichas células vivas a una primera baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho primer ARN de interés;

(c) detectar las células que presentan fluorescencia de dicha primera baliza molecular;

(d) aislar dichas células detectadas que fluorescen; y

(e) generar líneas celulares a partir de las células aisladas.

2. Un método para aislar células vivas que expresan al menos dos ARN de interés, que comprende las etapas de:

(a) introducir en células vivas ADN que codifica un primer ARN de interés y ADN que codifica un segundo ARN de interés;

(b) exponer dichas células vivas a una primera baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho primer ARN de interés;

(c) exponer dichas células vivas a una segunda baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho segundo ARN de interés;

(d) detectar las células que presentan fluorescencia de ambas dicha primera baliza molecular y dicha segunda baliza molecular; y

(e) aislar dichas células detectadas que fluorescen.

3. El método de la reivindicación 1, en el que se sospecha que dichas células vivas expresan un segundo ARN de interés y en el que dicho método comprende además las etapas de:

(f) exponer dichas células vivas a una segunda baliza molecular que fluoresce después de hibridar con dicho segundo ARN de interés; y

(g) detectar las células que presentan fluorescencia de dicha segunda baliza molecular.

4. El método de la reivindicación 2, en el que las etapas de introducir el ADN en las células vivas, exponer las células vivas a una baliza molecular y detectar las células que fluorescen se realizan bien simultáneamente o secuencialmente para el primer y segundo ARN de interés.

5. El método de la reivindicación 3, en el que cualquiera de las etapas de exponer las células vivas a una baliza molecular y detectar las células que fluorescen se realizan bien simultáneamente o secuencialmente para el primer y segundo ARN de interés.

6. El método de la reivindicación 2 ó 3, en el que la primera y segunda balizas moleculares comprenden diferentes fluoróforos.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 5, en el que cualquiera de dichos ARN de interés se expresan a partir de un gen endógeno.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que cualquiera de dichos ARN de interés se seleccionan del grupo que consiste en ARN estructurales, ARN antisentido, ARNr, ARNhn, ARNsn y ARNm.

9. El método de la reivindicación 8, en el que cualquiera de dichos ARN de interés codifican una proteína de la superficie celular.

10. El método de la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho primer ARN de interés y dicho segundo ARN de interés, o las proteínas codificadas por dichos ARN, están implicados en la formación de un complejo.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además las etapas de cuantificar el nivel de fluorescencia de cualquiera de dichas balizas moleculares y correlacionar el nivel de fluorescencia con el nivel del ARN de interés con el que hibrida la baliza molecular.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que dicha fluorescencia se detecta por microscopía de fluorescencia o tecnología de separación de células activada por fluorescencia.

13. El método de la reivindicación 2, que comprende además generar una línea celular a partir de las células aisladas.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que las células vivas aisladas son células madre embrionarias, con la condición de que se excluyen las células madre que derivan de células madre embrionarias humanas obtenidas exclusivamente por un método que necesita la destrucción de un embrión.

15. Un método para generar un animal transgénico no humano que expresa al menos un primer ARN de interés, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar las células madre embrionarias aisladas en la reivindicación 14, y

(b) usar las células madre embrionarias para producir dicho animal transgénico no humano.