Secuencias de nucleótidos que codifican el gen metY.

Un procedimiento para la preparación de L-metionina, que comprende llevar a cabo las siguientes etapas:



a) fermentación de bacterias corineformes que producen dicha L-metionina y en las que por lo menos laexpresión del gen metY que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido que esidéntico por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 y tiene la actividad de laO-acetil-homoserina sulfhidrilasa, es intensificada recombinantemente por aumento del número de copias delgen o por uso de un potente promotor en un medio,

b) concentración de dicha L-metionina en el medio o en las células de las bacterias; y

c) aislamiento de dicha L-metionina

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09160843.

Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11 45128 ESSEN ALEMANIA.

Inventor/es: BINDER, MICHAEL, GREISSINGER, DIETER, PFEFFERLE, WALTER, HUTHMACHER, KLAUS, DR., THIERBACH, GEORG, KALINOWSKI, JORN, DR., PUHLER, ALFRED, PROF., RUCKERT,CHRISTIAN, HÄDRICH,BETTINA DR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/88 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Liasas (4.).
  • C12P13/08 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
  • C12P13/12 C12P 13/00 […] › Metionina; Cisteína; Cistina.

PDF original: ES-2395747_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Secuencias de nucleótidos que codifican el gen metY

Campo del invento La descripción proporciona unas secuencias de nucleótidos procedentes de bacterias corineformes, que codifican el 5 gen metY. El invento proporciona un procedimiento para la preparación por fermentación de L-metionina, usando bacterias corineformes en las que se ha intensificado por lo menos el gen metY.

Técnica anterior

Ciertos L-aminoácidos, en particular la L-lisina y la L-metionina, se usan en la medicina humana y en la industria de los productos farmacéuticos, en la industria de los alimentos y muy particularmente en la nutrición de animales.

Es conocido que se preparan aminoácidos por fermentación a partir de cepas de bacterias corineformes, en particular Cor y nebacterium glutamicum. A causa de su gran importancia, se están emprendiendo constantemente trabajos para mejorar los procedimientos de preparación. Los mejoramientos en el procedimiento pueden relacionarse con medidas técnicas de fermentación, tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o con la composición de los medios nutrientes, tales como, por ejemplo, la concentración de azúcares durante la fermentación, o con la elaboración para dar la forma del producto mediante, por ejemplo, una cromatografía con intercambio de iones, o con las propiedades de rendimiento intrínseco del microorganismo propiamente dicho.

Se usan unos métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Se obtienen de esta manera unas cepas que son resistentes a antimetabolitos o son auxótrofas para unos metabolitos que tienen importancia reguladora y producen aminoácidos.

Se han empleado también durante algunos años unos métodos de la técnica de ADN recombinante para mejorar las cepas de unas cepas de Cor y nebacterium que producen L-aminoácidos, por amplificación de genes individuales para la biosíntesis de aminoácidos e investigar el efecto sobre la producción de aminoácidos.

Yamagata, en Biochimie, volumen 71, 1989, 1125-1143 describen el gen de MetY, y su importancia primordial en la ruta de la síntesis de metionina en el seno p.ej. de C. glutamicum.

El documento de solicitud de patente internacional WO93/17112A describe el procedimiento para la producción por fermentación de L-metionina, estando basado este método en la transformación de una Cor y nebacterium glutamicum con un vector de expresión que comprende genes implicados en la ruta de biosíntesis de la L-metionina, tal como el gen metE, así como la secuencia que codifica el gen metA o la secuencia que codifica la O-acetilhomoserina (tiol) -liasa que puede ser transfectada concomitantemente junto con la secuencia que codifica el gen metE.

Objetivo del invento Los autores del invento tenían el objetivo de proporcionar nuevas medidas técnicas para la preparación por fermentación mejorada de L-metionina.

Sumario del invento Cuando se mencionan en lo sucesivo L-aminoácidos o aminoácidos, este concepto significa uno o más aminoácidos, inclusive sus sales, que se escogen entre el conjunto que consiste en L-asparagina, L-treonina, L-serina, Lglutamato, L-glicina, L-alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, Lhistidina, L-lisina, L-triptófano y L-arginina.

Cuando se mencionan en lo sucesivo L-lisina o lisina, se entienden por este concepto no solamente las bases sino 40 también las sales, tales como p.ej. el monohidrocloruro de lisina o el sulfato de lisina.

Cuando se mencionan en lo sucesivo L-metionina o metionina, se entienden también por este concepto las sales, tales como p.ej. el hidrocloruro de metionina o el sulfato de metionina.

La descripción proporciona un polinucleótido aislado proceden mejorada te de bacterias corineformes, que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el gen metY, escogido entre el conjunto que consiste en

a) un polinucleótido que es idéntico en el grado de por lo menos un 70 % a un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en el grado de por lo menos un 70 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2,

c) un polinucleótido que es complementario con los polinucleótidos de a) o b) y

d) un polinucleótido que comprende por lo menos 15 nucleótidos sucesivos de la secuencia de polinucleótido de a) , b) o c) ,

teniendo el polipéptido preferiblemente la actividad de la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa.

La descripción proporciona también el polinucleótido antes mencionado, siendo éste preferiblemente un ADN que es 10 capaz de replicación, que comprende:

(i) la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID No. 1, o

(ii) por lo menos una secuencia que corresponde a la secuencia (i) dentro del alcance de la degeneración del código genético, o

(iii) por lo menos una secuencia que se hibrida con la secuencia complementaria con la secuencia (i) o (ii) , y 15 opcionalmente

(iv) unas mutaciones de sentido con función neutra en (i) .

La descripción proporciona también

un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID No. 1;

un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en 20 SEQ ID No. 2;

un vector que contiene la secuencia de ADN de C. glutamicum que codifica el gen metY, depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en Cor y nebacterium glutamicum como pCREmetY el 21.06.2000 bajo la referencia DSM 13556

y bacterias corineformes en las que el gen metY está presente en una forma intensificada, en particular por el vector pCREmetY.

La descripción proporciona también unos polinucleótidos que comprenden sustancialmente una secuencia de polinucleótido, los cuales son obtenibles por escrutinio mediante una hibridación de una correspondiente biblioteca de genes (genoteca) de una bacteria corineforme, que comprende el gen completo o partes del mismo, con una sonda que comprende la secuencia del polinucleótido de acuerdo con el invento, de acuerdo con la SEQ ID No. 1; o un fragmento de la misma y el aislamiento de la secuencia de polinucleótido mencionada.

Descripción detallada del invento Los polinucleótidos que comprenden las secuencias de acuerdo con la descripción son apropiados como sondas de hibridación para ARN, ADNc y ADN, con el fin de aislar, en su plena longitud, ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que codifican la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa o de aislar los ácidos nucleicos o polinucleótidos o genes que tienen una alta similaridad de secuencia con la de la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa.

Los polinucleótidos que comprenden las secuencias de acuerdo con la descripción son además apropiados como unos cebadores, con ayuda de los cuales se pueden preparar los ADN de genes que codifican la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, acrónimo de polymerase chain reaction) .

Dichos oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores comprenden por lo menos 30, de manera preferible 45 por lo menos 20, de manera muy particularmente preferible por lo menos 15 nucleótidos sucesivos. Son apropiados también unos oligonucleótidos que tienen una longitud de por lo menos 40 o 50 nucleótidos. Opcionalmente son también apropiados unos oligonucleótidos con una longitud de por lo menos 100, 150, 200, 250 o 300 nucleótidos.

El concepto de “aislado” significa separado con respecto de su entorno natural.

El concepto de “polinucleótido” se refiere en general a polirribonucleótidos y polidesoxirribonucleótidos, siendo posible que éstos sean unos ARN o ADN no modificados o unos ARN o ADN modificados.

Los polinucleótidos de acuerdo con la descripción incluyen un polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID No. 1 o un fragmento preparado a partir del mismo y también los que son idénticos en por lo menos un 70 %, de manera preferible en por lo menos un 80 % y en particular por lo menos en un 90 % hasta un 95 % al polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID No. 1 o a un fragmento preparado a partir del mismo.

Se entiende que el concepto de “polipéptidos” significa los péptidos o las proteínas que comprenden dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos.

Los polipéptidos de acuerdo con la descripción incluyen un polipéptido de acuerdo con la SEQ ID No. 2, en particular los que tienen... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

REIVINDICACIONES?

1. Un procedimiento para la preparación de L-metionina, que comprende llevar a cabo las siguientes etapas:

a) fermentación de bacterias corineformes que producen dicha L-metionina y en las que por lo menos la expresión del gen metY que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido que es idéntico por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 y tiene la actividad de la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa, es intensificada recombinantemente por aumento del número de copias del gen o por uso de un potente promotor en un medio,

b) concentración de dicha L-metionina en el medio o en las células de las bacterias; y

c) aislamiento de dicha L-metionina.

2. Un procedimiento para la preparación de un aditivo para piensos de animales que contiene L-metionina, que comprende las etapas de:

a) fermentar bacterias corineformes que producen dicha L-metionina y en las que por lo menos la expresión del gen metY que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido que es idéntico por lo menos en un 90 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 y tiene la actividad de la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa, es intensificada recombinantemente por aumento del número de copias del gen o por uso de un potente promotor en un medio, para obtener un caldo de fermentación que contiene L-metionina;

b) eliminar una proporción de 0 a 100 % en peso de la biomasa formada durante la fermentación; y

c) concentrar el caldo que contiene L-metionina obtenido en la etapa b) ; y

d) secar el caldo obtenido de acuerdo con c) para obtener el aditivo paraa piensos de animales en la deseada forma de polvo o de gránulos.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que se emplea una bacteria corineforme transformada con un vector, y el vector lleva un gen metY que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en por lo menos un 90 % a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2 y tiene la actividad de la O-acetil-homoserina sulfhidrilasa y opcionalmente de manera adicional el gen metA.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al mismo tiempo se intensifica la expresión de uno o más de los genes escogidos entre el conjunto que consiste en

4.1 el gen gap que codifica la glicerol-aldehído 3-fosfato deshidrogenasa,

4.2 el gen tpi que codifica la triosa fosfato isomerasa,

4.3 el gen pgk que codifica la 3-fosfoglicerato cinasa,

4.4 el gen pyc que codifica la piruvato carboxilasa,

4.5 el gen lysC que codifica una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación,

4.6 el gen metA que codifica la homoserina O-acetil-transferasa,

4.7 el gen metB que codifica la cistationina gamma-sintasa,

4.8 el gen aecD que codifica la cistationina gamma-liasa, y

4.9 el gen glyA que codifica la serina hidroximetil-transferasa.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3 en el que se atenúa (n) uno o más gen (es) escogido (s) entre el conjunto que consiste en

5.1 el gen pck que codifica la fosfoenol piruvato carboxicinasa,

5.2 el gen pgi que codifica la glucosa 6-fosfato isomerasa,

5.3 el gen poxB que codifica la piruvato oxidasa,

5.4 el gen thrB que codifica la homoserina cinasa,

5.5 el gen ilvA que codifica la treonina deshidratasa,

5.6 el gen thrC que codifica la treonina sintasa, y

5.7 el gen ddh que codifica la meso-diamino pimelato D-deshidrogenasa.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, en el que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre el conjunto que consiste en a) la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1, o 10 b) por lo menos una secuencia que corresponde a la secuencia a) dentro del alcance de la degeneración del código genético, o c) por lo menos una secuencia que se hibrida con la secuencia que es complementaria con respecto a la secuencia a) o b) con una concentración de la sal de 2XSSC y con una temperatura de 50 a 68ºC,

y opcionalmente 15 d) unas mutaciones de sentido de función neutra en a) .

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha secuencia de nucleótidos comprende los nucleótidos 200 a 1. (10de SEQ ID No. 1.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8, en el que dicha bacteria corineforme es del género Cor y nebacterium.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha Cor y nebacterium es de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicha Cor y nebacterium glutamicum es la cepa DSM5715/pCREmetY depositada bajo el DSM13556 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Alemania) .

Figura 1: Plásmido pCREmetY Figura 2: Plásmido pCREmetAY


 

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