Secuencias genéticas de flavonoide 3'',5''-hidroxilasa y usos de las mismas.

Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o escomplementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3'5' hidroxilasa (F3'5'H),

donde la secuenciade nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 32 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menosaproximadamente el 80% de identidad con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadade la lista que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 32, donde laexpresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado nivelesdetectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina según se mide mediante una técnicacromatográfica.

Secuencias genéticas de flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se relaciona en general con una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa (F3’5’H) y con el uso de la secuencia genética y/o sus correspondientes polipéptidos entre otros para manipular el color en las flores o partes de las mismas o en otros tejidos de plantas. Más particularmente, el F3’5’H tiene la capacidad de modular el metabolismo del dihidrocanferol (DHK) así como el metabolismo de otros sustratos tales como dihidroquercetina (DHQ) , naringenina y eriodictol. Aún más particularmente, la presente invención proporciona una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de F3’5’H cuando se expresa en tejido de pétalos de rosas. La presente invención se refiere además a moléculas antisentido y sentido o moléculas inductoras de iARN que corresponden a todo o parte de las secuencias genéticas objetivo o un transcrito de la misma así como a plantas genéticamente modificadas así como flores para corte, partes y tejido reproductivo de tales plantas. También se discuten promotores que operan eficientemente en plantas tales como rosa, gerbera o plantas relacionadas botánicamente.

Descripción de la técnica anterior

La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en ningún país.

Los detalles bibliográficos de referencias previstas en la especificación tratada aparecen como una lista al final de la especificación.

La industria de las flores o las plantas ornamentales procura desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una manera efectiva de crear tales variedades novedosas es a través de la manipulación del color de las flores. Las técnicas de cruzamiento clásicas han sido utilizadas con algún éxito para producir un amplio rango de colores de casi todas las variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles hoy. Esta metodología ha estado limitada, sin embargo, por las restricciones de la reserva genética particular de la especie y por esta razón es raro que una especie individual tenga un espectro completo de variedades coloreadas. Por ejemplo, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de plantas o partes de plantas tales como flores, follaje y tallos ofrecería una oportunidad significativa tanto los mercados de flores cortadas como ornamentales. En la industria de las flores o plantas ornamentales, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de especies principales con inflorescencia tales como rosa, crisantemo, tulipán, lirio, claveles, gerbera, orquídea, lisianthus, begonia, torenia, geranio, petunia, nierembergia, pelargonio, iris, impatiens y ciclamen sería de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa o gerbera azul para el mercado de las cortadas.

Además, el desarrollo de novedosas variedades coloreadas de plantas tales como vegetales, frutos y semillas ofrecería oportunidades significativas en la agricultura. Por ejemplo, semillas novedosas coloreadas serían útiles como marcas de propiedad para plantas. Modificaciones adicionales a flavonoides comunes a bayas o frutas incluyendo uvas y manzanas y sus jugos incluyendo el vino tendrían el potencial de impartir características de estilo modificadas de valor a tales frutas e industrias de subproductos.

El color de las flores predominantemente debido a tres tipos de pigmentos: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y contribuyen a un amplio rango de colores desde amarillo hasta rojo hasta azul. Las moléculas de flavonoides que hacen la principal contribución al color de las flores son las antocianinas, las cuales son derivadas glicosilados de cianidina y su derivado peonidina metilado, moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas están localizadas en las vacuolas de las células epidérmicas de los pétalos o en las vacuolas de las células subepidérmicas de las hojas.

Los pigmentos flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética de los pigmentos flavonoides (ruta de los flavonoides) está bien establecida, (Holton y Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995; Mol et al., Trends Plant Sci. 3: 212-217, 1998; Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a; and Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b) y se muestra en las Figuras 1A y B. Estas reacciones y enzimas están involucradas en la conversión de la fenilalanina a p-cumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos claves en la ruta de los flavonoides. Las enzimas son fenilalanina amonio-liasa (PAL) , cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4cumarato: CoA ligasa (4CL) . La primera etapa comprometida en la ruta involucra la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (provista por la acción de la acetil COA carboxilasa (ACC) sobre acetil CoA y CO2) con una molécula de p-cumaroil-CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima chalcona sintasa (CHS) . El producto de esta relación, la 2’, 4, 4’, 6’, tetrahidroxi-chalcona, normalmente se isomeriza de manera muy rápida debido a la enzima chalcona flavanona isomerasa (CHI) para producir naringenina. La naringenina se hidroxila posteriormente en la posición 3 del anillo central por la flavanona 3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocampferol (DHK) .

El patrón de hidroxilación del anillo B del dihidrocampferol (DHK) juega un papel clave en la determinación del color de los pétalos. El anillo B puede ser hidroxilado o bien en las posiciones 3’, o bien en las posiciones tanto 3’ como 5’, para producir dihidroquercetina (DHQ) o dihidromiricetina (DHM) , respectivamente. Las dos enzimas clave involucradas en esta parte de la ruta son la 3’-hidroxilasa y flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa, ambos de la clase de citocromo P450 de las enzimas. Las enzimas citocromo P450 tienen amplia distribución en la naturaleza y se han aislado y secuenciado genes a partir de vertebrados, insectos, levaduras, hongos, bacterias y plantas.

La flavonoide 3’-hidroxilasa (F3’H) es una enzima clave en la ruta de los flavonoides que lleva a los pigmentos basados en cianidina los cuales, en muchas especies vegetales (por ejemplo Rosa spp., Dianthus spp., Petunia spp., begonia, ciclamen, impatiens, gloria de la mañana y crisantemo) contribuyen al color rojo y rosa de las flores.

La flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa (F3’5’H) es una enzima clave en la ruta de flavonoides que lleva a los pigmentos basados en delfinidina los cuales, en muchas especies de plantas (por ejemplo, Petunia spp, Viola spp., Lisianthus spp., Gentiana spp., Sollya spp., Salvia spp., Clitoria spp., Kennedia spp., Campanula spp., Lavandula spp., Verbena spp., Torenia spp., Delphinium spp., Solanum spp., Cineraria spp., Vitis spp., Babiana stricta, Pinus spp., Picea spp., Larix spp., Phaseolus spp., Vaccinium spp., Cyclamen spp., Iris spp., Pelargonium sp., Liparieae, Geranium spp., Pisum spp., Lathyrus spp., Catharanthus spp., Malvia spp., Mucuna spp., Vicia spp., Saintpaulia spp., Lagerstroemia spp., bouchina spp., Plumbago spp., Hypocalyptus spp., Rhododendron spp., Linum spp., Macroptilium spp., Hibiscus spp., Hydrangea spp., Cymbidium spp., Millettia spp., Hedysarum spp., Lespedeza spp., Asparagus spp. Antigonon spp., Pisum spp., Freesia spp., Brunella spp., Clarkia spp., etc.) contribuyen al color púrpura y azul en las flores. Muchas especies tales como rosas, gerberas, crisantemos y claveles no producen pigmentos basados en delfinidina porque carecen de una actividad de F3’5’H.

La siguiente etapa en la ruta, que lleva a la producción de las antocianinas coloreadas a partir de los dihidroflovonoides (DHK, DHK, DHM) involucra la dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) que lleva a la producción de las leucoantocianidinas. Las leucoantocianidinas se convierten posteriormente en antocianidinas, pelargonidina, cianidina y delfinidina o moléculas basadas en delfinidina. Estas moléculas de flavonoide son inestables en condiciones fisiológicas normales y la glicosilación en la posición 3, a través de la acción de las glicosiltransferasas, estabiliza la molécula de antocianidina permitiendo así la acumulación de las antocianinas. En general, las glicosiltransferasas transfieren las unidades estructurales de azúcar desde los azucares UDP hacia las moléculas de flavonoide... [Seguir leyendo]

1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3’5’ hidroxilasa (F3’5’H) , donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 32 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 32, donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina según se mide mediante una técnica cromatográfica.

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 31 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 31 o una secuencia de nucleótidos capaz hibridarse a al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionada de la lista que consiste en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 31 o una forma complementaria de las mismas en condiciones de alta rigurosidad.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 ó 2, derivándose la molécula de ácido nucleico de una planta seleccionada de Viola spp, Sollya spp y Lavandula spp.

4. Constructo que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende: (i) un promotor que es operable en tejidos de pétalos de rosa y donde dicho promotor está enlazado de manera operable a; (ii) una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, preferiblemente donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en CHS de rosa, CHS de crisantemo y CaMV 35S, preferiblemente de manera adicional donde dicho promotor comprende SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:30.

5. Método para producir una planta transgénica capaz de sintetizar una F3’5’H, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta con una secuencia de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y hacer crecer dicha planta transgénica o su progenie durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico.

6. Método para producir una planta transgénica que presenta propiedades de inflorescencia alteradas, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y hacer crecer dicha planta transgénica o su progenie durante un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico.

7. Método según la reivindicación 5 ó 6, donde la molécula de ácido nucleico se deriva de Viola spp o Lavandula spp.

8. Planta o parte de la misma o células de la misma genéticamente modificada que comprende una molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, preferiblemente donde la planta o parte de la misma o células de la misma genéticamente modificada presentan flores o inflorescencias alteradas, preferiblemente de manera adicional donde la parte de la planta se selecciona del grupo que comprende sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovarios, anteras, flores, frutos, nueces, raíces, tallos, hojas y semillas.

9. Uso de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la fabricación de: (i) un constructo genético capaz de expresar F3’5’H en una planta de rosa, o (ii) una planta de rosa o parte de la misma o células de la misma genéticamente modificada.

10. Extracto de las flores de una planta o parte de la misma o células de la misma genéticamente modificada según la reivindicación 8 ó 9, preferiblemente siendo el extracto un saborizante o aditivo para alimentos o un producto para la salud o una bebida o jugo o colorante o pigmento o pintura o tinte.

11. Organismo eucariota no humano que porta una secuencia genética que codifica una molécula F3’5’H según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 de manera extracromosómica en forma de plásmido.

12. F3’5’H aislada codificada por la secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

3.

13. Progenie de la planta genéticamente modificada según la reivindicación 5 ó 6, comprendiendo dicha progenie dicha molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.