SECUENCIAS DE DNA USADAS EN LA PRODUCCION DE BSSL/CEL HUMANAS RECOMBINATES EN MAMIFEROS TRANSGENICOS NO HUMANOS Y EL USO DE LA BSSL/CEL PRODUCIDA EN FORMULAS INFANTILES.

Secuencias de DNA usadas en la producción de BSSL/CEL humanas recombinantes en mamíferos transgénicos no humanos y el uso de la BSSL/CEL producida en fórmulas infantiles. Campo de la técnica La presente invención se refiere a una molécula de ADN que contiene secuencias intrón y que codifica una proteína humana que se denomina, en función de su sitio de acción, Lipasa estimulada por sales biliares (Bile Salt-Stimulated Lipase, BSSL) o Lipasa de éster carboxílico (CEL). La molécula de ADN se utiliza ventajosamente en la producción de BSSL/CEL recombinante humana, preferiblemente mediante la producción de mamíferos transgénicos no humanos. La BSSL/CEL recombinante humana puede utilizarse como constituyente de fórmulas infantiles para alimentar niños en sustitución de la leche humana, o en la preparación de medicamentos contra, por ejemplo, la malabsorción de grasas, fibrosis cística y la pancreatitis crónica. Estado de la técnica anterior Hidrólisis de lípidos de la dieta Los lípidos de la dieta son una fuente importante de energía. Los triacilgliceroles ricos en energía constituyen más del 95% de estos lípidos. Algunos lípidos, por ejemplo ciertos ácidos grasos y las vitaminas liposolubles, son constituyentes esenciales de la dieta. Antes de la absorción gastrointestinal, los triacilgliceroles, los componentes minoritarios, es decir las vitaminas liposolubles esterificadas y el colesterol, y los diacilfosfatidilgliceroles, requieren la hidrólisis de los enlaces éster para proporcionar productos absorbibles menos hidrofóbicos. Estas reacciones están catalizadas por un grupo específico de enzimas llamadas lipasas. Se considera que las principales lipasas involucradas en el humano adulto son la Lipasa gástrica, la Lipasa pancreática dependiente de colipasa (hidrólisis de tri y diacilgliceroles), la fosfolipasa pancreática A2 (hidrólisis de diacilfosfatidilgliceroles) y la Lipasa del éster carboxílico (CEL) (hidrólisis de ésteres de colesterol y de ésteres de vitaminas liposolubles). En el recién nacido amamantado, la lipasa estimulada por sales biliares (BSSL) juega un papel esencial en la hidrólisis de muchos de los lípidos mencionados. Los productos de la digestión de los lípidos forman micelas mixtas junto con las sales biliares a partir de las cuales se realiza la absorción. Lipasa estimulada por sales biliares La glándula mamaria humana en el periodo de lactancia sintetiza y secreta una Lipasa estimulada por sales biliares (BSSL) con la leche (Blackberg et al., 1987) que, después de una activación específica a cargo de las sales biliares primarias, contribuye a la capacidad endógena del niño amamantado para la digestión intestinal de las grasas. Esta enzima, que representa aproximadamente el 1% de la proteína total de la leche (Blackberg & Hernell, 1981), no se degrada durante el paso de la leche a través del estómago, y en el duodeno las sales biliares la protegen de la inactivación mediante las proteasas pancreáticas como, por ejemplo, la tripsina y la quimotripsina. Sin embargo, se desactiva cuando la leche se pasteuriza, por ejemplo, cuando se calienta a 62.5ºC, 30 min (Björksten et al., 1980). Modelos experimentales in vitro sugieren que los productos finales de la digestión del triacilglicerol son diferentes en presencia de BSSL (Bernbäck et al., 1990; Hernell & Bläckberg, 1982). Este hecho puede ser beneficioso para la absorción del producto debido a las inferiores concentraciones intraluminales de sales biliares presentes en el periodo neonatal. Lipasa del éster carboxílico La lipasa del éster carboxílico (CEL) de los jugos pancreáticos humanos (Lombardo et al., 1978) parece ser funcionalmente idéntica, o al menos muy similar, a la BSSL (Blackberg et al, 1981). También comparten epítopos comunes, tienen secuencias N-terminales de aminoácidos idénticas (Abouakil et al., 1988) y se inhiben mediante inhibidores de las serina estearasas, por ejemplo eserina y diisopropilfluoro-fosfato. En estudios recientes de diversos laboratorios se han caracterizado las estructuras de ADNc de la lipasa de la leche y del páncreas (Baba et al., 1991; Hui et al., 1991; Nilsson et al., 1990; Reue et al., 1991) y la conclusión es que la enzima de la leche y la del páncreas son productos del mismo gen (en la presente solicitud se denomina gen CEL, EC 3.1.1.1). La secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos que se deduce del gen CEL se describen en el documento WO 91/15234 (Oklahoma Medical Research Foundation) y en el documento WO 91/18923 (Aktiebolaget Astra). Así, se asume que CEL es idéntica a la BSSL, y el polipéptido codificado por el gen CEL en este contexto se denomina BSSL/CEL. 2 Malabsorción de lípidos ES 2 335 626 T3 Los niveles intraluminales reducidos de la lipasa pancreática dependiente de colipasa y/o de las sales biliares son causas habituales de la malabsorción de lípidos, y por lo tanto de la malnutrición. Los pacientes que sufren de fibrosis cística, un desorden genético común que resulta en una deficiencia crónica en el 80% de los pacientes, y de pancreatitis crónica, a menudo a causa de alcoholismo crónico son ejemplos típicos de esta deficiencia de lipasa. El tratamiento actual de los pacientes que sufren una deficiencia de lipasa pancreática comprende la administración oral de dosis muy altas de un preparado crudo de enzimas pancreáticas porcinas. Sin embargo, la lipasa pancreática dependiente de la colipasa se encuentra inactivada a causa del bajo pH que predomina en el estómago. Este efecto no puede ser completamente superado utilizando dosis altas de enzima. Así las dosis altas que se administran son inadecuadas para la mayoría de los pacientes, y además, los preparados son impuros y de mal sabor. Se han formulado algunas pastillas que atraviesan las zonas ácidas del estómago y que únicamente liberan el enzima en el medio relativamente alcalino del yeyuno. Sin embargo, muchos pacientes que sufren desórdenes pancreáticos presentan un yeyuno anormalmente ácido y, en estos casos, las pastillas pueden fallar al liberar el enzima. Además, ya que los preparados disponibles en el mercado son de origen no humano existe el riesgo de que puedan causar efectos adversos en los pacientes o que presentes una efectividad terapéutica disminuida. Otra desventaja adicional de los preparados actuales es que no se especifica su contenido en otras actividades lipolíticas adicionales a la lipasa dependiente de colipasa. De hecho, la mayor parte presentan un nivel de actividad muy bajo de actividad BSSL/CEL. Esta puede ser una de las razones por las cuales muchos pacientes que padecen fibrosis cística, a pesar de seguir una terapia de suplementación, padecen deficiencias de vitaminas liposolubles y ácidos grasos esenciales. Así, existe una gran necesidad de productos con estructura y propiedades derivadas de las lipasas humanas y con una especifidad amplia frente el sustrato, que puedan administrarse por vía oral a los pacientes que padecen la deficiencia de una o más enzimas lipolíticas pancreáticas. Los productos que pueden derivar del uso de la presente invención pueden cubrir estas necesidades por sí mismos, o en combinación con preparados que contengan otras lipasas. Fórmulas infantiles Es conocido que la alimentación con leche humana se considera mejor que la alimentación mediante fórmulas infantiles. La leche humana no sólo proporciona un suministro bien equilibrado de nutrientes, si no que, además, es fácilmente digerible por el niño. Así, varios componentes biológicamente activos con funciones fisiológicas conocidas en el niño son componentes de la leche humana o se producen durante su digestión, incluyendo componentes involucrados en la defensa contra infecciones y componentes que facilitan la asimilación de nutrientes de la leche humana. A pesar de los grandes esfuerzos que se han invertido en la preparación de fórmulas infantiles, no ha sido posible preparar una fórmula que posea en algún grado las propiedades ventajosas de la leche humana. Así, el niño generalmente no digiere completamente las fórmulas infantiles, a menudo preparadas a partir de leche de vaca, y éstas carecen de sustancias que tengan efectos conocidos en las funciones fisiológicas del niño. Para obtener una fórmula infantil con un valor nutricional similar al de la leche humana se deben añadir varios aditivos como fragmentos de proteína, vitaminas, minerales, etc., que normalmente se forman o se asimilan al digerir el niño la leche humana, con el consiguiente riesgo de forzar y posiblemente dañar a largo término órganos importantes como el hígado o los riñones. Otra desventaja asociada al uso de fórmulas basadas en leche de vaca es el riesgo de inducir alergia a las proteínas bovinas en el niño. La leche humana de los denominados bancos de leche se ha utilizado como alternativa a las fórmulas...

1. Molécula de ADN que codifica lipasa estimulada por sales biliares/Lipasa de éster carboxílico (BSSL/CEL) humana que contiene 11 exones interrumpidos por 10 intrones, que comprende el fragmento SphI del plásmido pS309 (DSM 7101), el fragmento SacI del plásmido pS310 (DSM 7102), y el fragmento BamHI del plásmido pS311. 2. Molécula de ADN que codifica lipasa estimulada por sales biliares/Lipasa de éster carboxílico (BSSL/CEL) humana que contiene 11 exones interrumpidos por 10 intrones, que hibrida con la molécula de ADN según la reivindicación 1 en condiciones astringentes de hibridación. 3. Gen híbrido que es expresable en la glándula mamaria de una hembra adulta de un mamífero no humano que porta dicho gen híbrido, dicho gen híbrido comprendiendo una molécula de ADN como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y comprendiendo además una molécula de ADN que codifica una proteína láctea de un mamífero no humano, donde la molécula de ADN que codifica la BSSL/CEL humana se inserta en dicho gen de la proteína láctea de manera que dicha BSSL/CEL humana se produce cuando se expresa el gen híbrido. 4. Gen híbrido de acuerdo con la reivindicación 3, donde el gen de la proteína láctea del mamífero no humano se selecciona entre un gen que codifica una proteína de suero lácteo y una caseína. 5. Gen híbrido según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, donde la proteína láctea se selecciona del grupo que consiste en una -caseína, ß-caseína, -caseína, -lactalbúmina, y ß-lactalbúmina, preferiblemente donde el gen se selecciona entre proteína ácida de suero lácteo de murino (WAP), ß-lactoglobulina ovina, S1-caseína bovina, y ßcaseína de conejo. 6. Vector de expresión replicable que porta la molécula de ADN según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el gen híbrido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde el vector es capaz de mediar la expresión de la secuencia de ADN que codifica la BSSL/CEL humana. 7. Vector según la reivindicación 6 que contiene elementos de regulación que dirigen la expresión a la glándula mamaria de un mamífero no humano. 8. Sistema de vector de expresión de mamífero, que comprende un gen híbrido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5. 9. Célula de mamífero que porta el vector de expresión replicable según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, con la condición de que la célula no es una célula de embrión humano. 10. Célula de mamífero que porta el vector de expresión de la reivindicación 8, con la condición de que la célula no es una célula de embrión humano. 11. Célula de mamífero no humano de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 que es una célula de embrión. 12. Procedimiento para producir un mamífero transgénico no humano capaz de expresar la BSSL/CEL humana que comprende a) introducir un sistema vector de expresión según la reivindicación 8 en un óvulo fertilizado o en una célula de un embrión de un mamífero no humano de manera que se incorpora dicho vector de expresión en la línea germinal del mamífero; y b) desarrollar el embrión u óvulo fertilizado inyectado resultante en una hembra adulta de mamífero no humano. 13. Procedimiento para producir un mamífero transgénico no humano capaz de expresar la BSSL/CEL humana y sustancialmente incapaz de expresar la BSSL/CEL del propio mamífero, que comprende a) destruir la capacidad de expresar BSSL/CEL mamífero del mamífero de manera que sustancialmente no se exprese la BSSL/CEL del mamífero e insertar un sistema vector de expresión según la reivindicación 8 en la línea germinal del mamífero de manera que se exprese la BSSL/CEL humana en el mamífero; o b) reemplazar el gen BSSL/CEL de mamífero o una parte del mismo con un sistema vector de expresión según la reivindicación 8. 14. Mamífero transgénico no humano capaz de expresar y excretar la BSSL/CEL humana en su leche, que porta en su línea germinal un gen híbrido según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, un vector de expresión según la reivindicación 7, o un sistema de expresión según la reivindicación 8. 22 ES 2 335 626 T3 15. Mamífero transgénico no humano de acuerdo con la reivindicación 14, donde el mamífero se selecciona del grupo que consiste en ratones, ratas, conejos, oveja, cabras, cerdos y ganado vacuno. 16. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la reivindicación 15, donde el mamífero se selecciona del grupo que consiste en ratón, cordero, cabra y ganado vacuno. 17. Progenie de un mamífero transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 que es capaz de producir BSSL/CEL humana. 18. Uso de un mamífero transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 para la producción de leche. 19. Uso de la leche producida de acuerdo con la reivindicación 18 para la producción de una fórmula infantil. 23 ES 2 335 626 T3 24 ES 2 335 626 T3 ES 2 335 626 T3 26 ES 2 335 626 T3 27 ES 2 335 626 T3 28 ES 2 335 626 T3 29 ES 2 335 626 T3 ES 2 335 626 T3 31 ES 2 335 626 T3 32 ES 2 335 626 T3 33 ES 2 335 626 T3 34 ES 2 335 626 T3 (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: AB ASTRA (B) CALLE: Kvarnbergagatan 16 (C) CIUDAD: Sodertalje (E) PAÍS: Suecia (F) CÓDIGO POSTAL: S-151 85 (G) TELÉFONO: +46-8-553 26000 (H) TELEFAX: +46-8-553 28820 (I) TELEX: 19237 astra s ES 2 335 626 T3 LISTA DE SECUENCIAS (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: New DNA Sequences (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 1 (iv) FORMATO LEGIBLE PARA ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Floppy (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: SE 9201809-2(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-JUN-1992 (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: SE 9201826-6(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-JUN-1992 (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: SE 9202088-2 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-JUL-1992 (vi) DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR: (A) NÚMERO DE SOLICITUD: SE 9300902-5(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 19-MAR-1992 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 1 (i) CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11531 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO MOLECULAR: ADN (genómico) (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (F) TIPO DE TEJIDO: Glándula mamaria (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: join (1653..1727, 4071..4221, 4307..4429, 4707 ..4904, 6193..6323, 6501..6608, 6751..6868, 8335 ..8521, 8719..8922, 10124..10321, 10650..11394) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: matpeptde 1 ES 2 335 626 T3 (B) LOCALIZACIÓN: join (1722..1727, 4071..4221, 4307..4429, 4707 ..4904, 6193..6323, 6501..6608, 6751..6868, 8335 ..8521, 8719..8922, 10124..10321, 10650..11391)(D) OTRA INFORMACIÓN: /ECnumber= 3.1.1.1 /product= Bile Salt-Stimulated Lipase (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: 5UTR (B) LOCALIZACIÓN: 1..1640 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: TATAsignal (B) LOCALIZACIÓN: 1611..1617 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 1641..1727 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 4071..4221 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 4307..4429 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 4707..4904 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 6193..6323 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 6501..6608 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 6751..6868 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 8335..8521 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 8719..8922 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 10124..10321 (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: exon (B) LOCALIZACIÓN: 10650..11490 (ix) CARACTERÍSTICAS: 2 (A) NOMBRE/CLAVE: 3UTR (B) LOCALIZACIÓN: 11491..11531 ES 2 335 626 T3 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 1: 3 ES 2 335 626 T3 4 ES 2 335 626 T3 ES 2 335 626 T3 6 ES 2 335 626 T3 7 ES 2 335 626 T3 8 ES 2 335 626 T3 9 ES 2 335 626 T3