Métodos de secuenciación en diagnósticos prenatales.

Un método para preparar un biblioteca de secuenciación a partir de una muestra materna que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos

, en donde el método comprende los pasos consecutivos de reparación de extremos, adición de colas de dA y ligado por adaptadores de dichos ácidos nucleicos, y en donde dichos pasos consecutivos excluyen purificar los productos reparados en el extremo antes del paso de la adición de colas de dA y excluyen purificar los productos de la adición de colas de dA antes del paso de ligado por adaptadores.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/058614.

Solicitante: Verinata Health, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 800 Saginaw Drive Redwood City CA 94063 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: RAVA,RICHARD P, CHINNAPPA,MANJULA, COMSTOCK,DAVID A, HEILEK,GABRIELLE, RHEES,BRIAN KENT.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/34 (Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos)

PDF original: ES-2534758_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

1. CAMPO DE LA INVENCION

La invención es aplicable al campo de los diagnósticos prenatales y se refiere particularmente a métodos de secuenciación masivamente paralelos para determinar la presencia o ausencia de aneuploidías y/o fracción fetal.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La detección y diagnóstico prenatal son una parte rutinaria del cuidado prenatal. Actualmente, el diagnóstico prenatal de condiciones genéticas o cromosómicas implica pruebas invasivas, como la amniocentesis o muestreo de vellosidades coriónicas (CVS) , realizadas desde las 11 semanas de gestación y que implica un ~1% de riesgo de aborto involuntario. LA existencia de ADN libre de células circulante en la sangre materna (Lo et al., Lancet 350:485-487 [1997]) se está aprovechando para desarrollar procesos no invasivos que usan ácidos nucleicos fetales de una muestra de sangre periférica materna para determinar anomalías cromosómicas fetales (Fan HC y Quake SR Anal Chem 79:7576-7579 [2007]; Fan et al., Proc Natl Acad Sci 105:16266-16271 [2008] y Chu et al., Bionformatics, vol. 25, no. 10, pg. 1244-1250, que también divulgan métodos para preparas bibliotecas de secuenciación adecuadas y sus usos en métodos de secuenciación masivamente paralelos) . Estos métodos ofrecen alternativas y fuente segura de material genético para el diagnóstico prenatal, y podrían anunciar el final de los procedimientos invasivos.

La secuenciación de ácidos nucleicos está evolucionando rápidamente como una técnica de diagnóstico en el laboratorio clínico. Las aplicaciones que implican secuenciación se ven en varias áreas, incluyendo pruebas de cáncer que abarcan pruebas genéticas para predisposición al cáncer y la evaluación de mutaciones genéticas en el cáncer; genéticas que abarcan pruebas de portadores y diagnóstico de enfermedades trasmitidas genéticamente; y microbiología que abarca genotipado viral y secuencias asociadas con la resistencia a los fármacos.

La llegada de tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) que permiten la secuenciación de genomas completos en relativamente corto tiempo, ha proporcionado la oportunidad de comparar material genético originado de un cromosoma para que sea comparado con otro sin los riesgos asociados a los métodos de muestreo invasivos. Sin embargo, las limitaciones de los métodos existentes, que incluyen insuficiente sensibilidad derivada de los niveles limitados de ADN libre de células, y el sesgo de la secuenciación de la tecnología derivada de la naturaleza inherente de la información genómica, subyace la necesidad continuada para métodos no invasivos que proporcionen cualquiera o todos de especificidad, sensibilidad y aplicabilidad, para diagnosticas aneuploidías fetales en una variedad de entornos clínicos.

A medida que la secuenciación de ácidos nucleicos ha entrado en el ámbito clínico para las pruebas de cáncer, organizaciones como la NCCLS (National Council Of Clinical Laborator y Services) y la Association of Clinical Cytogenetics han proporcionado directrices para la estandarización de las pruebas basadas en secuenciación existentes que usan secuenciación basada en PCR, didesoxi-terminador, y extensión del cebador hechas en secuenciadores basados en gel o capilares (NCCLS: Nucleic Acid Sequencing Methods in Diagnostic Laborator y Medicine MM9-A, Vol. 24 No. 40) , secuenciación Sanger y QF-PCR (Association for Clinical Cytogenetics and Clinical Molecular Genetics Society, Practice Guidelines for Sanger Sequencing Analysis and Interpretation ratificada por el CMGS Executive Committee el 7 de agosto del 2009 disponible en la dirección web cmgs.org/BPGs/pdfs%20current%20bpgs/Sequencingv2.pdf QF-PCR for the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines (2007) v2.01) . Las directrices se basan en pruebas de consenso de varios protocolos y entre otros aspiran a reducir la aparición de eventos adversos en el laboratorio clínico, por ejemplo, mezclas de muestras, mientras se conserva la calidad y fiabilidad de los ensayos. Como los laboratorios clínicos ya están experimentando con NIPS, los procedimientos de calidad para implementar las nuevas tecnologías de secuenciación se desarrollaran para preparar sistemas de administración de cuidado de la salud seguros y apropiados.

La presente invención proporciona métodos para preparar una biblioteca de secuenciación y su uso en los métodos de secuenciación de próxima generación que sean aplicables al menos a la práctica de diagnósticos prenatales no invasivos, y abarca procedimientos que aumentan la velocidad y calidad de los métodos a la vez que minimizan la pérdida de material, y reducen la probabilidad de errores de la muestra.

3. RESUMEN DE LA INVENCION

La invención se refiere a un nuevo protocolo para preparar bibliotecas de secuenciación que inesperadamente mejora la calidad del ADN de la biblioteca a la vez que agiliza el proceso de análisis de muestras para diagnósticos prenatales.

La invención proporciona un método para preparar una librería de secuenciación de una muestra materna

que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternas, en donde el método comprende los pasos consecutivos de reparación de extremos, adición de colas de dA, y ligado por adaptadores de dichos ácidos nucleicos, y en donde los pasos consecutivos excluyen purificar los productos reparados en el extremo antes del paso de la adición de colas de dA y excluyen purificar los productos de la adición de colas de dA antes del paso de ligado por adaptadores.

En una realización, se divulga en la presente un uso de dicha biblioteca en un método para determinar una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra de sangre materna que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, en donde el método comprende: (a) preparar una biblioteca de secuenciación de la mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos; en donde preparar dicha biblioteca comprende los pasos consecutivos de reparación de extremos, adición de colas de dA, y ligado por adaptadores de dichos ácidos nucleicos; (b) secuenciar al menos una porción de las moléculas de ácidos nucleicos, obteniendo de esta manera información de la secuencia para una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos de una muestra de sangre materna; (c) usar la información de la secuencia para obtener una dosis de cromosoma par un cromosoma aneuploide; y (d) comparar la dosis de cromosoma con al menos un valor límite, e identificar de esta manera la presencia o ausencia de aneuploidía fetal.

En otra realización, se divulga en la presenta un uso de dicha biblioteca en un método para determinar una aneuploidía cromosómica fetal en una muestra de sangre materna que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, en donde el método comprende: (a) preparar una biblioteca de secuenciación de la mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos; en donde preparar dicha biblioteca comprende los pasos consecutivos de reparación de extremos, adición de colas de dA, y ligado por adaptadores de dichos ácidos nucleicos; (b) secuenciar al menos una porción de las moléculas de ácidos nucleicos, obteniendo de esta manera información de la secuencia para una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos de una muestra de sangre materna; (c) usar la información de la secuencia para obtener una dosis de cromosoma para un cromosoma aneuploide; y (d) comparar la dosis de cromosoma con al menos un valor límite, e identificar de esta manera la presencia o ausencia de aneuploidía fetal. El método comprende además usar la información de la secuencia para identificar un número de etiquetas de la secuencia mapeada para... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para preparar un biblioteca de secuenciación a partir de una muestra materna que comprende una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, en donde el método comprende los pasos consecutivos de reparación de extremos, adición de colas de dA y ligado por adaptadores de dichos ácidos nucleicos, y en donde dichos pasos consecutivos excluyen purificar los productos reparados en el extremo antes del paso de la adición de colas de dA y excluyen purificar los productos de la adición de colas de dA antes del paso de ligado por adaptadores.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde dichos pasos consecutivos se realizan en ausencia de polietilenglicol.

3. El método de la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, en donde dichos pasos consecutivos se realizan en menos de 1 hora.

4. El uso de la biblioteca de secuenciación preparada por el método de cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 en un método de secuenciación masivamente paralelo.

5. El uso de la Reivindicación 4, en donde dicho método de secuenciación es un método para determinar una aneuploidía cromosómica fetal en la muestra materna.

6. El uso de la Reivindicación 5, dicho método comprendiendo:

(a) secuenciar al menos una porción de dichas moléculas de ácidos nucleicos en dicha biblioteca de secuenciación, obteniendo de esta manera información de secuencia para una pluralidad de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos de una muestra materna, en donde la información de secuencia comprende lecturas de secuencias; y

(b) usar la información de secuencia para identificar un número de etiquetas de secuencias mapeadas para al menos un cromosoma normalizador y para un cromosoma aneuploide, comparando las secuencias de las lecturas de secuencias con la secuencia de un genoma de referencia humano para determinar el origen cromosómico de las moléculas de ácidos nucleicos secuenciados;

(c) calcular una dosis de cromosoma para dicho cromosoma aneuploide como:

(i) una proporción del número de etiquetas de secuencias mapeadas identificadas para dicho cromosoma aneuploide y el número de etiquetas de secuencias mapeadas identificadas para el al menos un cromosoma normalizador; o

(ii) una proporción de una proporción de la densidad de etiqueta de secuencia para dicho cromosoma aneuploide y una proporción de la densidad de etiqueta de secuencia para dicho al menos un cromosoma normalizador, en donde la proporción de la densidad de etiqueta de secuencia para dicho cromosoma aneuploide se calcula relacionando el número de etiquetas de secuencias mapeadas identificadas par dicho cromosoma aneuploide en el paso (b) con la longitud de dicho cromosoma aneuploide, y la proporción de la densidad de etiqueta de secuencia para dicho al menos un cromosoma normalizados se calcula relacionando el número de etiquetas de secuencias mapeadas identificadas para dicho al menos un cromosoma normalizador en el paso (b) con la longitud de dicho al menos un cromosoma normalizador; y

(d) comparar dicha dosis con un valor límite, en donde dicho valor límite es un número que sirve como un límite de diagnóstico de una aneuploidía, y determinar de esta manera la presencia o ausencia de aneuploidía fetal, en donde la presencia de una aneuploidía fetal se identifica si la dosis de cromosoma excede el valor límite, en donde:

(i) dicho al menos un cromosoma normalizador es un cromosoma o grupo de cromosomas que en un conjunto de datos de calificación de muestras que comprenden cromosomas presentes en un número de copias conocido y no aneuploide para el cromosoma de interés mostró una variabilidad en el número de etiquetas de secuencias mapeadas para él que se aproximó mejor a la variabilidad en el número de etiquetas de secuencias mapeadas para el cromosoma de interés; y/o

(ii) dicho al menos un cromosoma normalizador es un cromosoma o grupo de cromosomas que proporcionaron la diferencia estadística más grande entre la distribución de dosis de cromosomas para el cromosoma de interés en un conjunto de datos de calificación de muestras que comprenden cromosomas presentes en un número de copias conocido y no aneuploide para el cromosoma de interés y la dosis de cromosoma para el cromosoma de interés en una o más muestras afectadas.

7. El uso de la Reivindicación 5 o la Reivindicación 6, en donde dicha aneuploidía es una aneuploidía cromosómica.

8. El uso de la Reivindicación 5 o la Reivindicación 6, en donde dicha aneuploidía es una aneuploidía parcial.

9. El uso de la Reivindicación 5 o la Reivindicación 6, en donde dicha aneuploidía es una aneuploidía cromosómica elegida de trisomía 8, trisomía 13, trisomía 15, trisomía 16, trisomía 18, trisomía 21, trisomía 22, monosomía X, XXX, XXY y XYY.

10. El uso de la Reivindicación 4, en donde dicho método de secuenciación es un método para determinar la fracción de ácidos nucleicos fetales en la muestra materna.

11. El método o uso de cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en donde dicha muestra materna es un fluido biológico seleccionado de sangre, plasma, suero, orina y saliva.

12. El método o uso de la Reivindicación 11, en donde dicha muestra materna es una muestra de plasma.

13. El método o uso de cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en donde dichas moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos son moléculas de ADN libre células (ADNcf) .

14. El uso de la Reivindicación 4, en donde dicha secuenciación:

(i) es secuenciación de próxima generación (NGS) ;

(ii) es secuenciación masivamente paralela usando secuenciación por síntesis con terminadores de colorante reversibles;

(iii) es secuenciación masivamente paralela usando secuenciación por ligadura;

(iv) comprende una amplificación; o

(v) es secuenciación de moléculas individuales.