RETROTRANSCRIPTASAS DEL VIH TIPO 1 GRUPO O, ACTIVAS A TEMPERATURAS ELEVADAS.

Retrotranscriptasas del VIH tipo 1 grupo O, activas a temperaturas elevadas.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas expresadas y purificadas en bacterias y que tienen la secuencia de aminoácidos de la retrotranscriptasa de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) del grupo O modificada en las posiciones 358, 359 y 360; y de variantes de esta enzima que contienen cambios adicionales en las posiciones 355 y 357 o en la 478 o en la posición 69 (en este caso acompañada de una inserción de dos aminoácidos). Estas polimerasas presentan mayor actividad que la enzima no mutada, a temperaturas elevadas (superiores a 60ºC). Además retienen capacidad de síntesis de ADN a temperaturas superiores a 70ºC. Por otro lado, la fidelidad de copia de estas enzimas no difiere significativamente de la presentada por la retrotranscriptasa no mutada.

RETROTRANSCRIPTASAS DEL VIH TIPO 1 GRUPO O, ACTIVAS A TEMPERATURAS ELEVADAS

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más concretamente, se refiere a retrotranscriptasas expresadas y purificadas en bacterias y que tienen la secuencia de aminoácidos de la retrotranscriptasa de un virus de la 10 inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) del grupo O modificada en varias posiciones. Estas polimerasas presentan mayor actividad que la enzima no mutada, a temperaturas elevadas (superiores a 60ºC) . Además retienen capacidad de síntesis de ADN a temperaturas superiores a 70ºC. Por otro lado, la fidelidad de copia de estas enzimas no difiere significativamente de la presentada por la retrotranscriptasa no mutada. 15

Estado de la técnica

En retrovirus, la retrotranscriptasa (RT) (o transcriptasa inversa) es la enzima responsable de la replicación del genoma viral. La RT convierte el ARN genómico monocatenario en ADN 20 bicatenario capaz de integrarse en el genoma de la célula hospedadora [revisado por Le Grice. J Biol Chem, 2012; 287: 40850-40857]. Se trata de una polimerasa capaz de sintetizar ADN, utilizando como molde ARN ó ADN, indistintamente. Además, la RT posee actividad endonucleasa (ribonucleasa H) , que le permite degradar el molde ARN durante el proceso de síntesis de ADN dependiente de ARN. 25

Las RTs de retrovirus son enzimas útiles para la obtención de ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero (ARNm) o microARNs (miARN) , que una vez amplificado por técnicas convencionales (PCR, por ejemplo) puede utilizarse para detectar expresión génica en organismos o tejidos. La eficacia de la retrotranscripción es importante en muchas 30 aplicaciones biotecnológicas. Por ejemplo, para la detección de ARNs mensajeros, para su cuantificación mediante PCR en tiempo real, para el análisis de la expresión génica utilizando "microarrays" y también en estudios de transcriptómica utilizando técnicas de secuenciación masiva. Sin embargo, la presencia de estructuras secundarias en el ARN puede disminuir la eficacia de estas técnicas. Disponer de RTs capaces de sintetizar ADN a temperaturas 35 elevadas puede resultar útil para mejorar el rendimiento de los procesos de amplificación.

Desde un punto de vista metodológico las RTs más utilizadas comercialmente en reacciones de amplificación son las del virus de la mieloblastosis de aves (AMV) , la del virus Moloney de la leucemia de ratón (MLV) (Coté y Roth. Virus Res 2008; 134: 186-202) y variantes de la RT del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) (revisado en Hizi y Herschhorn. Virus Res 2008; 134: 203-220) . Las RTs de AMV y MLV son las más utilizadas en ensayos 5 de RT-PCR, aunque la de AMV presenta una mayor estabilidad térmica a temperaturas entre 42 y 52ºC (Gerard et al. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 3118-3129) . Existen variantes de la RT del MLV tales como AffinityScript (Agilent) o Super Script III (Invitrogen) que se comercializan como enzimas activas a temperaturas más elevadas (Arezi y Hogrefe. Nucleic Acids Res. 2009; 37: 473-481) . 10

Estudios llevados a cabo con RTs del VIH-1 clasificadas como pertenecientes al grupo M (subtipo B) han demostrado que estas enzimas presentan mayor actividad y estabilidad térmica que la RT del MLV, si bien son superadas por una variante RT "wild-type" derivada de un VIH-1 filogenéticamente distinto y clasificado como de grupo O (Álvarez et al. J Mol Biol 15 2009; 392: 872-884; patente WO2010130864 (A1) ) . En ensayos de RT-PCR aplicados a la expresión de ARN mensajero de tubulina, la RT del MLV no dio lugar a amplificación a temperaturas superiores a 52ºC, si bien las RTs "wild-type" de grupo O o de subtipo B lo hacían a temperaturas de hasta 64ºC, aunque solo la primera de ellas amplificaba a 66-68ºC (Álvarez et al. J Mol Biol 2009; 392: 872-884) . Las RTs del VIH-1 son heterodímeros 20 compuestos por dos subunidades, una de 560 aminoácidos (denominada p66) y otra de 440 aminoácidos (denominada p51) . La secuencia de p51 es idéntica a la de los aminoácidos 1-440 de p66. Las RTs del VIH-1 del grupo O se caracterizan por presentar alrededor de un 20% de aminoácidos distintos cuando se comparan con secuencias prototipo "wild-type" de subtipo B (Quiñones-Mateu et al. Virology 1997; 236: 364-373) . Se han caracterizado varias 25 RTs de grupo O que presentan mayor fidelidad de copia que la RT "wild-type", como por ejemplo las portadoras de los cambios V75I, K65R y K65R/V75I. Estas RTs tienen una estabilidad térmica y eficacia catalítica a temperaturas elevadas similar a la exhibida por la RT "wild-type" (Barrioluengo et al. Biochem J 2011; 436: 599-607; patente WO2012080541 (A1) ) .

Descripción breve de la invención

La presente invención se refiere a retrotranscriptasas aisladas de un virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) de grupo O y modificadas en una o en más posiciones, que presentan una mayor termoestabilidad que la enzima original, manteniendo 35

su fidelidad de copia, así como a su uso para llevar a cabo la retrotranscripción, amplificación o secuenciación de un ácido nucleico molde.

Un primer objeto de la invención se refiere al polipéptido que codifica una proteína con actividad RT aislada de un VIH-1 de grupo O y que presenta una mayor estabilidad a altas temperaturas, 5 y que posee mayor actividad que la enzima WT a temperaturas superiores a 75ºC, manteniendo su fidelidad de copia, y caracterizado porque su secuencia de aminoácidos presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la secuencia parental SEQ ID NO 1, y porque comprende alteraciones en su secuencia de aminoácidos (como pueden ser, por ejemplo, sustituciones, deleciones y/o inserciones) en las siguientes posiciones: 10

- la posición homóloga a la posición 358 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido lisina (K) original por el aminoácido arginina (R) (mutación K358R) .

- la posición homóloga a la posición 359 de dicha secuencia, que sustituye el aminoácido alanina (A) original por el aminoácido glicina (G) (mutación A359G) .

- la posición homóloga a la posición 360 de dicha secuencia, que sustituye el 15 aminoácido serina (S) original por el aminoácido alanina (A) (mutación S360A) .

También se describen otras variantes de retrotranscriptasas que contienen cambios adicionales a la combinación K358R/A359G/S360A (común a todas ellas) , y que mejoran la termoestabilidad de la RT WT, es decir su capacidad para sintetizar ADN a elevadas 20 temperaturas utilizando ARN como molde. Estos cambios de aminoácido e inserciones pertenecen, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo:

a) La sustitución del aminoácido treonina (T) por la inserción de dos aminoácidos serina y una glicina (SSG) en la posición homóloga a la posición 69 de la SEQ ID NO 1 (mutación T69SSG) . 25

b) La sustitución del aminoácido treonina (T) por el aminoácido alanina (A) en la posición homóloga a la posición 355 de la SEQ ID NO 1 (mutación T355A) .

c) La sustitución del aminoácido glutamina (Q) por el aminoácido metionina (M) en la posición homóloga a la posición 357 de la SEQ ID NO 1 (mutación Q357M) .

d) La sustitución del ácido glutámico (E) por el aminoácido glutamina (Q) en la 30 posición homóloga a la posición 478 de la SEQ ID NO 1 (E478Q) .

En esta invención se incluyen como objeto particular de la invención varias retrotranscriptasas variantes del VIH-1 del grupo O que se han usado como punto de partida y que presentan las mutaciones anteriormente descritas, y cuyas secuencias polipeptídicas 35 particulares se corresponden con la SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, y SEQ ID

NO 9; así como sus correspondientes secuencias nucleotídicas (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10) .

Otro objeto de la invención son los vectores que comprenden los polinucleótidos que codifican las retrotranscriptasas de la invención. 5

Otro objeto de la invención es la célula que comprende el polinucleótido que codifica la retrotranscriptasa de la invención. Preferentemente dicha célula es una bacteria, y más preferentemente aún es una Escherichia coli.

Otro objeto de la presente invención es el método de obtención del polipéptido de la invención, que comprende los siguientes pasos:

1) Introducir el vector de la invención en una célula hospedadora adecuada (célula hospedadora de la invención) ,

2) Cultivar la célula hospedadora de la invención en un medio adecuado, y, 15

3) Purificar el polipéptido de la invención con actividad RT.

Otro objeto de la invención se refiere... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido que codifica una proteína con actividad retrotranscriptasa aislada de un VIH-1 de grupo O, que presenta una mayor estabilidad a altas temperaturas, y que posee mayor actividad que la enzima de la que procede a temperaturas superiores a 75ºC, manteniendo 5 su fidelidad de copia, y caracterizado porque su secuencia de aminoácidos presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la secuencia parental SEQ ID NO 1, y porque comprende, al menos, los siguientes cambios de aminoácido:

- la sustitución del aminoácido lisina (K) original por el aminoácido arginina (R) en la posición homóloga a la posición 358 de SEQ ID NO 1 (mutación K358R) , 10

- la sustitución del aminoácido alanina (A) original por el aminoácido glicina (G) en la posición homóloga a la posición 359 de SEQ ID NO 1 (mutación A359G) , y

- la sustitución del aminoácido serina (S) original por el aminoácido alanina (A) en la posición homóloga a la posición 360 de SEQ ID NO 1 (mutación S360A) .

2. Polipéptido según la reivindicación 1 caracterizado porque su secuencia de aminoácidos posee además una de las siguientes mutaciones adicionales o cualesquiera de sus combinaciones:

a) La sustitución del aminoácido treonina (T) original por la inserción de dos aminoácidos serina y una glicina (SSG) en la posición homóloga a la posición 69 de 20 la SEQ ID No 1 (mutación T69SSG) ;

b) La sustitución del aminoácido treonina (T) original por el aminoácido alanina (A) en la posición homóloga a la posición 355 de la SEQ ID NO 1 (mutación T355A) ;

c) La sustitución del aminoácido glutamina (Q) original por el aminoácido metionina (M) en la posición homóloga a la posición 357 de la SEQ ID NO 1 (mutación Q357M) ; 25

d) La sustitución del aminoácido ácido glutámico (E) original por el aminoácido glutamina (Q) en la posición homóloga a la posición 478 de la SEQ ID NO 1 (E478Q) .

3. Polipéptido según la reivindicación 1 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la SEQ ID NO 3. 30

4. Polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la SEQ ID NO 5.

5. Polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por que su secuencia se 35 corresponde con la SEQ ID NO 7.

6. Polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por que su secuencia se corresponde con la SEQ ID NO 9.

7. Polipéptido según las reivindicaciones 1 a la 6 que presenta además las secuencias flanqueantes MNS en el extremo N-terminal y una cola de histidina en el extremo C-terminal, 5 caracterizado porque su secuencia se corresponde con alguna de las siguientes: SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19.

8. Polinucleótido que codifica un polipéptido con actividad retrotranscriptasa aislada de un VIH-1 de grupo O, que presenta una mayor estabilidad a altas temperaturas, y que posee 10 mayor actividad que la enzima de la que procede a temperaturas superiores a 75ºC, manteniendo su fidelidad de copia caracterizado por que codifica alguna de las secuencias nucleotídicas según las reivindicaciones 1 a 7.

9. Polinucléotido según la reivindicación 8 caracterizado por que su secuencia se 15 corresponde con alguna de las siguientes: SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20.

10. Vector caracterizado por que comprende el polinucleótido según las reivindicaciones 8 y 9.

11. Célula hospedadora caracterizada porque comprende el polinucleótido según las reivindicaciones 8 y 9 o el vector según la reivindicación 10 y es capaz de producir el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7.

12. La célula hospedadora según la reivindicación 11 caracterizada por ser una bacteria. 25

13. La célula hospedadora según la reivindicación 12 caracterizada por ser Escherichia coli.

14. Método de obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque comprende las siguientes etapas: 30

a. introducir un vector según la reivindicación 10 en una célula hospedadora adecuada, b. cultivar la célula hospedadora en un medio adecuado, y, c. purificar el polipéptido con actividad retrotranscriptasa.

15. Uso del polinucleótido según las reivindicaciones 8 y 9 para la obtención del polipéptido 35 según las reivindicaciones 1 a 7.

16. Uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 11 a 13 para la obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7.

17. Uso del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7 para la retrotranscripcion de un ácido nucleico molde. 5

18. Uso del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7 para la amplificación de un ácido nucleico molde.

19. Uso del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7 para la secuenciación de un ácido 10 nucleico molde.

20. Uso del polipéptido según las reivindicaciones 17 a 19 donde el ácido nucleico molde es ARNm o miARN.

21. Método de retrotranscripción de un ácido nucleico molde que comprende:

a) mezclar dicho ácido nucleico molde con el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7, b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la síntesis de ADN complementario al ácido nucleico molde.

22. Método de amplificación de un ácido nucleico molde que comprende:

a) mezclar dicho ácido nucleico con el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7 y con, al menos, una ADN polimerasa dependiente de ADN, e b) incubar la mezcla del paso (a) en condiciones que permitan la amplificación de ADN complementario al ácido nucleico molde. 25

23. Método de secuenciación de un ácido nucleico que comprende:

a) poner en contacto dicho ácido nucleico con el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7, b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan la síntesis de una población de 30 moléculas de ADN complementario al ácido nucleico molde, y c) separar dicha población de moléculas de ADN complementario para determinar la secuencia de nucleótidos.

24. Método según las reivindicaciones 21 a 23 donde el ácido nucleico molde es ARNm o 35 miARN.

25. Kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo un método según las reivindicaciones 21 a 24 que comprende:

a) el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 7, y b) al menos, un elemento de la lista que comprende:

i) un tampón, 5

ii) un cebador, iii) una ADN polimerasa dependiente de ADN, y iv) un nucleótido.

26. Uso del kit según la reivindicación 25 para llevar a cabo un método según las 10 reivindicaciones 21 a 24.