Regiones de marco de inmunoglobulina que demuestran estabilidad potenciada en el entorno intracelulcar y métodos de identificación de las mismas.

Región de marco de cadena sencilla que tiene la estructura general:



NH2-VL-enlazador-VH-COOH; o NH2-VH-enlazador-VL-COOH,

en la que

(i) la región de marco de VH tiene la secuencia de aminoácidos J (Seq. Id. No. 10)

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IYAQKFQDRVTL TRDTSIGTVYMEL TSL TSDDTA VYYCARVPRGTYLDPWDYFDYWG QGTL VTVSS; y

(ii) la región de marco de VL tiene la secuencia de aminoácidos B (Seq. Id. No. 2)

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VPSRFSGSGSGTEFTL TISSLQPEDVA VYYCQQYVSLPYMFGQGTKVDIKR;

o una variante de las mismas que presenta una identidad del 90% o superior con la región de marco decadena sencilla a la vez que mantiene una estabilidad potenciada según se determina mediante el ensayodel ejemplo 2.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2003/005324.

Solicitante: ESBATech - a Novartis Company LLC.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: WAGISTRASSE 21 8952 SCHLIEREN SUIZA.

Inventor/es: AUF DER MAUR, ADRIAN, BARBERIS, ALCIDE, ESCHER, DOMINIK, TISSOT,KATHRIN, EWERT,STEFAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K48/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • C07K16/18 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.

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Fragmento de la descripción:

Regiones de marco de inmunoglobulina que demuestran estabilidad potenciada en el entorno intracelular y métodos de identificación de las mismas

Campo de la invención La invención se refiere a la química de proteínas, la biología molecular y la inmunología.

Antecedentes de la técnica relacionada Los anticuerpos pueden reconocer y dirigirse a casi cualquier molécula con alta especificidad y afinidad. Se ha aprovechado esta característica para convertir estas proteínas naturales en poderosas herramientas para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Los avances en la tecnología de ADN recombinante han facilitado la manipulación, clonación y expresión de genes de anticuerpos en una amplia variedad de células no linfoides (Skerra, 1988; Martineau, 1998; Verma, 1998) . Se han construido varios fragmentos de anticuerpo diferentes para adaptarse de la mejor manera a las diversas aplicaciones. La entidad más pequeña que retiene la capacidad de unión al antígeno completo de la inmunoglobulina parental completa es el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) (Bird, 1988) . Este fragmento de anticuerpo comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera unidas por un enlazador peptídico flexible, lo que permite la expresión de la proteína de un único gen.

Los fragmentos de anticuerpo tienen varias ventajas importantes en comparación con la molécula de inmunoglobulina completa. Debido a su menor tamaño, se facilita la expresión y se potencia la producci en una variedad de células huésped de expresión, tales como células de E. coli (Plückthun, 1996) . Además, los fragmentos de anticuerpo permiten una penetración mejorada en tumores en aplicaciones in vivo (Yokota, 1992) y pueden unirse covalentemente a diversas moléculas efectoras para enfoques terapéuticos.

Los anticuerpos que se producen de manera natural, que se secretan por células plasmáticas, han evolucionado para funcionar en un entorno oxidante, extracelular. Para obtener su estructura plegada, funcional, generalmente requieren la formación de puentes disulfuro dentro de los dominios independientes, que son cruciales para la estabilidad del plegamiento de la inmunoglobulina. A diferencia de los anticuerpos de longitud completa, los fragmentos de anticuerpo scFv o Fab pueden, en principio, expresarse funcionalmente en un entorno reductor en el interior de cualquier célula y dirigirse a cualquier compartimento para dirigirse a proteínas intracelulares y, por tanto, evocar efectos biológicos específicos (Biocca, 1991) . En efecto, algunos fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla intracelulares, que se denominan intracuerpos, se han aplicado satisfactoriamente para modular la función de proteínas diana intracelulares en diferentes sistemas biológicos. Por tanto, se ha demostrado resistencia frente a infecciones virales en biotecnología vegetal (Tavladoraki, 1993; Benvenuto, 1995) , se ha mostrado la unión de intracuerpos a proteínas del VIH (Rondon, 1997) y se ha descrito la unión a productos oncogénicos (Biocca, 1993; Cochet, 1998; Lener, 2000) . Además, los anticuerpos intracelulares prometen ser una herramienta valiosa en la caracterización de la función de un amplio número de genes ahora identificados a través de la secuenciación del genoma humano (Richardson, J 995; Marasco, 1997) . Por ejemplo, pueden usarse en un enfoque de genémica funcional para bloquear o modular la actividad de proteínas recién identificadas, contribuyendo de ese modo a la comprensión de sus funciones. Finalmente, los intracuerpos tienen posibles aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, por ejemplo en prácticas de terapia génica.

A pesar de estas grandes perspectivas, la generación de intracuerpos funcionales está limitada todavía por su inestabilidad e insolubilidad o propensión a agregarse. El entorno reductor del citoplasma impide la formación de los puentes disulfuro intracatenarios conservados, haciendo por tanto que un alto porcentaje de fragmentos de anticuerpo sean inestables y, como consecuencia, no funcionales en el interior de la célula (Biocca, 1995; Proba, 1997) . La estabilidad y la solubilidad de fragmentos de anticuerpo representan, por tanto, un obstáculo importante para la aplicación de intracuerpos como posibles moduladores de la función de la proteína in vivo. Hasta la fecha, no pueden realizarse predicciones sobre los requisitos de secuencia que hacen que un fragmento de anticuerpo sea funcional en un entorno intracelular.

Existe, por tanto, una necesidad de fragmentos de anticuerpo que funcionen bien en una amplia gama de diferentes tipos celulares y puedan usarse, por tanto, como regiones de marco para diversas especificidades de unión. Tales regiones de marco pueden usarse para construir bibliotecas para selección intracelular o pueden servir como aceptor para las partes de unión de un anticuerpo existente.

Además de ser adecuados de forma única para aplicaciones intracelulares, tales fragmentos de anticuerpo o anticuerpos completos basados en regiones de marco de dominios variables muy estables también tienen una ventaja distintiva con respecto a los demás anticuerpos en numerosas aplicaciones extracelulares e in vitro. Cuando se producen tales regiones de marco en un entorno oxidante, pueden formarse sus puentes disulfuro, potenciando adicionalmente su estabilidad y haciéndolos sumamente resistentes frente a la agregación y la degradación de proteasas. La semivida in vivo (y por tanto la resistencia frente a la agregación y la degradación por proteasas séricas) es, además de la afinidad y la especificidad, el factor individual más importante para el éxito de los anticuerpos en aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico (Willuda, 1999) . La semivida de fragmentos de anticuerpo puede aumentarse adicionalmente a través de la unión covalente de moléculas de polímero tales como polietilenglicol (PEG) (Weir, 2002) . Las moléculas estables de este tipo representan un avance significativo en el uso de anticuerpos, especialmente, pero no exclusivamente, cuando no se desea la funcionalidad Fc.

La gran importancia práctica de las bibliotecas de fragmentos de anticuerpo ha motivado la investigación en esta área. Winter (documento EP 0368684) ha proporcionado la clonación inicial y la expresión de genes de regiones variables de anticuerpo. Partiendo de estos genes, se crearon grandes bibliotecas de anticuerpos que tienen alta diversidad tanto en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) así como en las regiones de marco. Winter no da a conocer, sin embargo, la utilidad de diferentes regiones de marco para la construcción de bibliotecas.

La enseñanza de Plückthun (documento EP 0859841) , por otra parte, ha tratado de mejorar el diseño de bibliotecas limitando las regiones de marco a un número definido de secuencias consenso sintéticas. Los esfuerzos en ingeniería de proteínas que implican la introducción de una gran cantidad de mutaciones diseñadas racionalmente han sugerido previamente mutaciones hacia la secuencia consenso respectiva como un medio adecuado para la mejora de la estabilidad de dominios de inmunoglobulina variables aislados (Ohage 1999; Ohage 1999 y el documento US 5.854.027, incorporados como referencia al presente documento) .

Plückthun (documento EP 0859841) da a conocer métodos para la optimización adicional de las afinidades de unión en estas secuencias consenso. La patente de Plückthun también reconoce el continuo aumento en el conocimiento referente a los anticuerpos y por consiguiente tiene como objetivo incluir tales hallazgos futuros en el diseño de bibliotecas. Sin embargo, no se sugieren posibles mejoras adicionales de las regiones de marco consenso sintéticas.

Las enseñanzas de Winter, Plückthun y otros (por ejemplo Soderlind, documento WO 0175091) han intentado, por tanto, crear grandes bibliotecas de anticuerpos centrándose en la alta diversidad en las CDR para la selección y aplicación de los scFv seleccionados en condiciones oxidantes. Todas estas bibliotecas no están optimizadas, sin embargo, para aplicaciones intracelulares y, por tanto, no son útiles para la selección y las aplicaciones en un entorno reductor, u otras condiciones que establecen requisitos especiales sobre la estabilidad y la solubilidad del fragmento de anticuerpo expresado.

Las cualidades requeridas para que los fragmentos de anticuerpo funcionen bien en un entorno reductor, por ejemplo el citoplasma de células procariotas y eucariotas, no están claras. La aplicación de anticuerpos intracelulares o quot;intracuerposquot; está por tanto actualmente limitada por su comportamiento impredecible en condiciones reductoras, lo que puede afectar sus propiedades de estabilidad y solubilidad (Biocca, 1995; Worn, 2000) . Las presentes... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Región de marco de cadena sencilla que tiene la estructura general:

NH2-VL-enlazador-VH-COOH; o NH2-VH-enlazador-VL-COOH,

en la que (i) la región de marco de VH tiene la secuencia de aminoácidos J (Seq. Id. No. 10)

VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEWMGRINPDSGDT IYAQKFQDRVTL TRDTSIGTVYMEL TSL TSDDTA VYYCARVPRGTYLDPWDYFDYWG QGTL VTVSS; y

(ii) la región de marco de VL tiene la secuencia de aminoácidos B (Seq. Id. No. 2)

EIVL TQSPSSLSASVGDRVTL TCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLlYAGSILQSG VPSRFSGSGSGTEFTL TISSLQPEDVA VYYCQQYVSLPYMFGQGTKVDIKR;

o una variante de las mismas que presenta una identidad del 90% o superior con la región de marco de cadena sencilla a la vez que mantiene una estabilidad potenciada según se determina mediante el ensayo del ejemplo 2.

2. Región de marco de cadena sencilla según la reivindicación 1, que es BJ.

3. Región de marco de cadena sencilla según la reivindicación 2, fusionada a un segundo resto de proteína para producir un constructo de fusión de la estructura general

NH2-VL-enlazador-VH-segunda proteína-COOH; o NH2-segunda proteína-VL-enlazador-VH-COOH

4. Región de marco de cadena sencilla según la reivindicación 3, en la que se invierte la orientación de las regiones VH y VL.

5. Región de marco de cadena sencilla según la reivindicación 3, en la que la segunda proteína proporciona una lectura para ensayos intracelulares.

6. Uso de al menos dos secuencias de región de marco en la identificación de una clase de residuo de región de marco conservada, en el que una de las al menos dos secuencias de región de marco es una secuencia de región de marco según la reivindicación 1.

7. Uso según la reivindicación 6, en la que la clase de residuo de región de marco conservada se selecciona del grupo que consiste en: grupos R polares pero no cargados; grupos R cargados positivamente; grupos R cargados negativamente;

grupos R hidrófobos; y aminoácidos especiales.

8. Uso de al menos dos secuencias de región de marco en la identificación de al menos una secuencia de región de marco conservada, en la que una de las al menos dos secuencias de región de marco es una secuencia de región de marco según la reivindicación 1.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la secuencia de región de marco conservada es de 2-5 residuos.

10. Uso según la reivindicación 8, en el que la secuencia de región de marco conservada es de 5-10 residuos.

11. Uso según la reivindicación 8, en el que la secuencia de región de marco conservada es de 10-25 residuos.

12. Uso según las reivindicaciones 8-11, en el que la secuencia de región de marco conservada tiene huecos.

13. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende la VL y la VH de la región de marco de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

14. Ácido nucleico capaz de codificar para la región de marco de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

15. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14.

16. Célula huésped que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 14.

17. Uso del ácido nucleico según la reivindicación 14, en terapia génica.

18. Región de marco de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, anticuerpo o fragmento de anticuerpo según la reivindicación 13, para su uso en la validación de dianas, aplicaciones de diagnóstico, construcciones de bibliotecas o aplicaciones terapéuticas.

19. Uso de la región de marco de cadena sencilla según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, como región de marco aceptora para el injerto de bucles hipervariables.

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2:

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....

Tabla 4: Estadistica de la frecuencia de subgrupos de reglones de entramado que fundonan bien seleccionadas en el sistema de control de calidad (% de las secuencias seleccionadas totales)

Dominio VL VL seleCCionado ~. VLal azar

VLd 52% 46%

VLllt;2 59& 896

VLld 59& 17'11

VLp¡;4 o 12, 5'Jl.

VLU 19% 49&

VLA.2 3'11 ' 4i'1b

VLAl 14% B% '

DominioVH VH seleccionado VH al azar

VBlb 1.9% 39%

VHla 9% 13%

VH2 O O

VH3 61% 221fó

VB4 5% 26~

VH5 O 0%

VH6 O ~

Tabla 5: Secuencias de dominio VH y VL usadas para las combinaciones de regiones de entramado novedosas

abr. ortgen subgrupo secuencia de aminoácidos

l.x KI27 VKl EIVMTQSPSTLSASVODRVIITCRASQSISSW LAWYQQKPGKAPXLLIYKASSLESGVPSRFS GSGSGAmnL~SLQPDDFATYYCQQYKSY W1quot;J:lt;\.ñ.lGTKLTVLG (S~. Id. No. 1)

2.x KIII2S V1Cl EIVLTQSPSSLSASVODRVTLTCRASQGlRNE LA WYQQRPGKAPKRllY AGSn.QSGVPSRFS GSGSG'lEFI1.TISSLQPBDVAVYYCQQYYSL PYMFGQOTKVDIKR (~eq. Id. No. 2)

3.x K IVI03 VK3 EIVMTQSPATLSVSPGESAALSCRASQGVST NVA WYQQKPOQAPRILIYOATI'RASOVP A RFSGSGSGTBFILTINSLQSEDFAAYYCQQY .lU1W lquot;.t'w'fFGQGTKVEIKR (Seq. Id. No. 3 )

4.x KIVI07 VAl QSVLTQPPSVSAAPGQKVrISCSGSTSNIODN YVSWYQQLPGTAPQllIYDN1'KRPSGIPDRF SGSKSGTSATLGITGLQrGDEADYYCGTWD SSLSGVVFGGGTKLTVLGiSeq. Id. No.4}

S.x KIV13S Vquot;K3' EIVLTQSPATLSLSPGBRATI..SCRASQTI..THY LA WYQQKPOQAPRlLIYDTSKRATOVPARF SGSGSGTDFTLTISSLEfEDSALYYCQQRNS WPH'IFGGGI'.KI...EI.KR (Seq. Id. :No. 5)

6.x A43 VA3 SYVLTQFPSVSVAPOQTATVTCGGNNIGSKS VHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGlPERF SGSNSGNTATLTIRRVEAGDEADITCQVWD SSSDHNVFGSGTKVBIKR (Seq. Id. No. 6)

7.x A33 VA3 LPVLTQPPSVSVAPOQTARISCGGNNIE11SV HWYQQKPGQAPVLVVSDDSVRPSGIPBRFS GSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDS SSDYVVFOGOTKLTVLG (Seq. Id. No. 7)

Tabla 5 (continuación)

x.l A44 VH3 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF SSYAMSWVRQAPGKGLE'WVSAISOSOGST YYADSVKORFllSRDNSKNTLYLQMNSLR ABDTAVYYCAAHVLRFLEWI.PDAFD1WG QGTI.. VTVSS (Seq. Id. No. 8)

x.2 Afwl0 VH3 EIVLTQSPSSLSASLODRVTlTCRASQSlSSY ~QQKPOKAPKUUYAASSSQSGVPSR FRGSESGTDPI'LTISNLQPEDFATYYCQQS YR'I'PFTFGPGTKVBrKR. (Selt;¡. Id. No. 9)

x.3 A33 VHlb VQLVQSGABVKXPGASVKVSCTASGYSFr OYF.LHWVRQAPGQOLEWM:GRINPDSGDTI YAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMBLTSLTSD DTAVYYGARVPRGTYLDPWDYFDYWGQ GTLVTVSS (Seo. Id. No. 10)

x.4 A43 quot; ...:. :_:... ~ VH3 BVQLVESOGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQAPGKOLEWVSAISGSGOST YYADSVKGR.FI'I;SRDNSKNILYLQMNSLR AEDTAVYYCAKDAGIAVAOTGFDYWGQG 'ILVTVSS (Seq. Id No.t!) quot;

.


 

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