Recuento celular.

Método para determinar los recuentos absolutos de células por volumen unitario de una muestra, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un recipiente que contiene:

(i) una cantidad predeterminada de micropartículas; y

(ii) un agente de unión a células;

en el que las micropartículas están dispuestas en o sobre una matriz que se adhiere a al menos una pared del recipiente de manera que sustancialmente todas las micropartículas se unen de ese modo al recipiente;

(b) añadir un volumen conocido de muestra al recipiente;

(c) determinar la razón de micropartículas con respecto a células contando las micropartículas y células en un volumen de la muestra; y

(d) determinar el recuento absoluto de células multiplicando el número de células por micropartícula por la concentración de micropartículas en la muestra.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2006/000613.

Solicitante: DAKO DENMARK A/S.

Inventor/es: LAURSEN,JESPER, WINTHER,LARS, CHRISTENSEN,Nanna K.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/543 (con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA,... > B01L3/00 (Recipientes o utensilios para laboratorios, p. ej. cristalería de laboratorio (botellas B65D; equipos para enzimología o microbiología C12M 1/00 ); Cuentagotas (recipientes para volumetría G01F))
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > APARATOS DE LABORATORIO PARA LA QUIMICA O LA FISICA,... > Recipientes o utensilios para laboratorios, p. ej.... > B01L3/14 (Tubos de ensayo)

PDF original: ES-2533334_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Recuento celular Campo

Esta Invención se refiere a los campos de diagnóstico, ensayos, normalización y enumeración de partículas, en particular células. En particular, la invención se refiere a métodos y composiciones para identificar la concentración o el "recuento absoluto" (células por volumen unitario) de uno o más tipos celulares en una muestra.

Antecedentes

El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) infecta a células que expresan el receptor CD4 (De Wolf et al., 1988, AIDS Res Hum Retroviruses 1988; 4:433-44) y, como resultado, reduce el número de linfocitos CD4 del huésped (Lang et al., 1989, J Acquir Immune Defic Syndr 1989; 2:63-69). Esta reducción de linfocitos T CD4 se ha vinculado a la inmunopatogénesis de la infección por VIH y a la progresión de la enfermedad (Fahey et al., 199, N Engl J Med 199; 322:166-172; Masur, 1989, Ann Intern Med 1989; 111:223-231).

Se ha incluido un recuento de CD4 <= 2 células/pl como acontecimiento definitorio de SIDA (Centers for Disease Control. 1992B, Morbid Mortal Weekly Rep 1992; 41(RR-17):1-35), ya que estas mediciones son factores de pronóstico útiles para la aparición de enfermedades oportunistas tales como neumonía por Pneumocystis carinii (Centers for Disease Control. 1992A, Morbid Mortal Weekly Rep 1992; 41(RR-4):1-11). Con la llegada de la terapia antirretroviral altamente activa, se han usado las mediciones de linfocitos T CD4 para monitorizar la reconstitución inmunitaria (Autran et al., 1997, Science 1997; 277:112-116).

La metodología propuesta actual para determinar los recuentos absolutos de linfocitos T CD4 depende de la identificación inmunofenotípica de células con anticuerpos monoclonales marcados fluorescentemente dirigidos contra el antígeno CD4. Se determinan los porcentajes relativos de células T CD4 con un citómetro de flujo. Se obtiene un recuento absoluto de CD4 multiplicando el porcentaje de linfocitos que son CD3+ CD4+ por el recuento absoluto de linfocitos determinado con un instrumento de hematología.

Sin embargo, el envío durante la noche de la sangre puede dar como resultado un aumento de la variabilidad intrínseca en el recuento absoluto de linfocitos dependiendo del instrumento de hematología que se use (Koepke y Landay 1989, Clin Immunol Immunopathol 1989; 52:19-2; Paxton et al., 1993, Ann N Y Acad Sci 1993; 677:44-443). Por tanto, el recuento absoluto de CD4 en muestras durante la noche puede tener una variabilidad aumentada debido únicamente a los determinantes hematológicos.

Por tanto, la determinación del "recuento absoluto" de un tipo celular, es decir, el número de células en un volumen dado (concentración), es una consideración importante en el campo general de la citometría y en el campo del diagnóstico y la monitorización de VIH en particular.

La patente estadounidense número 4.11.64 describe un método y un aparato para determinarla concentración de partículas en un fluido, por ejemplo, plaquetas, a través del uso de una segunda partícula de "referencia" suspendida en el fluido (por ejemplo, glóbulos rojos). La partícula de "referencia" difiere en una característica física, por ejemplo, impedancia eléctrica, de la partícula de interés y está presente a una concentración o densidad predeterminada o determinable. Se cuenta el número de glóbulos rojos, así como el número de plaquetas. Entonces, conociendo o determinando el número de glóbulos rojos en una unidad de volumen dada, puede usarse una ecuación para llegar al número de plaquetas en el mismo volumen unitario. Alternativamente, podría incluirse una partícula de referencia en la muestra a una concentración conocida, y entonces se cuenta la partícula de referencia junto con las plaquetas. Conociendo la concentración de las partículas de referencia, es posible determinar la concentración de plaquetas.

Un sistema de este tipo tal como se describe en el documento US 4.11.64 distingue entre las partículas basándose en sus características físicas, y no es susceptible de usarse para distinguir entre dos subpoblaciones del mismo tipo celular, por ejemplo células CD3+ CD4+ y CD3+ CD8+. El uso de citometría de flujo y agentes de unión a células (que pueden unirse a marcadores celulares) supera parcialmente este problema. Por tanto, la necesidad de una monitorización precisa y reproducible de los niveles de linfocitos T CD4 en pacientes infectados con VIH ha conducido a varias compañías a desarrollar métodos más sencillos para medir los recuentos absolutos de linfocitos T CD4 y CD8 (Bene et al., 1998; Denny et al., 1995; Nicholson et al., 1994; OGorman, et al., 1997; Paxton, et al., 1995).

La patente europea EP 4781 describe un método para determinar los recuentos absolutos de una población de células dentro de una muestra por medio de citometría de flujo. El método hace uso de un tubo. El tubo puede comprender un diluyente, y la muestra se añade al tubo que contiene el diluyente. Se dice que el diluyente comprende una disolución de tampón isotónico tal como solución salina tamponada con fosfato, uno o más marcadores celulares que pueden marcar células en la población de interés, un fijador tal como paraformaldehído y un número conocido de micropartículas fluorescentes.

La memoria descriptiva del documento EP 4781 prevé específicamente que el tubo pueda estar recubierto con

agentes de bloqueo tales como albúmina sérica bovina, caseína o gelatina para impedir la adhesión de los componentes del diluyente a las paredes del tubo, y que estos agentes de bloqueo puedan recubrirse sobre y secarse en el tubo usando un conservante tal como trehalosa.

En el método descrito en el documento EP 4781, la muestra se añade al tubo, y se permite que las células se marquen con los marcadores celulares. Se fija un activador de fluorescencia para incluir esencialmente todas las micropartículas y células, y se fijan una o más compuertas de fluorescencia para distinguir entre ellas. Se cuenta el número de células que coinciden con o superan el activador de fluorescencia, y se multiplica el número de células por micropartícula para cada compuerta de fluorescencia por la concentración conocida de micropartículas para llegar al recuento absoluto de células por volumen unitario. Por tanto, el conocimiento del número de células para cualquier población y número de micropartículas proporciona una razón. Conocer el número de micropartículas por volumen unitario y luego multiplicar por la primera razón proporciona el número de células en una población por volumen unitario, es decir, el recuento absoluto de las células.

Sin embargo, el método descrito en EP 4781 hace uso de tubos que contienen un gran volumen de diluyente, lo que da como resultado determinadas desventajas. El diluyente presente en los tubos descritos en el documento EP 4781 necesita un tiempo de incubación prolongado y cantidades superiores de los agentes de unión a células (y por tanto un coste superior). Además, la presencia del diluyente impide una lisis eficaz de los eritrocitos. La lisis de los eritrocitos es un procedimiento recomendado por los Centres for Disease Control and Prevention (CDC), The European Working Group on Clinical Cell Analysis (EWGCCA) y The British Committee for Standards in Haematology (BCSH) para la enumeración de células positivas para CC3-CD4.

El porcentaje de células CD4+ con respecto a la población de linfocitos total no puede determinarse usando el método descrito en el documento EP 4781 puesto que no hay ningún marcador incluido para los linfocitos totales. Esto es crucial en pacientes pediátricos en los que un recuento de CD4 no es suficiente para monitorizar la progresión de la enfermedad. Los niños menores de 5 años tienen niveles superiores de linfocitos positivos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

Método para determinar los recuentos absolutos de células por volumen unitario de una muestra, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un recipiente que contiene:

(i) una cantidad predeterminada de micropartículas; y

(ii) un agente de unión a células;

en el que las micropartículas están dispuestas en o sobre una matriz que se adhiere a al menos una pared del recipiente de manera que sustancialmente todas las micropartículas se unen de ese modo al recipiente;

(b) añadir un volumen conocido de muestra al recipiente;

(c) determinar la razón de micropartículas con respecto a células contando las micropartículas y células en un volumen de la muestra; y

(d) determinar el recuento absoluto de células multiplicando el número de células por micropartícula por la concentración de micropartículas en la muestra.

Método según la reivindicación 1, en el que la matriz retiene sustancialmente todas las micropartículas en o sobre el recipiente durante la manipulación de rutina del recipiente.

Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que las micropartículas se retienen cuando el recipiente se invierte.

Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que las micropartículas se retienen en ausencia de otros medios de retención, preferiblemente mecánicos.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las micropartículas se retienen en ausencia de una rejilla de retención en el recipiente.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la matriz comprende un hidrato de carbono, preferiblemente un azúcar o una mezcla de azúcares, un polímero o una proteína.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la matriz comprende una mezcla 1:2, 1:1 ó 2:1 de dos cualesquiera de fructosa, trehalosa y rafinosa.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la matriz está presente en una cantidad de menos de 5 mg, preferiblemente 3 mg o menos.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la matriz comprende un antioxidante, preferiblemente hidroxitolueno butilado (BHT).

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que sustancialmente todas las micropartículas se liberan de la pared del recipiente en el volumen de la muestra al añadir la muestra.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que sustancialmente todas las micropartículas están diferenciadas cuando se cuentan, preferiblemente en el que las micropartículas no forman sustancialmente dobletes o multipletes cuando se cuentan.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las células y las micropartículas se cuentan en un citómetro de flujo.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las células comprenden microorganismos, preferiblemente levaduras o bacterias.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las células comprenden linfocitos y/o la muestra comprende sangre completa no lisada.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el agente de unión a células comprende un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que puede unirse a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD1, CD13, CD14, CD15, CD16, CD19, CD2, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD56, CD57, CD64, CDw65, CD117yCD133.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la matriz y las micropartículas se depositan sobre una pared del recipiente a través de la eliminación al menos parcial del disolvente de una suspensión de

17.

micropartículas en una solución acuosa de matriz, preferiblemente mediante evaporación del disolvente.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las micropartículas comprenden perlas de poliestireno, látex, agarosa o acrilamida, preferiblemente perlas de poliestireno.

18.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que las micropartículas y el agente de unión a células pueden detectarse independientemente en virtud de que comprenden un medio de generación de señales, preferiblemente un medio de generación de señales fluorescentes.

19.

Método según la reivindicación inmediatamente anterior, en el que el medio de generación de señales fluorescentes comprende un fluorocromo seleccionado del grupo que consiste en: isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), PE-Cy5, PE-CY5.5, PE-Cy7, PE-A68, PE-TR (rojo Texas),

aloficocianina (APC), APC-CY7, azul Pacífico, amarillo cascada, colorantes Alexa, cumarinas y puntos Q.

Método según la reivindicación Inmediatamente anterior, en el que las micropartículas y el agente de unión a células se marcan con fluorocromos diferentes.

21.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente comprende más de un agente de unión a células.

22.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente comprende un anticuerpo anti-CD3 acoplado a ficoeritrina, un anticuerpo antl-CD4 acoplado a APC y un anticuerpo anti-CD45 acoplado a FITC.

23.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente comprende un anticuerpo anti-CD34 acoplado a ficoeritrina, un anticuerpo antl-CD45 acoplado a FITC o APC.

24.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente comprende yoduro de propidio y Tween.

Método según cualquier reivindicación anterior, en el que el recipiente es desechable.

26.

Método que comprende determinar un primer recuento absoluto de un tipo celular en un primer punto de tiempo mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, y determinar un segundo recuento del tipo celular en un segundo punto de tiempo.

27.

Método según la reivindicación 26, en el que el segundo recuento es un recuento absoluto del tipo celular en el segundo punto de tiempo determinado mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

28.

Método según la reivindicación 26 ó 27, en el que las muestras son del mismo individuo, preferiblemente del mismo órgano o tejido de un individuo.

29.

Método que comprende determinar un primer recuento absoluto de un primer tipo celular mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, y determinar un segundo recuento de un segundo tipo celular.

Método según la reivindicación 29, en el que el segundo recuento es un recuento absoluto del segundo tipo celular determinado mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.

31.

Método según la reivindicación 29 ó 3, en el que las muestras son del mismo individuo, preferiblemente del mismo órgano o tejido dentro de un individuo.

32.

Método según la reivindicación 29 ó 3, en el que las muestras son de individuos diferentes dentro de una población o cohorte.

33.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en el que los recuentos primero y segundo se comparan para proporcionar información sobre el estado de la o cada muestra, o el estado del o cada tejido, órgano, organismo, cohorte o población del que se deriva la muestra.

34.

Método según la reivindicación 33, en el que el estado se selecciona del grupo que consiste en: estado de salud, estado nutricional, estado mental, propensión a enfermedad, presencia o ausencia de enfermedad, presencia o ausencia de infección latente, preferiblemente infección por VIH.

35.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 34, en el que el o el primer tipo celular comprende linfocitos CD4+, opcionalmente en el que el segundo tipo celular comprende linfocitos totales, preferiblemente de la misma muestra.

36.

Método según la reivindicación 34 ó 35, en el que la infección comprende infección por VIH y/o la enfermedad comprende SIDA.