Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso.

Uso de ácidos nucleicos para la modulación de la expresión génica en respuesta a un ligando no esteroide en elque dichos ácidos nucleicos comprenden:

A) un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión sequiere modular; y

ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y

B) un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:

i) un dominio de transactivación; y

ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico que comprende, o bien(a) las hélices 1-7 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un receptor X retinoide deinvertebrado,

o bien

(b) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un receptor X retinoide deinvertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero.

Receptores X retinoides quiméricos y su uso en un sistema inducible de expresión génica basado en receptores de ecdisona novedoso 5

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biotecnología o ingeniería genética. Específicamente, la presente invención se refiere al campo de la expresión génica. Más específicamente, la presente invención se refiere a un sistema inducible de expresión génica basado en receptores X retinoides quiméricos/receptores de ecdisona novedoso y a métodos de modulación de la expresión de un gen en una célula huésped usando este sistema inducible de expresión génica.

Antecedentes de la invención La mención de cualquier referencia en el presente documento no debe considerarse una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" de la presente solicitud.

En el campo de la ingeniería genética, el control preciso de la expresión génica es una herramienta útil para el estudio, la manipulación y el control del desarrollo y otros procesos fisiológicos. La expresión génica es un proceso biológico complejo que implica una serie de interacciones proteína-proteína específicas. Para desencadenar la expresión génica, de forma que produzca el ARN necesario como la primera etapa de la síntesis de proteínas, debe aproximarse un activador de la transcripción a un promotor que controle la transcripción génica. Normalmente, el propio activador de la transcripción está asociado con una proteína que tiene al menos un dominio de unión a ADN

que se une a sitios de unión a ADN presentes en las regiones promotoras de genes. Por tanto, para que se produzca la expresión génica, una proteína que comprenda un dominio de unión a ADN y un dominio de transactivación a una distancia apropiada del dominio de unión a ADN debe situarse en la posición correcta en la región promotora del gen.

El enfoque transgénico tradicional utiliza un promotor específico de célula para dirigir la expresión de un transgén diseñado. En primer lugar, se incorpora en un genoma huésped una construcción de ADN que contiene el transgén. Cuando se desencadena por un activador de la transcripción, se produce la expresión del transgén en un tipo celular determinado.

Otro medio para regular la expresión de genes exógenos en células es por medio de promotores inducibles. Los ejemplos del uso de estos promotores inducibles incluyen el promotor PR1-a, sistemas procariotas de represoroperador, sistemas de inmunofilina inmunosupresores y sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores, tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas, y se describen a continuación.

El promotor PR1-a del tabaco se induce durante la respuesta sistémica de resistencia adquirida tras un ataque patógeno. El uso de PR1-a puede ser limitado porque, frecuentemente, responde a materiales endógenos y factores externos tales como patógenos, radiación UV-B y contaminantes. Se han descrito sistemas de regulación génica basados en promotores inducidos por choque térmico, interferón y metales pesados (Wurn et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5414-5418; Arnheiter et al., 1990, Cell 62: 51-61; Filmus et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:

27550-27560) . Sin embargo, estos sistemas presentan limitaciones debido a su efecto sobre la expresión de genes que no son su objetivo. Estos sistemas también son poco consistentes.

Los sistemas procariotas de represor-operador utilizan proteínas represoras bacterianas y las secuencias de ADN de operador único a las que se unen. Tanto el sistema de represor-operador de tetraciclina ("Tet") como el de lactosa ("Lac") de la bacteria Escherichia coli se han usado en plantas y animales para controlar la expresión génica. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteína represora TetR, dando lugar a un cambio conformacional que libera la proteína represora del operador, que como consecuencia, permite que se produzca la transcripción. En el sistema Lac, se activa un operón lac en respuesta a la presencia de lactosa o análogos sintéticos tales como isopropil-b-Dtiogalactósido. Desafortunadamente, el uso de estos sistemas está restringido por la química inestable de los 55 ligandos, es decir, tetraciclina y lactosa, su toxicidad, su presencia natural o los niveles relativamente altos necesarios para la inducción o la represión. Por motivos similares, la utilidad en animales de estos sistemas es limitada.

Las moléculas inmunosupresoras tales como FK506, rapamicina y ciclosporina A se pueden unir a inmunofilinas FKBP12, ciclofilina, etc. Usando esta información se ha ideado una estrategia general para juntar dos proteínas cualesquiera simplemente situando FK506 sobre cada una de las dos proteínas o situando FK506 sobre una y ciclosporina A sobre la otra. Después, se puede usar un homodímero sintético de FK506 (FK1012) o un compuesto resultante de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) para inducir la dimerización de estas moléculas (Spencer et al., 1993, Science 262:1019-24; Belshaw et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:4604-7) . El dominio de unión a 65 ADN de Gal4 fusionado con FKBP12 y el dominio activador VP16 fusionado con ciclofilina, y el compuesto FKCsA se usaron para mostrar la heterodimerización y activación de un gen indicador bajo el control de un promotor que contiene sitios de unión a Gal4. Desafortunadamente, este sistema incluye inmunosupresores que pueden tener efectos secundarios no deseados y, por lo tanto, limita su uso para diversas aplicaciones de interruptores génicos de mamífero.

También se han empleado sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores, tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas. Los receptores de hormonas esteroideas son miembros de la superfamilia de receptores nucleares y se encuentran en células de vertebrado e invertebrado. Desafortunadamente, el uso de compuestos esteroideos que activan los receptores para la regulación de la expresión génica, en particular en plantas y mamíferos, está limitado debido a su implicación en muchas otras rutas biológicas naturales en estos organismos. Para superar estas dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo usando receptores de ecdisona (EcR) de insecto.

El crecimiento, la muda y el desarrollo de los insectos están regulados por la hormona esteroidea ecdisona (hormona de la muda) y las hormonas juveniles (Dhadialla, et al., 1998, Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569) . El objetivo molecular de la ecdisona en insectos consiste en al menos un receptor de ecdisona (EcR) y una proteína ultraespiráculo (USP) . El EcR es un miembro de la superfamilia de receptores esteroideos nucleares que se caracteriza por dominios de unión a ADN distintivo y a ligando y un dominio de activación (Koelle et al. 1991, Cell, 67:59-77) . Los receptores EcR son sensibles a una serie de compuestos esteroideos tales como ponasterona A y muristerona A. Recientemente, se han descrito compuestos no esteroideos con actividad ecdiesteroide agonista, incluidos los insecticidas comercialmente disponibles tebufenozida y metoxifenozida, que se comercializan en todo el mundo por Rohm and Haas Company (véase la solicitud de patente internacional n.º PCT/EP96/00686 y la patente de EE. UU. 5.530.028) . Ambos análogos tienen perfiles de seguridad excepcionales para otros organismos.

Las solicitudes de patente internacional N.º PCT/US97/05330 (documento WO 97/38117) y PCT/US99/08381

(documento WO 99/5815) divulgan métodos para modular la expresión de un gen exógeno en los que una construcción de ADN que comprende el gen exógeno y un elemento de respuesta a ecdisona se activa por una segunda construcción de ADN que comprende un receptor de ecdisona que, en presencia de un ligando para ello, y opcionalmente en presencia de un receptor que puede actuar como compañero silencioso, se une al elemento de respuesta a ecdisona para inducir la expresión génica. El receptor de ecdisona elegido se aisló a partir de Drosophila melanogaster. Normalmente, estos sistemas requieren la presencia de un compañero silencioso, preferentemente un receptor X retinoide (RXR) , para proporcionar una activación óptima. En células de mamífero, el receptor de ecdisona de insecto (EcR) forma un heterodímero con el receptor X retinoide (RXR) y regula la expresión de genes objetivo de manera dependiente de ligando. La solicitud de patente internacional N.º PCT/US98/14215 (documento WO 99/02683) divulga que el receptor de ecdisona aislado a partir de la polilla de seda Bombyx mori es funcional en sistemas de mamífero sin necesidad de un compañero de dímero exógeno.

La patente de EE. UU. N.º 5.880.333 divulga un sistema de heterodímero... [Seguir leyendo]

1. Uso de ácidos nucleicos para la modulación de la expresión génica en respuesta a un ligando no esteroide en el que dichos ácidos nucleicos comprenden: A) un primer polinucleótido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y B) un segundo polinucleótido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de transactivación; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico que comprende, o bien

(a) las hélices 1-7 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un receptor X retinoide de invertebrado,

o bien

(b) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un receptor X retinoide de invertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichos ácidos nucleicos comprenden además un tercer polinucleótido en el que dicho tercer polinucleótido comprende: i) un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación de dicho segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular.

3. Uso de polipéptidos para la modulación de la expresión génica en respuesta a un ligando no esteroide en el que dichos polipéptidos comprenden: A) un primer polipéptido híbrido que comprende: i) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; y ii) un dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona; y B) un segundo polipéptido híbrido que comprende: iii) un dominio de transactivación; y iv) un dominio de unión a ligando de receptor X retinoide quimérico que comprende, o bien

(a) las hélices 1-7 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 8-12 de un receptor X retinoide de invertebrado,

o bien

(b) las hélices 1-8 de un receptor X retinoide de vertebrado y las hélices 9-12 de un receptor X retinoide de invertebrado, en el que el invertebrado es una especie que no es díptero ni es lepidóptero.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichos polipéptidos codificados por dichos ácidos nucleicos modulan la expresión génica mediante interacción con polinucleótidos que comprenden: i) un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se quiere modular; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación de dicho segundo polipéptido híbrido; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular.

5. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el dominio de unión a ligando (LBD) de receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido es bien un LBD de EcR del gusano de las yemas de la pícea Choristoneura fumiferana ("CfEcR") o bien un LBD de EcR de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster ("DmEcR") ,

6. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 65 (CfEcR-DEF) , SEQ ID NO: 59 (CfEcR- CDEF) y SEQ ID NO: 67 (DmEcR-DEF) .

7. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el dominio de unión a ligando de receptor de ecdisona del primer polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 57 (CfEcR-DEF) , SEQ ID NO: 58 (DmEcR-DEF) y SEQ ID NO: 70 (CfEcR-CDEF) .

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, el que el dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico del segundo polipéptido híbrido está codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo que consiste en a) los nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótido.

33. 630 de la SEQ ID NO: 21, y b) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótido.

40. 630 de la SEQ ID NO: 21.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico del segundo polipéptido híbrido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del

grupo que consiste en: a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 19 y los aminoácido.

11. 210 de la SEQ ID NO: 27, y b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 19 y los aminoácido.

13. 210 de la SEQ ID NO: 27.

10. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho primer polinucleótido codifica, o dicho primer polipéptido híbrido comprende un domino de unión a ADN seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a ADN GAL4 y un dominio de unión a ADN LexA, y un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho segundo polinucleótido codifica, o dicho segundo polipéptido híbrido comprende, un dominio de transactivación seleccionado del grupo que consiste en un dominio de transactivación VP16 y un dominio de transactivación activador ácido B42, y un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico.

12. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho segundo polinucleótido comprende secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consiste en un AD de VP16 (SEQ ID NO: 51) y un AD de B42 (SEQ ID NO: 53) que codifican dicho dominio de transactivación y secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas del grupo que consiste en: a) los nucleótidos 1-408 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótido.

33. 630 de la SEQ ID NO: 21, y b) los nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 13 y los nucleótido.

40. 630 de la SEQ ID NO: 21 que codifican dicho dominio de unión a ligando del receptor X retinoide.

13. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en el que dicho segundo polipéptido híbrido comprende un dominio de transactivación que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en un AD de VP16 (SEQ ID NO: 52) y un AD de B42 (SEQ ID NO: 54) y comprende un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico que comprende secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

a) los aminoácidos 1-136 de la SEQ ID NO: 19 y los aminoácido.

11. 210 de la SEQ ID NO: 27, y b) los aminoácidos 1-155 de la SEQ ID NO: 19 y los aminoácido.

13. 210 de la SEQ ID NO: 27.

14. Uso de los ácidos nucleicos o polipéptidos tal como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la modulación de la expresión de un gen en una célula huésped en el que:

a) los polinucleótidos o los polipéptidos tal como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 se introducen o se expresan en la célula huésped; y b) se introduce un ligando en la célula huésped; en el que el gen que se quiere modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN en una de dichas uniones de polipéptido híbrido; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación en uno de dichos polipéptidos híbridos; y iii) un gen cuya expresión se quiere modular; de modo que después de la introducción del ligando en la célula huésped, se modula la expresión del gen.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que el ligando es un compuesto de la fórmula:

en la que:

E es un alquilo (C4-C6) que contiene un carbono terciario o un cianoalquilo (C3-C5) que contiene un carbono 45 terciario;

R1 es H, Me, Et, i-Pr, F, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1propinilo, 2-propinilo, vinilo, OH, OMe, OEt, ciclopropilo, CF2CF3, CH=CHCN, alilo, azido, SCN o SCHF2;

R2 es H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1propinilo, 2-propinilo, vinilo, Ac, F, CI, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3 OCF2CF2H, COEt, ciclopropilo, CF2CF3 CH=CHCN, alilo, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, o está unido a R3 y los carbonos de fenilo a los que están enlazados R2 y R3 formando un etilendioxilo, un anillo de dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo de dihidropirilo con el oxígeno adyacente a 55 un carbono de fenilo;

R3 es H, Et, o está unido a R2 y los carbonos de fenilo a los que están enlazados R2 y R3 formando un etilendioxilo, un anillo de dihidrofurilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo o un anillo de dihidropirilo con el oxígeno adyacente a un carbono de fenilo;

R4, R5 y R6 son independientemente H, Me, Et, F, CI, Br, formilo, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, C=CH, CH, 1-propinilo, 2-propinilo, vinilo, OMe, OEt, SMe o SEt.

16. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que dichos ácidos nucleicos o polipéptidos modulan una magnitud de inducción aumentada en comparación con la inducción modulada usando ácidos nucleicos que codifican, o polipéptidos que comprenden, un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide de vertebrado no quimérico.

17. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el gen cuya expresión se modula es un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en a) un anticuerpo, b) una enzima, c) una proteasa, d) una citosina, e) un interferón, f) insulina, g) eritropoyetina, h) un factor sanguíneo, i) un factor de coagulación.