Reactor de flujo de vórtices para la adsorción y purificación de biomoléculas.

Reactor de flujo de vórtices para la adsorción y purificación de biomoléculas.

La invención consiste en la construcción de un reactor de flujo de vórtices para ser utilizado en la cromatografía de adsorción de biomoléculas en lecho expandido y elución de las mismas

, partiendo de un alimento, caldo de cultivo o extracto biológico sin clarificar.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201301126.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE ALMERIA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: IBAÑEZ GONZALEZ,MARIA JOSE, MOLINA GRIMA,EMILIO, MAZZUCA SOBCZUK,Tania, REDONDO MIRANDA,Rosa María, COONEY,Charley L, ORTEGA RUIZ,José, TORRES CASTAÑEDA,Juan.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por separación... > G01N30/60 (Preparación de la columna)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > SEPARACION (separación de sólidos por vía húmeda... > Procedimientos de separación que implican el tratamientos... > B01D15/22 (relativo a la estructura de la columna)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > SEPARACION (separación de sólidos por vía húmeda... > Procedimientos de separación que implican el tratamientos... > B01D15/18 (relativo a la configuración de los flujos)
  • SECCION B — TECNICAS INDUSTRIALES DIVERSAS; TRANSPORTES > PROCEDIMIENTOS O APARATOS FISICOS O QUIMICOS EN GENERAL > SEPARACION (separación de sólidos por vía húmeda... > Procedimientos de separación que implican el tratamientos... > B01D15/10 (caracterizados por características funcionales o de construcción)
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Reactor de flujo de vórtices para la adsorción y purificación de biomoléculas.

Fragmento de la descripción:

los adsorbentes cromatográficos más utilizados para obtener lechos expandidos estables.

Las patentes US 5, 522, 993 y US 6, 783, 962 describen las partículas de adsorción cromatográficas comercializadas por la empresa CE Healthcare y Upfront Chromatography, respectivamente. Ambos tipos de resinas se caracterizan por tener una densidad superior a la del agua, lo que permite que puedan ser fluidizadas, permaneciendo en el interior de la columna. Las resinas comercializadas por Upfront son más resistentes físicamente, de un tamaño más pequeño y de mayor densidad que las resinas Streamline.

Las resinas comercializadas por Upfront Chromatography son muy resistentes a la ruptura siendo utilizadas en un tipo de columna también patentada y comercializada por la empresa Upfront Chromatography. Esta invención se describe en la solicitud de patente U.S 2006/0060533. Las columnas Upfront llevan en la base un distribuidor de aspas que gira para producir la mezcla. Las aspas tienen orificios por donde sale el extracto biológico. El giro de las aspas evita la formación de canales preferentes y permite la utilización de extractos sin centrifugar. La desventaja de la resina Upfront es su coste elevado, lo que hace que se utilicen más las resinas Streamline en el proceso de adsorción en lecho expandido en columna de plato poroso. Una desventaja de la resina Streamline es que no puede ser utilizada con extractos biológicos sin clarificar, debido a que el plato poroso se obstruiría. Otra desventaja de las resinas Streamline es su fragilidad, no pueden ser utilizadas en las columnas diseñadas por Upfront Chromatography, se romperían con el giro de las aspas.

El flujo de vórtices de Taylor fue descrito por primera vez por Taylor (Taylor, C.I. 1923. Stability of a viscous liquid contained between two rotating cylinders) . Taylor estudia el movimiento de un fluido en la zona anular entre dos cilindros concéntricos. Analizó el movimiento del fluido en función de la rotación de ambos cilindros a la vez o el movimiento de uno solo estando el otro fijo. Taylor demostró la existencia del flujo de vórtices en la zona anular cuando el cilindro externo permanecía estacionario y se movía solo el cilindro interno.

Un aumento de la velocidad angular (ro) del cilindro interno va acompañada de diferentes patrones de flujo que vienen caracterizados por un número adimensional, conocido como número de Taylor, Ta. Además de la velocidad angular del cilindro interno, el número de Taylor depende de la viscosidad cinemática del fluido (v) , del radio externo del cilindro interno (r¡) y del ancho de la zona anular (d) de acuerdo con la siguiente ecuación:

' (jJ. r . d

Ta =

I

V

• donde d = re -r¡

• siendo re el radio interno del cilindro externo y r¡ el radio externo del cilindro interno.

A bajas velocidad rotacionales, el movimiento del cilindro interno provoca un movimiento del fluido tangencial en la zona anular, un flujo de cizalla llamado laminar de Couette. Si la velocidad rotacional del cilindro interno se incrementa por encima de un nivel crítico, el movimiento del fluido deja de ser tangencial para ser toroidal, llamado flujo de vórtices. Aparecen alternativamente vórtices toroidales que rotan en sentido opuesto. Estos vórtices llamados vórtices de Taylor son rotacionalmente simétricos y tienen forma de "donuts" teniendo de diámetro aproximadamente el mismo del ancho de la zona anular.

Si el reactor de Taylor está provisto de una entrada y salida para el flujo axial el resultado es un reactor de flujo de vórtices de Taylor. A medida que aumente el número de Taylor por encima del valor crítico van apareciendo distintos patrones de flujo: flujo de vórtices de Taylor cuando la relación Ta/Tac es menor de 15, flujo de vórtices ondulado yen espiral cuando Ta/Tac está comprendido entre 15 y 30, flujo de vórtices turbulento cuando la relación T a/Tac es entre 30 y 160 Y flujo turbulento cuando la relación Ta/Tac es superior a 250. El valor del número de Taylor crítico, TaCl viene dado por la siguiente ecuación (Lee, S. and Lueptow, R.M. 2001. Rotating reverse osmosis: a dynamic model for flux and rejection. Journal of Membrane Science. 192: 129-143) :

d) O'S [d) O'S [d) l'S

Tac = 41, 02· r¡ + 25, 75· r¡ + 1, 85· r¡

[

La utilización del reactor de flujo de vórtices para la adsorción de biomoléculas se inicia a principios de los noventa (Moore C.M.V. 1994. Characterization of a Taylor-Couette vortex flow reactor, páginas 190-195, Tesis doctoral, Massachusetts Institute Technology) . En este trabajo se llegó a trabajar con un 50% de adsorbente con respecto al volumen del reactor, pero hubo importantes problemas de bloqueo del adsorbente a la salida del reactor. Diez años más tarde, se utilizó el reactor de flujo de vórtices para obtener a1-antitripsina recombinante humana a partir de un cultivo de Escerichia Coli clarificado en el que se había expresado (Ma, J. y Cooney, c.L. 2004. Application of Vortex Flow Adsorption Technology to Intein-Mediated Recover y of Recombinant Human a1-Antitr y psin. Biotechnol. Pro: 20, 269-276) . Para evitar el arrastre de la resina diseñaron una salida del reactor que ocupaba toda la zona anular del tope del reactor, haciendo disminuir el flujo axial a la salida. Utilizaron solo un 5% del volumen del reactor con adsorbente, por lo que obtuvieron una pobre productividad. En ambos trabajos la suspensión de la resina es debida a la velocidad rotacional del cilindro interno y no a la velocidad axial. En ambos casos era necesaria la presencia de una membrana de nylon a la salida del reactor para evitar la salida de adsorbente, lo que les impedía poder trabajar con caldos de cultivo o extractos biológicos sin clarificar. En ambos trabajos las productividades obtenidas fueron bajas al ser bajo el volumen de adsorbente empleado.

Se solucionaron los problemas de bloqueo de la resina a la salida el reactor cambiando las variables de operación del reactor de flujo de vórtices (IbáñezGonzález, M.J. y Cooney, Cl. 2007 Studies on protein adsorption in a vortex flow reactor. Process Biochemistr y 42: 1592-1601) . la expansión del lecho en este trabajo es debida a la velocidad axial y no a la velocidad rotacional. Si solo hubiera rotación el adsorbente se quedaría en la base del reactor. A pesar de poder aumentar el porcentaje de adsorbente en el interior del reactor, cuando realizaron la adsorción en lecho expandido con una proteína patrón, obtuvieron una pobre adsorción acompañada de productividades bajas.

los trabajos mencionados anteriormente han utilizado el reactor de flujo de vórtices para la adsorción de biomoléculas, pero en ningún caso se ha descrito un reactor con las características de la presente invención. Ni tampoco se ha descrito antes de la invención un reactor de flujo de vórtices que haya utilizado como alimento un caldo de cultivo sin clarificar.

la invención que se propone pretende solucionar los problemas encontrados en la literatura. Y se caracteriza por la construcción de un reactor de flujo de vórtices en el que se puede llevar a cabo de forma eficaz la adsorción de las biomoléculas de interés a partir de caldos de cultivo sin clarificar y extractos proteicos en lecho expandido.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

la invención consiste en la construcción de un reactor de flujo de vórtices para la adsorción de biomoléculas (Figura 1) Y elución de las mismas. la invención está formado por:

a) Un cuerpo interno que gira (1) . De forma cilíndrica y hueco por dentro para ser más liviano. Este cuerpo está fabricado en acero inoxidable para ser totalmente recto y dar inercia al giro. Está sujeto a la base del reactor (3) mediante un cojinete...

 


Reivindicaciones:

1. Reactor de flujo de vórtices para la adsorción y purificación de biomoléculas, a partir de un alimento, caldo de cultivo o extracto biológico sin clarificar, que comprende: a) Un cuerpo interno que gira (1) , de forma cilíndrica y hueco por dentro para ser más liviano. El cuerpo interno está fabricado en acero inoxidable para ser totalmente recto y dar inercia al giro. Sujeto a la base del reactor (3) mediante un cojinete (9) y por su parte superior a un motor (10) . b) Un cuerpo estacionario externo (2) , que se coloca de forma concéntrica al cuerpo interno (1) Y está fabricado de material transparente y con forma cilíndrica. Entre la pared externa del cuerpo interno y la pared interna de dicho cuerpo externo existe un espacio anular (14) rellenado por la resina adsorbente y donde se produce la adsorción de la biomolécula de interés en lecho expandido y la elución de la misma en lecho sedimentado. En la pared exterior del cuerpo externo (2) se sitúan válvulas de salida (8) cada 2 cm a partir de una altura de 15 cm desde la base del reactor. c) Un sistema de medida (13) que se coloca en la pared externa del cuerpo externo. d) Una tapa superior (11) que soporta al cuerpo interno y se deja apoyar en el cuerpo externo uniéndose a él mediante una abrazadera (12) . e) Una válvula de entrada de alimento en el proceso de adsorción (4) , que se encuentra en la parte inferior de la carcasa externa, 2 milímetros por encima de la base del reactor (3) , una válvula para retirar la resina adsorbente (5) y una válvula de salida en el proceso de elución (6) en la que está colocada una membrana de nylon (7) para evitar la salida de la resina adsorbente.

f) Un motor (10) responsable del giro del cilindro interno (1) que regula la velocidad de giro. Cuando la rotación del cilindro interno supera un valor crítico se forman los vórtices toroidales que se solapan al flujo principal y rellenan el espacio anular (14) entre ambos cuerpos interno y externo. El valor del número de Taylor está comprendido entre el valor del T ac y 1 5 veces su valor.

g) La relación geométrica entre el radio externo del cuerpo interno (r) y el radio interno del cuerpo externo (re) es:

=.i estando su valor comprendido entre 0, 1 t 0, 99. re La relación de aspecto entre la longitud del reactor (L) y la anchura del espacio anular (14) es:

r = ~ estando su valor comprendido entre 10 a 500.

2. Un reactor de acuerdo a la reivindicación 1 donde la resina adsorbente es colocada en el espacio anular (14) , estando en suspensión durante el proceso de adsorción.

3. Un reactor de acuerdo a la reivindicación 1 donde la resina adsorbente comprende agarosa, cuarzo y un adsorbente seleccionado del grupo compuesto por un intercambiador iónico, un adsorbente de afinidad y un adsorbente hidrofóbico.

4. Un reactor de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizado por que dicho adsorbente de intercambiador iónico se selecciona del grupo compuesto por DEAE y SP.

5. Un reactor de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizado por que dicho adsorbente de afinidad se selecciona del grupo compuesto por un agente quelante, heparina y rproteína A.

6. Un reactor de acuerdo a la reivindicación 1 donde la relación de los radios es entre 0, 3 y 0, 9 Y la relación de aspecto entre 50 y 250.

7. Un reactor de acuerdo a la reivindicación 1 donde el número de Taylor está comprendido entre Tac y 5 veces el Tac.

8. Un procedimiento que emplea el reactor de flujo de vórtices de la reivindicación 1 para la adsorción y purificación de biomoléculas a partir de un alimento, caldo de cultivo o extracto biológico sin clarificar caracterizado por que comprende las siguientes etapas: a) Se introduce la resina adsorbente en la zona anular del reactor utilizándose una válvula de salida (8) hasta la altura deseada indicada por el sistema de medida (13) . b) Se bombea la disolución tampón por la válvula de entrada (4) hasta obtener un lecho expandido inestable. c) Se hace girar el cilindro interno (1) por encima del valor crítico apareciendo vórtices toroidales que ocupan la zona anular (14) favoreciendo la formación de un lecho expandido estable. d) La salida del reactor (8) se sitúa entre 2 y 4 cm por encima del tope del lecho expandido a través de otra bomba peristáltica que opera a la misma velocidad, siendo el flujo de salida llevado a un colector de tubos.

e) Una vez estabilizado el lecho, se cambia el tampón de equilibrio por el alimento para que se produzca la adsorción en lecho expandido de la biomolécula de interés. La presencia de los vórtices mejora el contacto entre el fluido y la resina adsorbente mejorando la adsorción. Para los alimentos pseudoplásticos adicionalmente se puede variar la viscosidad con la rotación del cilindro interno. Un aumento de la rotación produce una disminución de la viscosidad y de la resistencia externa entre la biomolécula de interés y la resina adsorbente mejorándose la adsorción.

f) Una vez adsorbida la biomolécula de interés se cambia el alimento por disolución tampón de equilibrio para eliminar los restos celulares y biomoléculas no adsorbidas que puedan quedar entre las partículas de resina adsorbente.

g) Para iniciar el proceso de elución, se para la rotación del cilindro interno y la bomba peristáltica de entrada. La resina adsorbente sedimenta. La bomba de salida se sitúa entre 2 y 4 cm por encima de la parte superior del lecho sedimentado y se cambia de sentido, convirtiéndose en bomba de entrada del tampón de elución.

h) La elución de la biomolécula de interés se realiza a través de la válvula (6) que tiene el orificio cubierto con una membrana de nylon para evitar la salida de la resina. La elución es llevada a un colector de tubos con ayuda de una bomba peristáltica.