REACTIVOS DE MARCAJE, PROCEDIMIENTOS DE SINTESIS DE DICHOS REACTIVOS Y PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE MOLECULAS BIOLOGICAS.

Reactivo de marcaje estable a la temperatura de fórmula (0):

Reactivos de marcaje, procedimientos de síntesis de dichos reactivos y procedimiento de detección de moléculas biológicas.

La presente invención se refiere a nuevos reactivos de marcaje de moléculas biológicas, a un procedimiento de síntesis de dichos marcadores, así como a unas aplicaciones para el marcaje de moléculas biológicas en particular en el campo del diagnóstico por sondas nucleicas.

El estado de la técnica muestra que existen numerosos métodos para marcar unos nucleótidos, unos oligonucleótidos o unos ácidos nucleicos.

Un primer método consiste en fijar el marcador en la base, ya sea ésta natural o modificada. Un segundo método propone fijar el marcador en el azúcar, en este caso también, ya sea natural o modificado. Un tercer método tiene por objeto la fijación del marcador sobre el fosfato.

El marcaje en la base ha sido utilizado en particular en el enfoque de marcaje de los ácidos nucleicos por incorporación de nucleótidos directamente marcados.

El marcaje sobre el azúcar se utiliza frecuentemente en el caso de las sondas nucleicas preparadas por síntesis química.

El marcaje sobre el fosfato ha sido utilizado asimismo para introducir unos brazos funcionalizados y unos marcadores durante la síntesis química de los oligonucleótidos.

De hecho, el experto en la materia, que debe efectuar un marcaje de un nucleótido, o de un análogo de nucleótido o de un ácido nucleico, es propenso a efectuar esta fijación en la base o en el azúcar que le ofrece más comodidad y alternativas. Es de hecho lo que se desprende del estudio de numerosos documentos, tales como EP-A-0 329 198, EP-A-0 302 175, EP-A-0 097 373, EP-A-0 063 879, US-A-5.449.767, US-A-5.328.824, WO-A-93/16094, DE-A-3 910 151, EP-A-0 567 841 para la base o EP-A-0 286 898 para el azúcar.

La fijación del marcador en el fosfato es una técnica más compleja que la técnica que consiste en funcionalizar la base o el azúcar y ha sido mucho menos utilizada en particular debido a la baja reactividad del fosfato (véase por ejemplo Jencks W.P. et al. J. Amer. Chem Soc., 82, 1778-1785, 1960). Asimismo, en la revisión de O'Donnel y Mc Laughlin ("Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure", p. 216-243, en "Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids", Ed. Hecht S.M., Oxford University Press, 1996) que se refiere a los métodos de introducción de sondas en los fragmentos de oligonucleótidos, la alquilación eficaz del fosfodiéster internucleotídico está considerada como imposible.

La solicitud de patente WO-A-99/65926 describe un procedimiento de marcaje de un ácido ribonucleico (ARN) de síntesis o natural que consiste en fragmentar el ARN y en marcar a nivel del fosfato terminal. Este documento describe un cierto número de funciones que se pueden utilizar para el marcaje en relación con la fragmentación tales como las funciones hidroxilo, amina, hidrazina, alcoxiamina, halogenuro de alquilo, halogenuro de alquilo de tipo bencílico y en particular el derivado 5-(bromometil)fluoresceína. Estas funciones permiten marcar los ácidos nucleicos, pero se necesita asociar una etapa de fragmentación para obtener un marcaje eficaz debido a que este marcaje se produce sobre el fosfato liberado durante la fragmentación. Además, se necesita añadir un exceso importante de reactivo de marcaje con relación al ARN para obtener un marcaje eficaz, lo que induce unos problemas de ruido de fondo generados por el marcador en exceso. Por último, este método no funciona eficazmente sobre ADN bicatenario.

Por último, Masanobu Shiga et al. dan a conocer en dos artículos ("Fluorescence detection of DNA using a novel peroxidase substrate, 4-(4-hydroxyphenylcarbamoyl)butanoic acid", Analytical Siences, vol. 11, nº 4, 1995, páinas 591-595; y "Synthesis of a novel biotin derivative that bears a diazo group as the reactive site", Analytical Sciences, vol. 9, nº 4, 1993, páginas 553-556) la utilización de la diazobiotina como agente de marcaje de ADN. Sin embargo, este reactivo de marcaje adolece de la desventaja de ser poco estable en el tiempo.

Por lo tanto, existe una necesidad para nuevos reactivos que sean eficaces desde el punto de vista del rendimiento de marcaje, que sean específicos a nivel de la posición de marcaje y en particular que no afecten a las propiedades de hibridación de las bases implicadas en la formación de la doble hélice, por medio de unos enlaces hidrógenos, que se puedan utilizar al mismo tiempo para el ADN como para el ARN, y por último que permitan marcar indiferentemente unos nucleótidos, unos oligonucleótidos, unos ácidos nucleicos naturales o preparados mediante amplificación enzimática.

La presente invención describe nuevos marcadores que responden a las condiciones citadas anteriormente y que utilizan la función diazometilo como función reactiva para el marcaje.

La función diazometilo (de fórmula -C(N₂)-) ya ha sido utilizada para la alquilación de los grupos fosfato, pero se plantean un cierto número de problemas. Por un lado, los derivados diazo en general son inestables por sí mismos, lo que plantea unos problemas para la utilización de estos reactivos de marcaje en un kit de marcaje y, por otro lado, el producto de acoplamiento es inestable, lo que es redhibitorio si el producto marcado tiene la función de demostrar la presencia de una molécula diana biológica en una muestra cualquiera.

Por último, los derivados que contienen la función diazometilo son insolubles en el agua, lo que conduce a utilizar unas condiciones bifásicas para el acoplamiento con unas moléculas biológicas, que son solubles y estables sólo en el agua o en unos tampones acuosos, pero estas condiciones ralentizan la velocidad de reacción y por lo tanto perjudican la eficacia del acoplamiento.

Los nuevos reactivos de marcaje de la presente invención resuelven asimismo estos problemas técnicos.

Según un primer modo de realización, la presente invención describe un reactivo de marcaje estable a la temperatura de fórmula (0):

en la que:

Según un segundo modo de realización, la presente invención describe un reactivo de marcaje estable a la temperatura de fórmula (1):

en la que:

 

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Reivindicaciones:

1. Reactivo de marcaje estable a la temperatura de fórmula (0):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1,
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo,
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es un número entero comprendido entre 0 y 2, preferentemente 0 ó 1, y
• -Y-X- representa -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, -CH₂S-, y
• estando el sustituyente que contiene la función diazo en posición orto o meta.

2. Reactivo de marcaje según la reivindicación 1, de fórmula (1):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1,
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo, y
• -Y-X- representa -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, -CH₂S-.

3. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de fórmula (2):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1, y
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo.

4. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de fórmula (3):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1, y
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo.

5. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de fórmula (4):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1, y
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo.

6. Reactivo según la reivindicación 1, de fórmula (21):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1,
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es igual a 1, y
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo.

7. Reactivo según la reivindicación 1, de fórmula (22):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1,
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es igual a 1, y
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR siendo R = alquilo o arilo.

8. Reactivo según la reivindicación 1, de fórmula (23):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1,
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es igual a 1, y
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo.

9. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, OCH₃, -CO-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₃-CH₂-NH-R², -CO-NH-(CH₂)₃-(O-CH₂-CH₂)₄-CH₂-NH-R².

10. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (2'):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica, y
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1.

11. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 6, de fórmula (24):

en la que:

• R¹ representa H o un grupo alquilo, arilo o arilo sustituido,
• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica, y
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es igual a 1.

12. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la estructura R²-(L)_n- es de fórmula (5):

en la que:

• R² representa un marcador detectable,
• m es un número entero comprendido entre 1 y 100, y
• p es un número entero comprendido entre 1 y 10.

13. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, de fórmula (6):

en la que:

• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí mediante por lo menos una estructura multimérica,
• R³ representa H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1, y
• -Y-X- representa -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, -CH₂S-.

14. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, de fórmula (25):

en la que:

• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• R³ representa H, NO₂, Cl, Br, F, I, R²-(L)_n-Y-X-, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R= alquilo o arilo,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1,
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es igual a, y
• -Y-X- representa -CONH-, -NHCO-, -CH₂O-, -CH₂S-.

15. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (14):

en la que:

• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n es un número entero igual a 0 ó 1.

16. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 6, de fórmula (26):

en la que:

• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es igual 1, y
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1.

17. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (15):

en la que:

• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica, y
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes, y n es un número entero igual a 0 ó 1.

18. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 6, de fórmula (27):

en la que:

• R² representa un marcador detectable o por lo menos dos marcadores detectables enlazados entre sí por lo menos por una estructura multimérica,
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazo con el ciclo aromático y u es igual a 1, y
• L es un brazo de unión que comprende una cadena lineal de por lo menos dos enlaces covalentes y n es un número entero igual a 0 ó 1.

19. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque L comprende un motivo -(O-CH₂-CH₂)-, repetido 1 a 20 veces, preferentemente de 1 a 10 veces, y más preferentemente de 2 a 5 veces.

20. Procedimiento de síntesis de un reactivo de marcaje, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende las etapas siguientes:

a) disponer de un derivado de fórmula (16 bis):

en la que:
• R¹ representa H o un grupo alquilo o arilo o arilo sustituido,
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R⁶, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo,
• R⁶ representa COOH, COOM, NH₂, OH o SH, siendo M = alquilo, en particular metilo o etilo, y estando R⁶ en posición orto o meta, y
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazometilo con el ciclo aromático y u es un número entero igual a 0 ó 1,
b) disponer de un marcador o de un precursor de marcador que presenta una función reactiva R⁷ complementaria de R⁶,
c) hacer reaccionar juntas la función complementaria de dicho marcador o precursor de marcador con la función R⁶ del derivado de fórmula (16 bis) en presencia de por lo menos un agente de acoplamiento para formar un enlace covalente,
d) hacer reaccionar la hidrazina o uno de sus derivados sobre la función cetona o aldehído para formar una hidrazona, y
e) transformar la hidrazona en función diazometilo con la ayuda de un tratamiento apropiado.

21. Procedimiento de síntesis de un reactivo de marcaje, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende las etapas siguientes:

a) disponer de un derivado de fórmula (16 bis):

en la que:
• R¹ representa H o un grupo alquilo o arilo o arilo sustituido,
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R⁶, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo,
• R⁶ representa COOH, COOM, NH₂, OH o SH, siendo M = alquilo, en particular metilo o etilo, y estando R⁶ en posición orto o meta, y
• A es un brazo de unión que comprende por lo menos un doble enlace covalente que permite la conjugación de la función diazometilo con el ciclo aromático y u es un número entero igual a 0 ó 1,
b) disponer de un brazo de unión L que presenta por lo menos dos funciones reactivas R⁸ idénticas o diferentes, la primera función R⁸ complementaria de R⁶ y la segunda función R⁸ complementaria de R⁷, y disponer además de un marcador o de un precursor de marcador que presenta una función reactiva R⁷,
c) hacer reaccionar la primera función reactiva R⁸ del brazo de unión L con el derivado de fórmula (16 bis) en presencia de por lo menos un agente de acoplamiento para formar un enlace covalente, y después hacer reaccionar la segunda función reactiva R⁸ del brazo de unión L con el marcador o con el precursor de marcador en presencia de por lo menos un agente de acoplamiento para formar un enlace covalente.
d) hacer reaccionar la hidrazina o uno de sus derivados sobre la función cetona o aldehído para formar una hidrazona, y
e) transformar la hidrazona en función diazometilo con la ayuda de un tratamiento apropiado.

22. Procedimiento se síntesis según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque comprende

• una etapa suplementaria de protección de la función cetona o aldehído del compuesto (16 bis), y
• una etapa suplementaria ulterior de desprotección de dicha función cetona o aldehído.

23. Procedimiento de síntesis según la reivindicación 20, caracterizado porque consiste en efectuar las etapas siguientes:

a) disponer de un derivado de fórmula (16):

en la que:
• R¹ representa H o un grupo alquilo o arilo o arilo sustituido,
• R³ y R⁴ representan independientemente entre sí: H, NO₂, Cl, Br, F, I, R⁶, OR, SR, NR₂, R, NHCOR, CONHR, COOR, siendo R = alquilo o arilo, y
• R⁶ representa COOH, NH₂, OH o SH.
b) disponer de un marcador o de un precursor de marcador que presenta una función reactiva R⁷ complementaria de R⁶,
c) hacer reaccionar juntas la función complementaria de dicho marcador o precursor de marcador con la función R⁶ del derivado de fórmula (16) en presencia de por lo menos un agente de acoplamiento para formar un enlace covalente,
d) hacer reaccionar la hidrazina o uno de sus derivados cetona o aldehído para formar una hidrazona, y
e) transformar la hidrazona en función diazometilo con la ayuda de un tratamiento apropiado.

24. Procedimiento de síntesis de un reactivo de marcaje según la reivindicación 10, que comprende las etapas siguientes:

a) disponer de un derivado de fórmula (17):

en la que R¹ representa H o un grupo alquilo o arilo o arilo sustituido, y el grupo amino está en posición orto o meta,
b) disponer de un marcador o de un precursor de marcador que presenta una función ácido carboxílico,
c) hacer reaccionar juntas la función carboxílica de dicho marcador o precursor de marcador y la función amina primaria del derivado de fórmula (17) en presencia de por lo menos un agente de acoplamiento para formar una unión amida,
d) hacer reaccionar hidrazina sobre la función cetona o aldehído que procede del derivado de fórmula (17) para formar una hidrazona, y
e) oxidar dicha hidrazona en presencia de MnO₂ para formar una función diazometilo.

25. Procedimiento para el marcaje de una molécula biológica, en particular un ácido nucleico, que comprende la puesta en contacto en una disolución homogénea, en un tampón sustancialmente acuoso, de una molécula biológica y de un reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

26. Molécula biológica marcada susceptible de ser obtenida mediante el procedimiento según la reivindicación 25.

27. Procedimiento de marcaje y de fragmentación de un ácido nucleico mono o bicatenario que comprende las etapas siguientes:

- fragmentar el ácido nucleico,
- acoplar un marcador sobre por lo menos uno de los fragmentos por medio de un reactivo de marcaje seleccionado de entre los compuestos de fórmula (0) según la reivindicación 1:

acoplándose dicho reactivo de manera covalente y mayoritaria sobre por lo menos un fosfato de dicho fragmento.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque el reactivo de marcaje se selecciona de entre los compuestos de fórmula (1) según la reivindicación 2.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, caracterizado porque la fragmentación y el marcaje se efectúan en dos etapas.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 ó 28, caracterizado porque la fragmentación y el marcaje se efectúan en una etapa.

31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, caracterizado porque el marcaje se efectúa en una disolución homogénea sustancialmente acuosa.

32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 31, caracterizado porque la fragmentación se efectúa por vía enzimática, física o química.

33. Ácido nucleico marcado susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32.

34. Kit de detección de un ácido nucleico diana que comprende un ácido nucleico marcado según la reivindicación 33.

35. Soporte sólido sobre el cual se fija un reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

36. Procedimiento de captura de ácidos nucleicos que comprende las etapas siguientes:

• disponer de un soporte sólido sobre el cual se fija directa o indirectamente por lo menos una molécula de fórmula (0) según la reivindicación 1,
• poner en contacto una muestra biológica susceptible de contener unos ácidos nucleicos libres, y
• lavar el soporte sólido en el que la (o las) molécula(s) se fija(n) de manera covalente por lo menos a un ácido nucleico.

 

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