Reactivos para amplificar y detectar el VIH-1.

Un método para detectar la presencia del VIH-1 en una muestra de ensayo que comprende:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con reactivos de amplificación y un conjunto de cebadores que consiste en la SEC. ID. Nº. 37 y SEC. ID. Nº. 32 para formar una mezcla de reacción;

(b) poner la mezcla de reacción en condiciones de amplificación para formar un producto de amplificación; (c) formar un híbrido entre el producto de amplificación y una sonda que consiste en la SEC. ID. Nº. 55; y

(d) detectar el híbrido como una indicación de la presencia de VIH-1 en la muestra de ensayo.

Reactivos para amplificar y detectar el VIH-1

Campo de la invención La presente invención se refiere al virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) . En particular la invención se refiere a métodos para amplificar y detectar secuencias de ácidos nucleicos del VIH-1.

Antecedentes de la invención La caracterización molecular de cepas del VIH-1 recogidas por todo el mundo ha revelado una amplia diversidad genética. Basándose en análisis filogenéticos de secuencias genómicas virales, el VIH-1 se ha dividido en tres grupos distintos, M, N y O. Los virus del grupo M representan la mayoría del VIH-1 y basándose en la divergencia de secuencias se ha subdividido además en nueve clados diferenciables, denominados subtipos A, B, C, D, F, G, H, J, y K (Robertson, D.L. et al en: Human Retroviruses and AIDS 1999 -A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Kuiken, C. et. al. Eds., páginas. 492-505 (1999) ) . El patrón filogenético para los aislados del grupo M se ha descrito como una filogenia en forma de estrella con los subtipos más o menos equidistantes entre sí que al mismo tiempo divergen de un ancestro común. Para las secuencias de aminoácidos del gen de la envoltura (env) viral, el grado de divergencia intrasubtipo varía hasta un 20 % y la divergencia intersubtipo varía entre el 25 y 30 % (Sharp, P.M. et al, AIDS 8: S27-S42 (1994) ) .

En 1990, se informó de una cepa inusual del VIH-1 (ANT70) aislada de un paciente camerunés (De Leys, R. et. al.,

J. Virol. 64:1207-1216 (1990) ) . Basándose en la información de secuencias disponibles, esta cepa del virus parecía ser muy diferente de otras secuencias del VIH-1. Se aisló un virus similar (MVP-5180) de un segundo paciente camerunés (Gürtler, L. et. al., J. Virol. 68:1581-1585 (1994) ) . Una secuenciación completa del genoma reveló que aunque estos virus compartían la misma estructura genómica general con las cepas del grupo M, sus secuencias eran altamente divergentes teniendo únicamente una homología de nucleótidos de aproximadamente el 50 % con el gen env en comparación con aislados del grupo M (Gürtler, L. et. al., J. Virol. 68:1581-1585 (1994) ) . Debido al grado de divergencia genética de las cepas del grupo M, estos aislados se denominaron virus (atípicos) del grupo O. Más recientemente, en Camerún, se han identificado virus del VIH-1 que son filogenéticamente equidistantes de las cepas del grupo M y del grupo O; estas cepas se han denominado cepas del grupo N (Simon, F. et. al., Nat. Med. 4:1032-1037 (1998) ) .

Una enzima transcriptasa inversa de forma innata propensa a error, las altas cargas virales y la presión selectiva in vivo contribuyen completamente a la diversidad genética del VIH-1. Una fuente de diversidad adicional es un producto secundario del ciclo replicativo del VIH en el que dos transcritos genómicos de ARN unidos en sus extremos 5' se encapsidan en un virión. Si una célula se infecta simultáneamente con más de una cepa del VIH-1, pueden producirse viriones heterocigotos. Después de la infección con el virión, la transcriptasa puede intercambiarse de un sitio a otro entre los dos transcritos de ARN, generando un virus recombinante (Hu, W. S. y H.

M. Temin, Science 250:1227-1233 (1990) ) . Esta capacidad para recombinar proporciona una oportunidad para un cambio genético rápido y drástico. Sabino y colaboradores, que caracterizaron un mosaico B/F encontrado en dos pacientes relacionados epidemiológicamente, identificaron por primera vez un virus recombinante intersubtipo de origen natural (Sabino, E.C. et. al., J. Virol. 68:6340-6346 (1994) ) . En zonas donde circulan conjuntamente subtipos múltiples, los recombinantes intersubtipo pueden representar el 20 % o más de las infecciones por VIH-1 (Cornelissen, M. et. al., J. Virol. 70:8209-8212 (1996) ) . Aunque la mayoría de los recombinantes virales descritos hasta la fecha son mosaicos intersubtipo del grupo M, también se han identificado virus recombinantes intergrupo compuestos de segmentos de genes del grupo M y del grupo O (Peeters, M. et. al., J. de Virol. 73:7368-7375 (1999) ) .

La caracterización de genomas de longitud completa reveló que cepas de referencia de dos subtipos del grupo M previamente reconocidos eran en realidad virus recombinantes intersubtipo. Todos los representantes de las cepas del “subtipo E” secuenciadas hasta la fecha consisten en genes de ADN polimerasa (pol) dependiente de ARN y gag del subtipo A mientras que su gen env deriva del subtipo E (Gao, F. et. al., J. Virol. 70:7013-7029 (1996) ) . Desde entonces se ha demostrado que las cepas del VIH-1 previamente reconocidas como cepas del subtipo I son mosaicos triples que consisten en segmentos subgenómicos derivados de los subtipos A, G e I (Nasioulas, G. et. al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 15:745-758 (1999) ) . Dichas cepas recombinantes con confirmación de propagación epidémica se han clasificado como Formas Recombinantes Circulantes (FRC; Robertson, D.L. et In: Human Retroviruses and AIDS 1999-A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Kuiken, C. et. al. Eds., págs. 492-505 (1999) ) .

El potencial para la aparición de cepas de FRC está bien documentado. Las cepas del subtipo E, denominadas CRF01_AE, son la forma predominante del VIH-1 en Tailandia. En Kaliningrado, se ha documentado recientemente un brote de un virus recombinante A/B (CRF03_AB) en consumidores de drogas inyectables (Liltsola, K. et. al., AIDS12:1907-1919 (1999) ) . En Nigeria, Yibuti y regiones del Centro Oeste de África se ha identificado un recombinante intersubtipo A/G con un patrón de mosaico único y complejo (CRF02_AG) (Carr, J.K. et. al., Virology 247:22-31 (1998) ) .

La distribución general de los grupos, subtipos y FRC del VIH-1 varía considerablemente en regiones geográficas distintas y está sufriendo un cambio constante. Aunque el subtipo B es predominante en América del Norte y en Europa Occidental (McCutchan, F.E., AIDS 14 (suplemento 3) : S31-S44 (2000) ) , se están observando, tanto en Europa como en los Estados Unidos, números cada vez mayores de infecciones que no son del subtipo B. En Francia, durante la década que va de 1985 a 1995, la frecuencia de virus no B aumentó de aproximadamente un 4 % a más de un 20 % (Barin, F. et. al., AIDS 11:1503-1508 (1997) ) . Prácticamente en todas las regiones estudiadas se encontraron especímenes no-B reactivos. Extraordinariamente, casi todas las infecciones del subtipo M y del grupo O se presentaron en un solo hospital de París (Simon, F. et. al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 15:1427-1433 (1996) ) . El análisis de 24 pacientes alemanes recientemente infectados reveló que el 33 % estaba infectado con virus no-B; éstos incluían los subtipos A, E y C (Dietrich, U. et. al., AIDS 11:1532-1533 (1997) ) . En Bélgica se detectaron infecciones con los subtipos A, C, D, E, F, G y H que representaban más del 30 % de las infecciones totales por VIH-1 (Heyndrickx, L. et. al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 14:1291-1296 (1998) ) . También se están detectando en Estados Unidos números cada vez mayores de infecciones que no son del subtipo B, incluyendo los subtipos A, D, E, F y grupo O (Weidle, P.J. et. al., J. Infect. Dis. 181:470-475 (2000) . Por tanto, la heterogeneidad viral está aumentando en regiones en las que el subtipo B era tradicionalmente el más frecuente.

La cuantificación de ARN asociado a virión en plasma se ha convertido en un método bien establecido para el tratamiento clínico y seguimiento de pacientes con infección por VIH-1. Se han desarrollado diversas técnicas basadas en ácidos nucleicos para la detección y cuantificación de ARN viral del VIH-1 que incluyen, reacción en cadena de la polimerasa acoplada a transcriptasa inversa (RT-PCR) , amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) , y ADN ramificado (ADNr) (Mulder, J. et. al., J. Clin. Microbiol. 32:292-300 (1994) ;Kievits, T. et. al., J. Virol. Methods 35:273-286 (1991) ; Kern, D. et. al., J. Clin. Microbiol.34:3196-3202 (1996) ; Swanson P. et. al., J. Virol. Methods 89:97-108 (2000) ) . Todas estas técnicas se basan en la hibridación de oligonucleótidos con las secuencias diana. Los emparejamientos erróneos entre los cebadores/sondas y las secuencias diana tienen la posibilidad de suprimir o reducir la eficiencia de amplificación y/o detección de las secuencias diana. Por tanto, la selección de secuencias cebador y/o sonda juega un papel crítico en el rendimiento de estos ensayos.

Los ensayos originales basados en ácidos nucleicos se desarrollaron principalmente basándose en información de secuencias derivadas del VIH-1 de subtipo B común en los Estados Unidos y en Europa Occidental. La influencia de la diversidad genética del VIH-1 en la eficiencia... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia del VIH-1 en una muestra de ensayo que comprende:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con reactivos de amplificación y un conjunto de cebadores que consiste en la SEC. ID. Nº. 37 y SEC. ID. Nº. 32 para formar una mezcla de reacción;

(b) poner la mezcla de reacción en condiciones de amplificación para formar un producto de amplificación; (c) formar un híbrido entre el producto de amplificación y una sonda que consiste en la SEC. ID. Nº. 55; y

(d) detectar el híbrido como una indicación de la presencia de VIH-1 en la muestra de ensayo. 10

2. El método de la reivindicación 1, en el que el híbrido se forma y se detecta mientras que la mezcla de reacción está en condiciones de amplificación.

3. Una combinación de sonda y conjunto de cebadores del VIH-1, en la que la sonda consiste en la SEC. ID. Nº: 55 y 15 el conjunto de cebadores consiste en la SEC. ID. Nº: 37 y SEC. ID. Nº: 32.