REACTIVO PARA LA DIGESTION DE LA HEMOGLOBINA.

Método para la medición de HbA1c, comprendiendo el método las etapas siguientes: a) mezclar una muestra que contiene hemoglobina con un reactivo para la digestión de la hemoglobina

, comprendiendo el reactivo: aa) un tampón, ab) pepsina, y ac) una sal 1,3-dialquil-imidazolio de un catión 1,3dialquil-imidazolio y un contraión. b) digerir la hemoglobina durante 1 a 60 minutos, obteniendo de esta manera un fragmento de hemoglobina que comprende los 14 aminoácidos N-terminales de HbA1c, y c) medir dicho fragmento N-terminal de HbA1c

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/006413.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: HERRMANN, RUPERT, VON DER ELTZ, HERBERT, VOGT, BERND, KOBOLD, UWE, DR., DUELFFER,THOMAS.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 19 de Julio de 2007.

Fecha Concesión Europea: 14 de Julio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/72B2

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/37 (peptidasa o proteinasa)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/72 (en los que intervienen pigmentos de la sangre, p. ej. la hemoglobina, la bilirrubina)
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Fragmento de la descripción:

Introducción

La invención se refiere a un reactivo para la digestión de la hemoglobina, que comprende un tampón, pepsina y una sal 1,3-dialquil-imidazolio. También da a conocer la utilización de dicho reactivo en un método para detectar HbA1c, y un método de muestreo para la recolección de una muestra de sangre completa que comprende dicho reactivo para digerir la hemoglobina. Antecedentes de la invención

La alteración del control de los niveles circulantes de glucosa en sangre es la característica diagnóstica de la diabetes. La glucosa en sangre, en un proceso estadístico no enzimático, puede unirse a los residuos de lisina de los polipéptidos, conduciendo de esta manera a polipéptidos glucosilados. La glucosilación se observa frecuentemente en proteínas que presentan una vida media prolongada. La proteína utilizada más frecuentemente para evaluar el control de largo plazo de los niveles circulantes de glucosa en sangre es la hemoglobina.

Existen numerosos métodos para determinar la hemoglobina glucosilada. Se dividen básicamente en tres grupos dependiendo del modo en que se separan y cuantifican los componentes proteína glucosilada y no glucosilada (Goldstein D.E. et al., Clin. Chem. 32 (supl. 10):B64-B70, 1986).

El primer grupo consiste de métodos fisicoquímicos basados en la utilización de diferencias de carga. Entre

ellos se incluyen la determinación mediante HPLC con columnas intercambiadoras de cationes, tales como Diamat, MonoS y PolyCatA (método de Bisse), que son los métodos utilizados más frecuentemente en la química clínica. En el caso de la hemoglobina glucosilada, la evaluación cuantitativa habitualmente se lleva a cabo mediante una medición relativa de la señal de HbA1c en relación a la cantidad total de Hb (% de HbA1c).

Los métodos en el segundo grupo son aquellos que utilizan las diferentes reactividades químicas de las proteínas glucosilada y no glucosilada. Entre ellos se incluyen el método del ácido tiobarbitúrico, en el que, por ejemplo, la glucosa unida a la hemoglobina se convierte en un pigmento amarillo y se mide fotométricamente, y también los métodos de cromatografía de afinidad, en los que la formación de complejo entre los grupos diol vecinos del residuo azúcar y un grupo ácido bórico que se encuentra unido covalentemente a un soporte se utiliza para separar la hemoglobina glucosilada de la no glucosilada. Las clases de sustancia separadas se cuantifican fotométricamente y se calcula la cantidad relativa de hemoglobina glucosilada o, en el caso del método del ácido tiobarbitúrico, se cuantifica como determinación absoluta mediante calibración con materiales estándares adecuados.

En tercer lugar, pueden mencionarse los métodos inmunológicos. Se utilizan anticuerpos específicos en los métodos inmunológicos. Estos reconocen, por ejemplo, la unidad estructural en el extremo N-terminal de la cadena β

de la molécula de hemoglobina glucosilada que es típica para

HbA1c (por ejemplo Tina quant® HbA1c, Roche Diagnostics GmbH, Alemania). En los métodos inmunológicos, se determina el contenido absoluto de tanto HbA1c como HbA0, respectivamente. Lo anterior requiere la utilización de calibradores a los que se ha asignado una concentración diana mediante un método independiente. El contenido relativo de, por ejemplo, HbA1c no puede obtenerse mediante una medición directa.

HbA1c es la especie principal de glucohemoglobina en la sangre humana. Se ha utilizado durante prácticamente 20 años para la evaluación de largo plazo del control glucémico en pacientes diabéticos. El ensayo integral de control y complicaciones de la diabetes (DCCT) ha proporcionado amplia evidencia de que las complicaciones microvasculares, tales como la retinopatía, la nefropatía y la neuropatía se encuentran directamente relacionadas con el grado de hiperglucemia en los pacientes con diabetes dependiente de insulina (IDDM) y ha demostrado que la medición de la HbA1c en la sangre es una herramienta excelente para el seguimiento de largo plazo del estado glucémico de los pacientes diabéticos (The Diabetes Control and Complications Trial Research Group: The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus, Nathan et al., N. Engl. J. Med. 329:977-986, 1993; Santiago J.V., Diabetes 42:1549-1554, 1993; Benjamin J. y Sacks D.B., Clin. Chem. 40:683-687, 1994, y Goldstein D. et al., Clin. Chem. 40:1637-1640, 1994). El estudio del DCCT también ha

demostrado claramente la necesidad de mediciones fiables y

reproducibles de HbA1c y HbA0, la hemoglobina normal y no glucosilada, respectivamente.

Sin embargo, los métodos conocidos se asocian a varias desventajas. De esta manera, algunos de los métodos físicoquímicos presentan una selectividad muy pobre debido a que las señales medidas de proteína glucosilada se solapan con las de las variantes no glucosiladas. Las formas de los picos cromatográficos con frecuencia son asimétricas y difíciles de integrar. Las columnas intercambiadoras de cationes que se utilizan son susceptibles a pequeños cambios en las condiciones operativas y a la contaminación. Debido al bajo nivel de selectivamente, existe un riesgo elevado de medición de valores excesivamente altos (valores falsos positivos).

En el caso de los métodos químicos, resulta difícil estandarizar el procedimiento y las interferencias por parte de otros componentes que contienen azúcar únicamente pueden evitarse con grandes esfuerzos. No resulta posible diferenciar entre, por ejemplo, HbA1c y otras variantes glucosiladas de la hemoglobina.

Los métodos inmunológicos se caracterizan por una selectividad muy elevada para las variantes glucosiladas de proteína. Sin embargo, la calidad de los resultados depende de la calidad del estándar utilizado para la calibración. En la actualidad no se dispone de estándares primarios adecuados de calidad óptima, en particular para HbA1c. La información sobre las dependencias matriciales no puede obtenerse debido a la falta de un método de referencia adecuado. En este caso, con frecuencia también se obtienen

valores falsos positivos (ver, por ejemplo, Tiran A. et al.,

J. Clin. Lab. Anal 8:128-134, 1994).

Kobold U. et al. (patente US nº 5.631.140) describen un método para la detección de proteínas glucosiladas como la hemoglobina que se basa en la digestión proteolítica de proteínas comprendidas en la muestra. Seguidamente, se lleva a cabo la detección de fragmentos peptídicos mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría de masa (MS). Recientemente, Jeppsson J. O. et al., Clin. Chem. Lab. Med. 40:78-89, 2002, informaron de un método de referencia para la medición de HbA1c que ha sido aprobado por la International FEderation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC). Este método se basa en la digestión de la hemoglobina. Las formas tanto glucosilada como no glucosilada se digieren enzimáticamente y se cuantifican mediante HPLC-MS los fragmentos peptídicos N-terminales de ambas formas de hemoglobina. En el corte enzimático de la hemoglobina se utiliza la endoproteinasa Glu-C de grado de secuenciación de Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania (nº de id. 1047817). Para conseguir la digestión completa de la hemoglobina, se propone una digestión durante la noche durante, por ejemplo, 18 horas, o una digestión con tripsina durante 2 horas, respectivamente.

La tripsina corta los enlaces peptídicos con la lisina...

 


Reivindicaciones:

1. Método para la medición de HbA1c, comprendiendo el método las etapas siguientes:

a) mezclar una muestra que contiene hemoglobina con un reactivo para la digestión de la hemoglobina, comprendiendo el reactivo:

aa) un tampón,

ab) pepsina, y

ac) una sal 1,3-dialquil-imidazolio de un catión 1,3dialquil-imidazolio y un contraión.

b) digerir la hemoglobina durante 1 a 60 minutos, obteniendo de esta manera un fragmento de hemoglobina que comprende los 14 aminoácidos N-terminales de HbA1c, y

c) medir dicho fragmento N-terminal de HbA1c.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el tampón del reactivo para la digestión de la hemoglobina presenta un pH comprendido entre 1 y 4.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el tampón del reactivo para la digestión de la hemoglobina presenta una concentración de entre 10 mM y 1 M.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la pepsina contenida en el reactivo para la digestión de la hemoglobina se encuentra presente a una concentración de entre 30 y 6.000 U/ml.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los dos residuos alquilo del 1,3-dialquilimidazolio comprendido en el reactivo para la digestión de

la hemoglobina se seleccionan independientemente de entre metilo, etilo o propilo.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el contraión comprendido en el reactivo para la digestión de la hemoglobina se selecciona de entre fosfato, alquilfosfato, sulfato y alquilsulfato.

7. Utilización de una sal 1,3-dialquil-imidazolio que consiste del catión 1,3-dialquil-imidazolio y un contraión para la digestión de la hemoglobina por parte de la pepsina en la medición de HbA1c.

8. Tubo de muestreo que comprende un reactivo para la

digestión de la hemoglobina, comprendiendo el reactivo: a) un tampón, b) pepsina, y c) una sal 1,3-dialquil-imidazolio de un catión 1,3dialquil-imidazolio y un contraión.