Procedimiento de purificación del factor de coagulación VIII.

Una composición de materia que comprende un FVIII purificado recombinante que se puede obtener mediante un proceso de purificación o enriquecimiento en FVIII de coagulación que utiliza cromatografía que comprende las etapas de

- proporcionar una fracción que contiene FVIII en una solución acuosa que tiene una elevada fuerza iónica;

- poner en contacto la fracción que contiene FVIII con una resina catiónica multimodal;

- lavar la una resina catiónica multimodal que tiene adsorbido FVIII con un tampón acuoso de lavado;

- eluir la fracción que contiene FVIII tampón acuoso de elución que comprende al menos un aminoácido que está cargado positivamente a un pH 6 a 8; y

- en el que la secuencia de purificación comprende además las siguiente etapas:

i. una resina de intercambio catiónico

ii. una membrana aniónica;

iii. una etapa de inactivación química para virus de envoltura lípida;

iv. una resina de afinidad basada en un ligando proteico que consiste en un fragmento de anticuerpo expresado en levadura;

v. una etapa de eliminación de patógenos mediante filtración con un tamaño promedio de poro de aproximadamente 20 nm;

vi. una resina de intercambio aniónico;

vii. una resina para cromatografía de exclusión molecular y caracterizada porque la pureza después de la última etapa de purificación es >4000 UI/mg y en que el contenido de ADN es< 100 pg/1000 UI FVIII.

Procedimiento de purificación del factor de coagulación VIII

La presente invención se refiere a una fracción que contiene Factor FVIII que se puede obtener mediante el procedimiento de la invención.

Antecedentes de la invención

La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que afectan negativamente la capacidad de controlar la coagulación de la sangre o coagulación. En su forma más común, la Hemofilia A, existe una deficiencia en el factor de coagulación FVIII, la Hemofilia A se produce en aproximadamente 1 en 5.000-10.000 nacimientos de varones. La proteína FVIII es un cofactor esencial en la coagulación de la sangre con propiedades multifuncionales. Se puede tratar la deficiencia de FVIII con concentrados de FVIII derivados de plasma o con FVIII producido de manera recombinante. El tratamiento con concentrados de FVIII ha conducido a una normalización de la vida de los pacientes con hemofilia. Históricamente, se ha tratado la Hemofilia A con FVIII originado a partir de plasma sanguíneo humano. En el plasma sanguíneo, en condiciones normales, la molécula de FVIII está siempre asociada a su cofactor; el factor de von Willebrandt (vWf), que estabiliza la molécula de FVIII a partir de diferentes formas de degeneración.

Los productos de FVIII derivados de plasma se producen en el mercado con diferentes purezas y con mayores o menores cantidades de vWf presentes. Usualmente, los productos con una baja cantidad de vWf contienen albúmina humana añadida y/u otros estabilizantes que Incluyen concentraciones salinas aumentadas para estabilizar la molécula de FVIII. Los procedimientos usados para purificar FVIII eran normalmente una combinación de diferentes procedimientos de precipitación tales como crioprecipitación, precipitación con hidróxido de aluminio, etc., y etapas de cromatografía, principalmente, Intercambio Iónico, etapas de filtración en gel y por afinidad.

Para mejorar los productos de FVIII se empleó la cromatografía de afinidad, que eliminó eficazmente contaminantes hasta un grado elevado de pureza de FVIII Incluyendo también la posibilidad de reducir también vWf (Farrugla y col., Biotechnology and plasma fractlonatlon Industry; The ¡mpact of advances in the production of Coagulatlon FVIII. Biotechnology, Vol. 3, N° 1, Febrero de 1993). La desventaja de la cromatografía de afinidad era que esta es relativamente cara y que los anticuerpos monoclonales utilizados como llgandos de afinidad eran de origen animal.

En la mitad de la década de los 80 del siglo XX existían algunas transmisiones víricas asociadas con los productos de FVIII derivados de plasma. Incluso aunque se resolvió este problema a través de la ¡mplementaclón de etapas de reducción específicas de virus, esto fue el punto de partida del desarrollo de productos de FVIII recomblnantes (rFVIII). En la década de los 90 se comercializó el primer producto de rFVIII y hasta la fecha existen tres productos de rFVIII diferentes (dos moléculas de longitud completa y una molécula sin el dominio B en la que se ha eliminado una parte inactiva de la molécula de FVIII para aumentar la productividad de la célula hospedadora (Erlksson y col., The Manufacturing Process for B-domaln deleted recombinant FVIII. Seminars in Hematology, Vol 38, Supl. 4 (Abril), 2001: pp24-31)) con un alto grado de pureza (todas sin vWf).

Los procedimientos de purificación utilizados para purificar rFVIII eran una combinación de diferentes técnicas de cromatografía (ref. Bhattacharyya y col., Artículo de revisión; Recombinant FVIII for Haemophllla "An overview of production technologies". CRIPS Vol. 4, N° 3 julio-septiembre de 2003. Uno de los procedimientos era la conocida técnica de inmunoafinidad (incluso aunque existen productos que resuelven esto, por ejemplo, con la afinidad peptídica (Kelly y col., Development and valldatlon of an afflnity chromatography step using a peptlde ligand for cGMP production of FVIII.) o un fragmento de anticuerpo derivado de levadura (Resina de afinidad VilISelect FVIII - GE Health care, N° de cat. 17-5450, Introduciéndose actualmente en el mercado) como se usa para el FVIII plasmático.

Como vWf está ausente en todos los productos de rFVIII, han de tomarse determinadas medidas para estabilizar la molécula de FVIII frente a la pérdida de actividad (agregación, proteasas, adsorción superficial, etc.). En uno de los productos se añade un agente quelante (EDTA, etc.) para proteger FVIII frente a la degeneración de las metaloproteasas (documento US-A-5.831.026). Añadir albúmina, aprotinina, insulina o incluso expresar simultáneamente rFVIII con vWf (y eliminar este corriente abajo en el ciclo de purificación) son estrategias que se han realizado para aumentar la estabilidad de la molécula de rFVIII (ref. Bhattacharyya y col., Artículo de revisión; Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies". CRIPS Vol. 4, N° 3, julio-septiembre de 2003).

Se divulga otra estrategia (para mantener un procedimiento exento de aditivos mamíferos y agentes quelantes) en el documento EP-A-1 707 634, en el que una combinación de cantidades crecientes de sales contribuye a la estabilidad y a una elevada recuperación del producto de rFVIII (Wang y col, Coagulation FVIII, structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003), 1-15). Sin embargo, esta técnica tiene una determinada desventaja. Por ejemplo, el contenido salino relativamente elevado hace que no sea adecuado procesar directamente con un intercambiador iónico sin dilución (y existe riesgo de una posible desestabilización Parti y col., In vitro stability of recombinant FVIII. Haemophllla (2000), 6, 513-522. Biotechnology and Bioengineering, Vol 87, N° 3, 5 de agosto, 2004).

El documento WO-A-2009/007451 divulga un procedimiento de purificación de FVIII utilizando un modo mixto o una resina multimodal. El procedimiento de purificación se basa en poner en contacto la proteína FVIII con una resina multimodal o en modo mixto que contiene ligandos que comprenden una parte hidrófoba y una parte cargada negativamente y eluir dicha proteína FVIII con un tampón de elución que contiene al menos una sal 1,5 M y al menos un 40 % (p/v) de etilenglicol, propilenglicol o una de sus mezclas, e iones de calcio.

El documento EP-A-1707634 divulga un procedimiento para el aislamiento de proteínas producidas de manera recombinante entre otros mediante diversos procedimientos tales como cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteínas, intercambios de tampones, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, medio de cromatografía de intercambio hidrófobo/iónico en modo mixto, cromatografía con quelación, cromatografía de afinidad de hidratos de carbono tal como cromatografía de afinidad de lectina o de heparina, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, diálisis, agentes de precipitación diferentes tales como polietilenglicol, sulfato de amonio, etanol, adsorción en hidroxiapatito, adsorción mediante membrana con filtro, ligandos acoplados a partículas magnéticas, etc. Sin embargo, se identifican etapas concretas de purificación cromatográfica.

El documento WO-A-2005-082483 divulga un procedimiento para la purificación de anticuerpos a partir de una o más impurezas e un líquido, cuyo procedimiento comprende poner en contacto dicho líquido con una primera resina de cromatografía comprendida por un soporte al cual se han inmovilizado ligandos multimodales para adsorber los anticuerpos a la resina, donde cada ligando multimodal comprende al menos un grupo de intercambio catiónico y al menos un sistema de anillo aromático o heteroaromático. Se añade un eluyente para liberar los anticuerpos de la resina y se pone en contacto el eluato con una segunda resina de cromatografía.

El documento WO-A-2005/121163 divulga un procedimiento para el aislamiento de una o más proteínas de una solución de proteínas. El procedimiento comprende las etapas de proporcionar una solución de proteínas que comprende una o más proteínas específicas y que tiene un pH preestablecido y una fuerza iónica o conductividad preestablecida.

Descripción de la invención

Un objeto de la invención era evitar los inconvenientes de los procedimientos de purificación de la técnica anterior. Se divulga un procedimiento para purificar FVIII en particular a partir de fuentes que tienen un elevado contenido salino, en concreto, tal como se usan en la fabricación de FVIII recombinante.

Esto se lleva a cabo mediante un procedimiento de purificación del factor de coagulación FVIII en una secuencia de purificación que emplea cromatografía en la que al menos se realiza una cromatografía... [Seguir leyendo]

I. Una composición de materia que comprende un FVIII purificado recombinante que se puede obtener mediante un proceso de purificación o enriquecimiento en FVIII de coagulación que utiliza cromatografía que comprende las etapas de

- proporcionar una fracción que contiene FVIII en una solución acuosa que tiene una elevada fuerza iónica;

- poner en contacto la fracción que contiene FVIII con una resina catiónica multimodal;

- lavar la una resina catiónica multimodal que tiene adsorbido FVIII con un tampón acuoso de lavado;

- eluir la fracción que contiene FVIII tampón acuoso de elución que comprende al menos un aminoácido que está cargado positivamente a un pH 6 a 8; y

- en el que la secuencia de purificación comprende además las siguiente etapas:

1. una resina de intercambio catiónico ¡i. una membrana aniónica;

iii. una etapa de inactivación química para virus de envoltura lípida;

iv. una resina de afinidad basada en un ligando proteico que consiste en un fragmento de anticuerpo expresado en levadura;

v. una etapa de eliminación de patógenos mediante filtración con un tamaño promedio de poro de aproximadamente 20 nm;

vi. una resina de intercambio aniónico;

vii. una resina para cromatografía de exclusión molecular y caracterizada porque la pureza después de la última etapa de purificación es > 4000 Ul/mg y en que el contenido de ADN es < 100 pg/1000 Ul FVIII.

2. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la membrana aniónica es Sartobind Q, especialmente para la reducción de ADN.

3. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la resina catiónica multimodal es Capto MMC.

4. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la resina de intercambio catiónico es SP Sepharose FF.

5. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la etapa de Inactivación química para virus de envoltura lípida es una inactivación con disolvente/detergente que utiliza fosfato de tri-n-butilo y Tritón X-100.

6. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la resina de afinidad basada en un ligando proteico es VilISelect, consistiendo el ligando de VIIISelect en un fragmento de anticuerpo expresado en levadura.

7. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la etapa de eliminación de patógenos mediante filtración se realiza con un filtro que tiene con un tamaño promedio de poro nominal de aproximadamente 20 nm en particular con Planova 20N.

8. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la resina de intercambio aniónico es Q Sepharose FF.

9. La composición de materia de la reivindicación 1 en la que la resina de cromatografía de exclusión por tamaños es Superdex 200pg.

10. La composición de materia de la reivindicación 1, caracterizada porque el FVIII recombinante se deriva de un derivado de células 293 de riñón embriónico humano.

II. La composición de materia de la reivindicación 1, caracterizada porque el FVIII recombinante es un FVIII que tiene borrado el dominio B.

12. La composición de materia de la reivindicación 1, caracterizada porque la disolución acuosa que comprende FVIII en una solución con alto contenido en sales corresponde a una conductividad de aproximadamente 25 a aproximadamente 200 ms/cm a 25 °C.

13. La composición de materia de la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido que está cargado positivamente a pH de 6 a 8 es seleccionado entre el grupo de grupos amino que contienen aminoácidos tales como lisina; arginina, histidina y sus combinaciones, especialmente en concentraciones de > 0,4 M, particularmente > 0,5 M.

14. La composición de materia de la reivindicación 1, en la que el tampón de elución comprende adicionalmente al menos un grupo hidroxilo que contiene compuestos orgánicos, tal como un alcohol, al menos un compuesto orgánico que comprende un grupo amino tal como un aminoácido, al menos una fuente que proporcione iones Ca2+, al menos un compuesto para regular la fuerza iónica del tampón, tal como sales inorgánicas, al menos un detergente no iónico y al menos una sustancia tamponadora para regular el pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 en particular a aproximadamente un valor neutro.

15. La composición de materia de la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de purificación comprende además etapas de eliminación/inactivación de patógenos que comprenden etapas cromatográficas cuyas etapas están basadas en diferentes propiedades fisiológicas dirigidas al patógeno a eliminar.

16. La composición de materia de la reivindicación 1, caracterizada porque la pureza después de la última etapa de 5 purificación es > 9000 Ul/mg y preferentemente > 10 000 Ul/mg de proteína y que el contenido en ADN es <

100 pg/100 Ul FVIII y preferentemente <10 pg/1000 Ul FVIII.