Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico.

Método para purificar una proteína diana que comprende

a. obtener una disolución que comprende una mezcla de una proteína diana solubilizada y una o más proteínas contaminantes solubilizadas y un tampón alcalino,

en el que la proteína diana tiene un punto isoeléctrico mayor de 7 y está cargada positivamente a pH alcalino y la una o más proteínas contaminantes tienen una carga polianiónica;

b. poner en contacto la disolución que comprende la mezcla de la proteína diana solubilizada y la una o más proteínas contaminantes solubilizadas con uno o más tensioactivos catiónicos en una cantidad eficaz para precipitar preferentemente la una o más proteínas contaminantes, en el que el uno o más tensioactivos catiónicos son un compuesto de amonio anfipático seleccionado del grupo que consiste en compuestos de amonio cuaternario de fórmula general QN+; compuestos de amonio primario con cadena de parafina de fórmula general RNH3 +; y sales de

los mismos, aumentando de ese modo la proporción de proteínas que quedan en disolución representadas por la proteína diana; y

c. recuperar la proteína diana solubilizada.

Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico Campo de invención

La invención se refiere al campo de la purificación de proteínas usando tensioactivos.

Antecedentes

La producción de macromoléculas biológicas, particularmente proteínas, a menudo implica etapas de potenciación de la pureza basadas en propiedades físicas y fisicoquímicas. Las dificultades encontradas en tales etapas de procedimiento incluyen, pero no se limitan a, determinar las condiciones que permiten la separación de moléculas solubles e insolubles, la recuperación relativamente baja de la molécula deseada tras una etapa de tratamiento, la pérdida de actividad biológica en el transcurso del procedimiento y la sensibilidad de la proteína a las condiciones de las etapas del procedimiento tales como el pH.

Se han utilizado tensioactivos en el procesamiento de macromoléculas biológicas. Los tensioactivos catiónicos son una subclase reconocida de tensioactivos e incluyen compuestos de amonio antipáticos. Los compuestos de amonio antipáticos comprenden compuestos de amonio cuaternario de fórmula general QN+ y compuestos de amonio primario con cadena de parafina de fórmula general RNhÍ3+. Ambos tipos de compuestos de amonio antipáticos incluyen tensioactivos de amonio de cadena larga que tienen una cadena alifática larga de preferiblemente al menos seis átomos de carbono (Scott (196) Methods Biochem. Anal. 8:145-197.

Se sabe que los tensioactivos de amonio cuaternario de cadena larga interaccionan con macromoléculas biológicas. Los compuestos de amonio cuaternario de cadena larga tienen al menos un sustituyente en el nitrógeno que consiste en una cadena de alquilo lineal con 6-2 átomos de carbono. Los representantes mejor conocidos de esta clase son las sales de benzalconio (cloruros y bromuros), cloruro de hexadecilpiridinio, acetato de decualinio, bromuro de cetildimetilamonio (CTAB) y cloruro de hexadecilpiridinio (CPC1) y cloruro de bencetonio. Los tensioactivos de amonio cuaternario incluyen sales tales como sales de cetilpiridinio, por ejemplo cloruro de cetilpiridinio (CPC), sales de estearamida-metilpiridinio, sales de laurilpiridinio, sales de cetilquinolinio, sales de éster metílico del ácido laurllamlnopropiónico, sales metálicas del ácido laurilaminopropiónico, lauril dimetil betaína, estearil dimetil betaína, lauril dihidroxletil betaína y sales de bencetonio. Las sales de alquilpiridinio comprenden sales de estearll-trlmetilamonlo, cloruro de alquil-dimetilbencil-amonio y cloruro de dicloro-bencildimetil-alquilamonio.

Los usos conocidos de tensioactivos catiónicos para purificar macromoléculas biológicas incluyen 1) solubilización de agregados, Incluyendo agregados de proteínas; 2) elución de macromoléculas biológicas unidas a columna cromatográflca; y 3) precipitación de pollanlones tales como ácido hialurónico (HA), ácidos nucleicos y heparina (y moléculas que coprecipitan con pollanlones).

Se han usado tensioactivos catiónicos para solublllzar agregados de proteínas. Otta y Bertini ((1975) Acta Physiol. Latlnoam. 25:451-457, demostraron que podía solublllzarse urlcasa activa a partir de peroxisomas de hígado de roedor con el tensioactivo de amonio cuaternario Hyamlne 2389. Se encontró que el aumento de la concentración del tensioactivo de amonio daba como resultado el aumento de la disolución tanto de uricasa (basándose en la actividad enzlmática) como de proteína total de manera que no hay aumento en la cantidad relativa de proteína urlcasa con respecto a la cantidad de proteína total. En otras palabras, no hubo solubilización selectiva de la proteína urlcasa con respecto a la proteína total, y la proteína uricasa no constituyó un porcentaje superior de la proteína total tras la solubilización con el tensioactivo catiónico. Por tanto, en este procedimiento, la pureza de la urlcasa con respecto al contenido en proteína total aparentemente no se potencia como resultado de la solubilización con tensioactivo de amonio cuaternario.

En otro estudio, Truscoe ((1967) Enzymologla 33:1 19-32, examinó un panel de detergentes catiónicos, aniónicos y neutros para determinar su eficacia de extracción de urato oxidasa (uricasa) a partir de polvos de riñón de buey. Aunque se encontró que los detergentes neutros y aniónicos potencian la actividad urato oxidasa soluble, se encontró que los detergentes catiónicos, por ejemplo, sales de amonio cuaternario, disminuyen la actividad enzimática total con el aumento de la concentración. Los autores concluyeron que los detergentes catiónicos no eran útiles para purificar urato oxidasa de riñón de buey.

La solubilización de proteínas recombinantes, hormona de crecimiento porcina, metionil-hormona de crecimiento porcina, proteína del virus de la enfermedad de bursitis infecciosa, proteína de fusión con B-galactosidasa, de células o cuerpos de inclusión de £. co//, con tensioactivos catiónicos se describe en la patente estadounidense n.° 4.797.474, la patente estadounidense n.° 4.992.531, la patente estadounidense n.° 4.966.963 y la patente estadounidense n.° 5.8.377. La solubilización en condiciones alcalinas se lleva a cabo usando compuestos de amonio cuaternario incluyendo cloruro de cetiltrimetilamonio, cloruro de n-alquil-dimetil-bencilamonio mixto, CPC,

cloruro de N,N-d¡met¡l-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,-tetramet¡lbutil)-fenox¡]etox¡]et¡l]bencenometanamon¡o, bromuro de tetradeciltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio. Estas publicaciones mencionan que, tras cada procedimiento de solubilización, las disoluciones se centrifugan y se observa poco o ningún sedimento en cada caso. Esta observación sugiere que la mayoría o todas las proteínas se solubilizan sin considerar la selectividad para la solubilización de una proteína diana. No se indica la pureza de las proteínas recuperadas. La patente estadounidense n.° 5.929.231, incorporada en el presente documento como referencia en su totalidad, describe la disgregación de gránulos y agregados que contienen almidones con cloruro de cetilpiridinio (CPC). Por tanto, la técnica anterior se refiere al uso de tensioactivos catiónicos para la solubilización general, no específica de macromoléculas biológicas particuladas. Estos métodos de la técnica anterior no dan a conocer el aumento de la pureza de una proteína diana deseada con respecto a la proteína total con un tensioactivo catiónico.

Se han usado tensioactivos catiónicos para eluir macromoléculas biológicas adsorbidas a resinas de intercambio catiónico o adyuvantes que contienen aluminio (Antonopoulos, et al. (1961) Biochim. Biophys. Acta 54:213-226; Embery (1976) J. Biol. Buccale 4:229-236; y Rinella, etal. (1998) J. Colloid Interface Sci. 197:48-56.

La patente estadounidense n.° 4.169.764 describe la elución de urocinasa de columnas de carboximetilcelulosa usando una amplia variedad de disoluciones de tensioactivo catiónico. Los autores establecen una preferencia por el uso de sales de amonio tetrasustituidas en las que un grupo alquilo es un grupo alquilo superior de hasta 2 átomos de carbono y los otros son grupos alquilo inferiores de hasta 6 átomos de carbono. El uso de tales tensioactivos catiónicos permite la separación de macromoléculas biológicas de su unión a una matriz sólida.

A la inversa, la impregnación de filtros tales como los compuestos de nailon, con tensioactivo catiónico permite la inmovilización de polisacáridos o ácidos nucleicos (Maccari y Volpi (22) Electrophoresis 23:327-3277; Benitz, ef al. (199) patente estadounidense n.° 4.945.86; Macfarlane (1991) patente estadounidense n.° 5.1.183.

Este fenómeno se debe aparentemente a las interacciones de tensioactivo catiónico-polianión que permiten la precipitación del polianión.

Está bien establecido que los compuestos de amonio antipáticos, que comprenden compuestos de amonio cuaternario de fórmula general QN+ y compuestos de amonio primario con cadena de parafina de fórmula general RNH3+, pueden precipitar polianiones en condiciones definidas (revisado en Scott (1955) Biochim. Biophys. Acta 18:428-429; Scott (196) Methods Biochem. Anal. 8:145-197; Laurent, et al., (196) Biochim. Biophys. Acta 42:476- 485; Scott (1961) Biochem. J. 81:418-424; Pearce y Mathieson (1967) Can. J. Biochemistry 45:1565-1576; Lee (1973) Fukushima J. Med. Sci. 19:33-39; Balazs, (1979) patente estadounidense n.° 4.141.973; Takemoto, et al., (1982) patente estadounidense n.° 4.312.979; Rosenberg (1981) patente estadounidense n.° 4.31.153; Takemoto, et al., (1984) patente estadounidense n.° 4.425.431; dHinterland, et al., (1984) patente estadounidense n.° 4.46.575; Kozma, et al. (2) Mol. Cell. Biochem. 23:13-112. Esta precipitación depende de las especies... [Seguir leyendo]

1. Método para purificar una proteína diana que comprende

a. obtener una disolución que comprende una mezcla de una proteína diana solubilizada y una o más proteínas contaminantes solubilizadas y un tampón alcalino, en el que la proteína diana tiene un punto isoeléctrico mayor de 7 y está cargada positivamente a pH alcalino y la una o más proteínas contaminantes tienen una carga polianiónica;

b. poner en contacto la disolución que comprende la mezcla de la proteína diana solubilizada y la una o más proteínas contaminantes solubilizadas con uno o más tensioactivos catiónicos en una cantidad eficaz para precipitar preferentemente la una o más proteínas contaminantes, en el que el uno o más tensioactivos catiónicos son un compuesto de amonio antipático seleccionado del grupo que consiste en compuestos de amonio cuaternario de fórmula general QN+; compuestos de amonio primario con cadena de parafina de fórmula general RNhV; y sales de los mismos, aumentando de ese modo la proporción de proteínas que quedan en disolución representadas por la proteína diana; y

c. recuperar la proteína diana solubilizada.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el compuesto de amonio antipático se selecciona del grupo que consiste en sales de cetilpiridinio, sales de estearamida-metilpmdinio, sales de laurilpiridinio, sales de cetilquinolinio, sales de éster metílico del ácido laurilaminopropiónico, sales metálicas del ácido laurilaminopropiónico, lauril dimetil betaína, estearil dimetil betaína, lauril dihidroxietil betaína y sales de bencetonio, y opcionalmente además o bien

(i) en el que el compuesto de amonio antipático se selecciona de cloruro de hexadecilpiridinio, acetato de decualinio, cloruro de hexadecilpiridinio, cloruro de cetiltrimetilamonio, cloruro de n-alquil-dimetil-bencilamonio mixto, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de N,N-dimetil-N-[2-[2-[4-(1,1,3,3,-tetrametilbutil)-fenox¡]etox¡]et¡l]bencenometanamon¡o, cloruro de alquil-dimetilbencil-amonio y cloruro de dicloro-bencildimetil-alquilamonio, bromuro de tetradeciltrimetilamonio, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, lauril dimetil betaína, estearil dimetil betaína y lauril dihidroxietil betaína, o bien

(ii) en el que el compuesto de amonio antipático es una sal de cetilpiridinio, preferiblemente/opcionalmente una sal de haluro, preferiblemente/opcionalmente cloruro de cetilpiridinio, en el que el compuesto de amonio antipático tiene opcionalmente al menos una cadena allfátlca que tiene 6-2 átomos de carbono, preferiblemente/opcionalmente 8- 18 átomos de carbono.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la disolución comprende además uno o más componentes celulares, preferiblemente/opcionalmente

(I) derivados de un microorganismo, preferiblemente/opcionalmente bacterias, preferiblemente/opcionalmente E. coli, o

(¡I) en el que el uno o más componentes celulares son una o más proteínas.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la proteína diana es

(I) una proteína recomblnante, preferiblemente/opcionalmente una enzima, o

(¡i) un anticuerpo, preferiblemente/opcionalmente un anticuerpo de cadena sencilla, o

(i¡¡) un interferón, preferiblemente/opcionalmente un interferón-beta, o

(iv) se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, una urlcasa, un Interferón-beta, un inhibidor del factor X, una desoxlrrlbonucleasa ácida II, una elastasa, una llsozlma, una papaína, una peroxidasa, una rlbonucleasa pancreática, un trlpslnógeno, una tripsina, un citocromo c, una erabutoxlna, enterotoxina C1 de Staphilococcus aureus, un Interferón y una monoammooxidasa A, en el que la proteína diana es preferiblemente una urlcasa, preferiblemente/opcionalmente una urlcasa de mamífero, y preferiblemente/opcionalmente una uricasa porcina.

5. Método según la reivindicación 1, en el que el uno o más tensioactivos catiónicos se añaden a una concentración de desde el ,1% hasta el 5,%, preferiblemente/opcionalmente desde el ,1% hasta el ,5% y más preferiblemente/opcionalmente desde el ,3% hasta el ,2%.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la puesta en contacto se realiza durante desde 5 minutos hasta 48 horas, preferiblemente/opcionalmente, desde 1 minutos hasta 24 horas, o se realiza a una temperatura de desde

4°C hasta 36°C preferiblemente/opcionalmente desde 4°C hasta 26°C.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la disolución está sustancialmente libre de

(i) polianiones, o

(ii) soportes sólidos, o

(i¡¡) agregados de las proteínas contaminantes con otras moléculas,

o

(¡v) polianiones, soportes sólidos y agregados de las proteínas contaminantes con otras moléculas.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tensioactivo catiónico es una sal de cetilpiridinio, preferiblemente/opcionalmente cloruro de cetilpiridinio.

9. Método de aumento del porcentaje de una proteína diana en una disolución de proteínas que comprende las

etapas de:

a. obtener una disolución de una pluralidad de proteínas, en el que las proteínas en disolución comprenden la proteína diana, una o más proteínas contaminantes y un tampón alcalino, y la proteína diana comprende un primer porcentaje en peso de la proteína total en la disolución, en el que la proteína diana tiene un punto isoeléctrico mayor

de 7 y está cargada positivamente a pH alcalino y la una o más proteínas contaminantes tienen una carga

polianiónica; y

b. poner en contacto la disolución con uno o más tensioactivos catiónicos en una cantidad eficaz para precipitar preferentemente las proteínas contaminantes, en el que el uno o más tensioactivos catiónicos es un compuesto de amonio antipático seleccionado del grupo que consiste en compuestos de amonio cuaternario de fórmula general

QN+; compuestos de amonio primario con cadena de parafina de fórmula general RNhV; y sales de los mismos;

en el que la proteína diana en la disolución de la etapa (b) comprende un segundo porcentaje en peso de la proteína total, y el segundo porcentaje es mayor que el primer porcentaje.