Método para identificar un perro como normal, o heterocigoto para,

u homocigoto para la mutación de la anomalía del ojo del Collie (CEA) que comprende la etapa de: a) someter a prueba la muestra biológica que comprende ADN obtenido del perro para detectar una mutación en una región del cromosoma 37, en el que la mutación es una deleción de los nucleótidos correspondientes a de la posición 9.302 a la posición 17.101 de la SEQ ID NO:1, en el que la identificación de la deleción en sólo un alelo es indicativa de un perro que es heterocigoto para la mutación de CEA, la identificación de la deleción en ambos alelos es indicativa de un perro que es homocigoto para la mutación de CEA y la ausencia de la deleción en ambos alelos es indicativa de un perro normal

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a un trastorno ocular hereditario, la anomalía del ojo del Collie (CEA), que afecta al desarrollo de la coroides y la esclerótica en caninos. Más particularmente, la invención se refiere a un método para identificar perros como genéticamente normales, heterocigotos para u homocigotos para el alelo de la 5 enfermedad CEA.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La anomalía del ojo del Collie (CEA) es un trastorno ocular hereditario canino que afecta al desarrollo de la coroides y la esclerótica. La enfermedad se segrega en varias razas de perros incluyendo Rough y Smooth Collie, Border Collie, pastores australianos, Lancashire Heeler, y perro pastor de Shetland. El fenotipo clínico varía 10 significativamente entre perros afectados de todas las razas. El fenotipo de CEA primario, hipoplasia coroidea (HC), se caracteriza por hipoplasia regional (subdesarrollo) de la coroides, que es el lecho altamente vascularizado del ojo que se encuentra debajo de la retina. Habitualmente, esta lesión da como resultado un defecto de ventana oftalmoscópicamente detectable en el fondo ocular ubicado en la zona temporal con respecto al nervio óptico.

En la mayoría de perros levemente afectados, la HC es la única lesión evidente, y muchos de estos perros no 15 presentarán consecuencias clínicas obvias y conservarán una visión aparentemente normal durante toda su vida. En perros gravemente afectados, también pueden darse lesiones colobomatosas de la cabeza del nervio óptico y/o tejidos adyacentes. Los colobomas son evaginaciones de la pared del ojo, en la que se ubica la esclerótica delgada. En los casos más graves, pueden desarrollarse desprendimientos de retina completos o localizados, y/o neovascularización y hemorragia intraocular, de los que todos pueden conducir a ceguera. Estas manifestaciones graves de la CEA se 20 observan sólo en perros afectados también con la lesión hipoplásica coroidea primaria.

Se ha establecido previamente (Lowe JK, et al. Genomics julio de 2003; 82(1):86-95) que el fenotipo de CEA primario se hereda por medio de un gen que mapea en una región de 3,9 cM del cromosoma canino 37, y se segrega como un rasgo autosómico recesivo con casi el 100% de penetración. Sin embargo, debido a que no ha habido identificación de una alteración del gen asociado con CEA, no ha sido posible la detección de la enfermedad. Por tanto, 25 sigue habiendo una necesidad en la industria de la cría canina de una prueba genética que permita la identificación directa de perros que son normales, portadores o afectados con CEA.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para identificar perros que son genéticamente normales, heterocigotos para u homocigotos para el alelo de la enfermedad CEA. El método comprende las etapas de obtener una 30 muestra biológica que comprende ADN genómico del perro y someter a prueba la muestra biológica para detectar la presencia o ausencia de una deleción de los nucleótidos correspondientes a los nucleótidos desde la posición 9.302 hasta la posición 17.101 de la SEQ ID NO:1 dentro del cromosoma 37. La presencia de la deleción en ambos alelos es indicativa de un perro que es homocigoto para el alelo de la enfermedad CEA. La presencia de la deleción en sólo un alelo es indicativa de un perro que es heterocigoto para el alelo de la enfermedad CEA, y la ausencia de la deleción en 35 ambos alelos es indicativa de un perro que es normal para CEA. Puede someterse a prueba la presencia o ausencia de la deleción mediante amplificación del ADN seguido por el análisis de los productos de amplificación.

La presente invención también proporciona kits para el diagnóstico de un perro como normal, heterocigoto para, u homocigoto para el alelo de la enfermedad CEA. Tales herramientas y/o kits ayudan a los criadores a identificar perros normales, portadores y perros mutantes homocigotos. Los perros que se determina que son heterocigotos para u 40 homocigotos para el alelo de la enfermedad pueden eliminarse del pie de cría o reproducirse con perros genéticamente normales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 proporciona la secuencia de SEQ ID NO:1 que corresponde a una región del cromosoma 37 en perros. La SEQ ID NO:1 es un cóntigo (una secuencia consenso derivada de múltiples secuencias solapantes) de 45 perros no afectados. La zona delecionada en perros afectados y en un cromosoma en perros que son heterocigotos para el alelo de CEA corresponde a los nucleótidos de 9.302 a 17.101 de la SEQ ID NO:1, que se indican en minúsculas. La SEQ ID NO:1 corresponde a los nucleótidos de 28.676.370 a 28.694.530, (inclusive, tamaño 18.161 pb) de la secuencia del genoma canino montada de dominio público, montaje julio de 2004, al que puede accederse a través de GenBank o en el sitio de bioinformática del genoma de la UCSC en http://genome.ucsc.edu/. La SEQ ID NO:1 50 corresponde a los nucleótidos 72.769-90.929 del intervalo de desequilibrio de ligamiento de anomalía del ojo del Collie definido. El intervalo de desequilibrio de ligamiento de anomalía del ojo del Collie definido corresponde a los nucleótidos de 28.603.601 a 28.716.392 (inclusive, tamaño 112.792 pb) de la secuencia del genoma canino montada de dominio público, montaje, julio de 2004. Los sitios de unión del cebador de PCR están en negrita y corresponden a los nombres y las posiciones del cebador enumerados en las tablas 3-5. Las secuencias en minúsculas identifican los nucleótidos 55 delecionados en el alelo mutante; las mayúsculas identifican bases presentes tanto en normales como en mutantes.

La figura 2 es una representación gráfica de las posiciones relativas de la deleción de CEA, la SEQ ID NO:1, y los cebadores usados para someter a prueba detectar la deleción de CEA, en relación con el intervalo de LD de CEA, y en relación con posiciones en la secuencia del genoma canino montada (montaje julio del 2004). En relación con las coordenadas de la secuencia del genoma canino, se invierten tanto la secuencia de la deleción de CEA como de la SEQ ID NO:1. 5

La figura 3A proporciona la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:10) correspondiente a una hebra del producto de amplificación obtenido usando el cebador CEAF21a y cebador CEAR17d. La secuencia correspondiente a CEAF21a está en negrita; la secuencia correspondiente al cebador CEAR17d está subrayada.

La figura 3B proporciona la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:11) del complemento inverso de SEQ ID NO:10. La secuencia correspondiente al cebador CEAF21a está en negrita; la secuencia correspondiente al cebador 10 CEAR17d está subrayada. El par de nucleótidos en el recuadro “GC” flanquea el punto de rotura inicial de la deleción de CEA.

La figura 4A proporciona la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:12) correspondiente a una hebra del producto de amplificación obtenido usando cebadores CEAF22a y cebador CEAR22c. La secuencia de nucleótidos correspondiente al cebador CEAF22a está en negrita; la secuencia correspondiente al cebador CEAR22c está 15 subrayada.

La figura 4B proporciona la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:13) del complemento inverso de SEQ ID NO:12. La secuencia de nucleótidos correspondiente al cebador CEAF22a está en negrita; la secuencia de nucleótidos correspondiente al cebador CEAR22c está subrayada. El par encajonado de nucleótidos “GT” flanquean el punto de rotura final de la deleción de CEA. 20

La figura 5 es una representación de una separación electroforética de productos de amplificación por PCR obtenidos usando conjuntos de los cuatro cebadores de PCR dados a conocer en la tabla 6. El primer carril, más a la izquierda, contiene una escala de tamaño. Los carriles restantes se dividen en cuatro conjuntos de amplificaciones por PCR (1-4) de ADN genómico de perros normales (N), portadores (C) y afectados (A). Se realizó el conjunto 1 usando cebadores CEAF22a y CEAR22c. Se realizó el conjunto 2 usando cebadores CEAF21a y CEAR22c. Se realizó el 25 conjunto 3 usando cebadores CEAF21a y CEAR17d. Se realizó el conjunto 4 usando una combinación de los cuatro cebadores.

La figura 6 proporciona la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:14) de una hebra del producto de 430 pb generado por PCR usando cebadores CEAF21a y CEAR22c. La secuencia correspondiente al cebador CEAF21a está en negrita. La secuencia correspondiente al cebador CEAT22c está subrayada. Los nucleótidos en el recuadro “GT” 30...

1. Método para identificar un perro como normal, o heterocigoto para, u homocigoto para la mutación de la anomalía del ojo del Collie (CEA) que comprende la etapa de:

a) someter a prueba la muestra biológica que comprende ADN obtenido del perro para detectar una mutación en una región del cromosoma 37, en el que la mutación es una deleción de los nucleótidos correspondientes a 5 de la posición 9.302 a la posición 17.101 de la SEQ ID NO:1,

en el que la identificación de la deleción en sólo un alelo es indicativa de un perro que es heterocigoto para la mutación de CEA, la identificación de la deleción en ambos alelos es indicativa de un perro que es homocigoto para la mutación de CEA y la ausencia de la deleción en ambos alelos es indicativa de un perro normal.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la presencia o ausencia de la deleción se somete a prueba 10 mediante amplificación del ADN seguido por el análisis de los productos de amplificación.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la amplificación se lleva a cabo usando un conjunto de cuatro cebadores,

en el que, en ausencia de la deleción, la amplificación usando los cebadores primero y segundo produce un primer producto de amplificación que abarca el punto de rotura inicial de la deleción, la amplificación usando 15 los cebadores tercero y cuarto produce un segundo producto de amplificación que abarca el punto de rotura final de la deleción, y la amplificación usando el primer y el cuarto cebador no produce ningún producto de amplificación detectable; y

en el que, en presencia de la deleción, la amplificación usando el primer y el cuarto cebador produce un tercer producto de amplificación que no contiene la región delecionada. 20

4. Método según la reivindicación 3, en el que los productos de amplificación primero, segundo y tercero son de diferentes tamaños.

5. Método según la reivindicación 2, en el que el primer cebador corresponde a una secuencia en el sentido de 5' del punto de rotura inicial de la deleción, el cuarto cebador corresponde a una secuencia en el sentido de 3' del punto de rotura final de la deleción y los cebadores segundo y tercero corresponden a secuencias dentro de la 25 región delecionada.

6. Método según la reivindicación 3, en el que la amplificación usando los cebadores primero y segundo, la amplificación usando los cebadores tercero y cuarto, y la amplificación usando los cebadores primero y cuarto se realizan cada una en reacciones separadas.

7. Método según la reivindicación 3, en el que la amplificación usando los cebadores primero y segundo, la 30 amplificación usando los cebadores tercero y cuarto, y la amplificación usando los cebadores primero y cuarto se realizan en la misma reacción.

8. Método según la reivindicación 3, en el que el primer cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:2, el segundo cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:4, el tercer cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:6, y el cuarto cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:8. 35

9. Método según la reivindicación 3, en el que el primer producto de amplificación comprende la secuencia de SEQ ID NO:10.

10. Método según la reivindicación 3, en el que el segundo producto de amplificación comprende la secuencia de SEQ ID NO:12.

11. Método según la reivindicación 3, en el que el tercer producto de amplificación comprende la secuencia de 40 SEQ ID NO:14.

12. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, pelo, raspados de mucosa, semen, biopsia de tejido y saliva.

13. Método según la reivindicación 12, en el que la muestra biológica es sangre.

14. Método según la reivindicación 1, en el que el perro se selecciona del grupo que consiste en Rough y Smooth 45 Collie, Border Collie, pastores australianos, Lancashire Heeler, y perro pastor de Shetland.

15. Kit para identificar un perro como normal, heterocigoto para, u homocigoto para una mutación de la anomalía del ojo de Collie en una región del cromosoma 37, en el que la mutación es una deleción de los nucleótidos correspondientes a de la posición 9.302 a la posición 17.101 de la SEQ ID NO:1, que comprende:

un conjunto de cebadores que comprende un primer cebador, un segundo cebador, un tercer cebador y un cuarto cebador, en el que el primer cebador corresponde a una secuencia en el sentido de 5' de la posición 9.301 de la SEQ ID NO:1, el cuarto cebador corresponde a una secuencia en el sentido de 3' de la posición 17.102 de la SEQ ID NO:1 y los cebadores segundo y tercero corresponden a una secuencia entre los nucleótidos 9.302 y 17.101 de la SEQ ID NO:1, en el que la amplificación de un alelo normal con los cebadores 5 primero y segundo produce un primer producto de amplificación que abarca el punto de rotura inicial de la deleción, la amplificación de un alelo normal usando los cebadores tercero y cuarto produce un segundo producto de amplificación que abarca el punto de rotura final de la deleción, y la amplificación usando el primer y cuarto cebador produce un tercer producto de amplificación sólo para un alelo que tiene la deleción.

16. Kit según la reivindicación 15, en el que el primer cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:2, el segundo 10 cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:4, el tercer cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:6 y el cuarto cebador tiene la secuencia de SEQ ID NO:8.