PROTEÍNAS N-GLICOSILADAS RECOMBINANTES DE CÉLULAS PROCARIOTAS.
Un método para producir proteínas glicosiladas N-enlazadas, que comprende:
a) proporcionar ácidos nucleicos que codifican al menos una proteína diana recombinante, b) insertar ácidos nucleicos que codifican una o más de las secuencias de aminoácidos de consenso N-glicosiladas y optimizadas siguientes: D/E - X - N - Z - S/T en que X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural salvo Pro, en dichos ácidos nucleicos de a), c) proporcionar un organismo recombinante, preferiblemente un organismo procariótico, que comprende ácidos nucleicos que codifican (i) un operón pgl funcional de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, y (ii) al menos una proteína diana recombinante codificada por los ácidos nucleicos que resultan de la operación b), y d) cultivar el organismo recombinante de un modo adecuado para la producción y N-glicosilación de la(s) proteína(s) diana
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/004397.
Solicitante: ETH ZURICH.
Nacionalidad solicitante: Suiza.
Dirección: ETH TRANSFER, RÄMISTRASSE 101 8092 ZÜRICH SUIZA.
Inventor/es: AEBI, MARKUS, AHUJA,UMESH, KOWARIK,MICHAEL.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 10 de Mayo de 2006.
Fecha Concesión Europea: 29 de Septiembre de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/205 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Campylobacter (G).
- C07K14/25 C07K 14/00 […] › Shigella (G).
- C12P21/00B
Clasificación PCT:
- C12N15/70 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
- C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
- C12P21/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00).
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Proteínas N-glicosiladas recombinantes de células procariotas.
El presente invento se refiere a proteínas N-glicosiladas recombinantes, que comprenden una o más secuencias de aminoácidos de consenso N-glicosiladas y optimizadas, ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, así como los correspondientes vectores y células huésped. Además, el presente invento se dirige al uso de dichas proteínas, ácidos nucleicos, vectores y células huésped para preparar medicamentos. Más aún, el presente invento proporciona métodos para producir dichas proteínas.
Fundamento del invento
La glicosilación N-enlazada de proteínas es un proceso esencial y conservado que tiene lugar en el retículo endoplásmico de los organismos eucarióticos. Es importante para la plegadura de las proteínas y para la oligomerización, estabilidad, control de calidad, clasificación y transporte de proteínas secretoras y de membrana [A. Helenius y M. Aebi (2004), "Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum", Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049].
La glicosilación de proteínas ejerce una profunda influencia sobre la antigenicidad, la estabilidad y la semivida de una proteína. Además, la glicosilación puede ayudar a la purificación de proteínas por cromatografía, tal como, por ejemplo, por cromatografía de afinidad con ligandos de lectina unidos a una fase sólida que interaccionan con grupos glicosilados de la proteína. Por lo tanto, producir recombinantemente muchas proteínas glicosiladas en células eucarióticas para obtener patrones de glicosilación biológica y farmacéuticamente útiles es una práctica establecida.
Sólo en los últimos años se demostró que una bacteria, el agente patógeno Campylobacter jejuni, transmitido por los alimentos, también puede N-glicosilar sus proteínas [Szymanski et al. (1999), "Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni, Mol. Microbiol. 32, 1022-1030]. La maquinaria necesaria para la glicosilación es codificada por 12 genes que están agrupados en el llamado locus pgl. La alteración de la N-glicosilación afecta a la invasión y la patogénesis de C. jejuni pero no es letal como en la mayoría de los organismos eucarióticos [P. Burda y M. Aebi (1999), ``The dolichol pathway of N-linked glycosylation'', Biochim. Biophys. Acta 1426 (2): 239-57]. Es posible reconstituir la N-glicosilación de proteínas de C. jejuni haciendo que se expresen recombinantemente al mismo tiempo el locus pgl y la glicoproteína aceptora en E. coli [Wacker et al. (2002)", N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli, Science 298, 1790-1793].
En la Solicitud de Patente Europea número 03702276.1 (Patente Europea 1481057), un invento anterior de los presentes inventores, se enseña un organismo procariótico en que se introduce un ácido nucleico que codifica (i) glicosiltransferasas específicas para el ensamblaje de un oligosacárido sobre un vehículo lipídico, (ii) una proteína diana recombinante que comprende una secuencia de consenso "N - X - S/T", en que X puede ser cualquier aminoácido salvo prolina, y (iii) una oligosacariltransferasa de C. jejuni (OTasa) que une covalentemente dicho oligosacárido a la secuencia de consenso de la proteína diana. Dicho organismo procariótico produce N-glicanos con una estructura específica que viene definida por el tipo de las glicosiltransferasas específicas.
Nita-Lazar et al. (Colycobiology, volumen 15, nº 4, Abril de 2005, páginas 361-367) describen los requisitos secuenciales de los polipéptidos aceptores para N-glicosilación en la N-glicosilación reconstituida de la proteína modelo A cr A en E. coli.
Aun cuando la presencia de la conocida secuencia de consenso de N-glicosilación en una proteína permite la N-glicosilación de proteínas diana recombinantes en organismos procarióticos que comprenden la oligosacariltransferasa (OTasa) de C. jejuni, la N-glicosilación de ciertas proteínas diana es a menudo ineficaz.
El objeto del presente invento es proporcionar métodos para producir dichas proteínas que tengan una eficacia optimizada para la N-glicosilación, que puedan ser producidas en organismos procarióticos in vivo. Otro objeto del presente invento se dirige a la introducción más eficaz de N-glicanos en proteínas recombinantes para modificar la antigenicidad, la estabilidad y la actividad biológica, profiláctica y/o terapéutica de dichas proteínas. Un objeto más es la provisión de una célula huésped que presente eficazmente proteínas N-glicosiladas recombinantes del presente invento en su superficie.
En un primer aspecto, el presente invento proporciona un método para producir proteínas glicosiladas N-enlazadas, que comprende:
Se halló sorprendentemente que la introducción de una(s) secuencia(s) de aminoácidos parcial(es) específica(s) [secuencia(s) de consenso optimizada(s)] en las proteínas conduce a proteínas que son eficazmente N-glicosiladas por la oligosacariltransferasa (OST, OTasa) de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, en estas posiciones introducidas.
A la expresión "secuencia(s) parcial(es) de aminoácidos", como se usa en el contexto del presente invento, también se hará referencia como "secuencia(s) de consenso optimizada(s)". La secuencia de consenso optimizada es N-glicosilada por la oligosacariltransferasa (OST, OTasa [MW1]) de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, mucho más eficazmente que la secuencia de consenso regular "N - X - ST" conocida en la técnica anterior.
En general, la expresión "proteína N-glicosilada recombinante" se refiere a cualquier polipéptido u oligopéptido heterólogo producido en una célula huésped que no comprende naturalmente el ácido nucleico que codifica dicha proteína. En el contexto del presente invento, esta expresión se refiere a una proteína recombinantemente producida en una cualquier célula huésped, por ejemplo, una célula huésped eucariótica o procariótica, preferiblemente una célula huésped procariótica, tal como, por ejemplo, Escherichia ssp., Campylobacter ssp., Salmonella ssp., Shigella ssp., Helicobacter ssp., Pseudomonas ssp. y Bacillus ssp., más preferiblemente Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, etc., en que el ácido nucleico que codifica dicha proteína ha sido introducido en dicha célula huésped y en que la proteína codificada es N-glicosilada por la OTasa de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, enzima transferasa que se encuentra naturalmente en dicha célula huésped o ha sido introducida recombinantemente en dicha célula huésped.
De acuerdo con el código internacionalmente aceptado de una letra para aminoácidos, las abreviaturas D, E, N, S y T significan ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, serina y treonina, respectivamente. Las proteínas de acuerdo con el invento difieren de las proteínas naturales o de la técnica anterior en que se introducen y N-glicosilan una o más de las secuencias de consenso optimizadas D/E - X - N - Z - S/T. Por lo tanto, las proteínas del presente invento difieren de las proteínas de C. jejuni presentes en la naturaleza, que también contienen la secuencia de consenso optimizada pero no comprenden...
Reivindicaciones:
1. Un método para producir proteínas glicosiladas N-enlazadas, que comprende:
2. El método de la Reivindicación 1, en que los ácidos nucleicos que codifican al menos una proteína diana recombinante de acuerdo con c) (ii) codifican al menos 2 de dichas secuencias de aminoácidos de consenso N-glicosiladas optimizadas.
3. El método de la Reivindicación 2, en que los ácidos nucleicos que codifican al menos una proteína diana recombinante de acuerdo con c) (ii) codifican al menos 3 de dichas secuencias de aminoácidos de consenso N-glicosiladas optimizadas.
4. El método de la Reivindicación 3, en que los ácidos nucleicos que codifican al menos una proteína diana recombinante de acuerdo con c) (ii) codifican al menos 5 de dichas secuencias de aminoácidos de consenso N-glicosiladas optimizadas.
5. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que la(s) proteína(s) diana glicosilada(s) N-enlazada(s) producida(s) comprende(n) uno o más N-glicanos seleccionados del grupo de N-glicanos de Campylobacter spp., los N-glicanos derivados de oligosacáridos y polisacáridos transferidos al antígeno O que forma el polisacárido O en bacterias Gram negativas o polisacáridos capsulares de bacterias Gram positivas, preferiblemente P. aeruginosa, E. coli O7, O9, O16, O157 y Shigella dysenteriae O1.
6. El método de la Reivindicación 5, en que el Campylobacter spp. es C. jejuni.
7. El método de la Reivindicación 6, en que la bacteria Gram positiva es P. aeruginosa O9, O11.
8. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7, en que la(s) proteína(s) diana glicosilada(s) N-enlazada(s) producida(s) comprende(n) dos o más N-glicanos diferentes.
9. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en que la(s) proteína(s) diana glicosilada(s) N-enlazada(s) producida(s) procede(n) de proteínas de mamífero, bacterianas, víricas, fúngicas o vegetales.
10. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 al 9, en que los ácidos nucleicos que codifican al menos una proteína diana recombinante de acuerdo con c) (ii) de la Reivindicación 1 codifican además al menos una secuencia polipeptídica capaz de dirigir dicha proteína recombinante a la membrana externa de una bacteria Gram negativa.
11. El método de la Reivindicación 10, en que la secuencia polipeptídica de dirección codificada es seleccionada del grupo que consiste en péptidos señal de tipo II y proteínas de membrana externa.
12. El método de la Reivindicación 11, en que el péptido señal de tipo II o la proteína de membrana externa es seleccionado del grupo que consiste en la proteína de longitud completa o los péptidos señal de OmpH1 de C. jejuni, JlpA de C. jejuni, proteínas de la membrana externa de E. coli, OmpA y la proteína Inp de Pseudomonas aeruginosa.
13. El método de la Reivindicación 12, en que la proteína de la membrana externa de E. coli es seleccionada de entre OmpS, OmpC, OmpA, OprF, PhoE, LamB y Lpp.
14. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, en que el organismo recombinante es seleccionado del grupo de bacterias que consiste en Escherichia ssp., Campylobacter ssp., Salmonella ssp., Shigella ssp., Helicobacter ssp., Pseudomonas ssp. y Bacillus ssp.
15. El método de la Reivindicación 14, en que el organismo recombinante es Escherichia coli.
16. El método de la Reivindicación 15, en que el organismo recombinante es seleccionado de entre las cepas Top10, W3110, CLM24, BL21, SCM6 y SCM7 de E. coli.
17. El método de la Reivindicación 12, en que el organismo recombinante es seleccionado de entre las cepas SL3261, SL3749 y SL3261ΔwaaL de S. enterica.
18. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 17, en que dicho organismo recombinante es una bacteria Gram negativa recombinante que tiene:
i) un genotipo que comprende secuencias nucleotídicas que codifican
ii) un fenotipo que comprende la proteína N-glicosilada recombinante producida que está situada en y/o sobre la membrana externa de la bacteria Gram negativa.
19. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 18, en que el operón pgl funcional de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, comprende ácidos nucleicos que codifican
para la ensambladura de un oligosacárido sobre un vehículo lipídico para ser transferido a la proteína diana por la OTasa.
20. El método de la Reivindicación 19, en que la OTasa recombinante y las glicosiltransferasas específicas recombinantes y/o naturales son de C. jejuni.
21. Un método para preparar una bacteria Gram negativa recombinante que tiene:
i) un genotipo que comprende secuencias nucleotídicas que codifican
ii) un fenotipo que comprende la proteína diana N-glicosilada recombinante producida que está situada en y/o sobre la membrana externa de la bacteria Gram negativa;
método que comprende las operaciones de:
22. El método de la Reivindicación 21, en que la al menos una oligosacariltransferasa (OTasa) natural o recombinante de la operación i) b) y la al menos una oligosacariltransferasa (OTasa) recombinante de la operación D) b) son de C. jejuni.
23. El método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 19 a 22, en que la bacteria Gram negativa recombinante es seleccionada del grupo que consiste en Escherichia ssp., Campylobacter ssp., Shigella ssp., Helicobacter ssp., Pseudomonas ssp. y Bacillus ssp.
24. El método de la Reivindicación 23, en que el organismo Gram negativo recombinante es Escherichia coli.
25. El método de la Reivindicación 24, en que el organismo Gram negativo recombinante es seleccionado de entre las cepas las cepas Top10, W3110, CLM24, BL21, SCM6 y SCM7 de E. coli.
26. El método de la Reivindicación 23, en que el organismo Gram negativo recombinante es seleccionado de entre las cepas SL3261, SL3749 y SL3261ΔwaaL de S. enterica.
27. Un organismo procariótico en que se introduce una información genética que comprende ácidos nucleicos que codifican:
en que dicha oligosacariltransferasa enlaza dicho oligosacárido a dicha secuencia de consenso de dichas una o más proteínas diana recombinantes.
28. Un organismo procariótico organizado como se reivindica en la Reivindicación 27, en que el Campylobacter spp. es C. jejuni.
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