Proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis.

Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidosseleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen cry2Afdepositada en la BCCM-LMBP bajo del número de acceso LMBP 4247, b) la secuencia de aminoácidos de laproteína de SEQ ID Nº 4, c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 4 desde la posición 1 de aminoácido a laposición 625 de aminoácido, y d) la secuencia de aminoácidos de una proteína insecticida codificada por un ADNque se hibrida a la secuencia codificadora de cry2Af depositada en la BCCM-LMBP bajo el número de accesoLMBP 4247 bajo condiciones de hibridación rigurosas, teniendo dicho ADN una identidad de la secuencia de almenos el 98% con la secuencia codificadora de SEQ ID Nº 3.

Proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis INTRODUCCIÓN

La presente invención se refiere a nuevas secuencias de ácidos nucleicos, particularmente secuencias de ADN, que codifican proteínas insecticidas producidas por cepas de Bacillus thuringiensis. Particularmente, se proporcionan nuevas secuencias de ácidos nucleicos, particularmente secuencias de ADN que codifican proteínas designadas Cr y 2Af, que son útiles para proteger a las plantas frente a daños causados por insectos. También se incluyen en esta memoria microorganismos y plantas transformadas con una secuencia de ácidos nucleicos, particularmente una secuencia de ADN, que codifica al menos una de las proteínas Cr y 2A recientemente aisladas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

(i) Campo de la invención:

Bacillus thuringiensis (abreviado en esta memoria como “Bt”) es bien conocido por su toxicidad específica a plagas de insectos, y ha sido utilizado desde hace casi un siglo para reprimir las plagas de insectos de plantas. En años más recientes, se produjeron plantas transgénicas que expresan proteínas de Bt que se encontró que reprimían con éxito los daños causados por insectos en plantas (p. ej. Vaeck et al., 1987, Jansens et al., 1997) . A pesar del aislamiento de un cierto número de genes de Bt insecticidas, continúa la búsqueda de nuevos genes que codifiquen proteínas insecticidas. De hecho, se sabe que proteínas de Bt insecticidas tienen una gama de insectos diana relativamente estrecha en comparación con insecticidas químicos. También, el hecho de tener múltiples toxinas contra la misma especie de insecto diana permite el uso de proteínas con diferentes modos de acción, de modo que se puede prevenir o retardar el desarrollo de resistencia de los insectos. Y proteínas Bt insecticidas con diferentes secuencias de aminoácidos tienen diferentes niveles de eficacia insecticida frente a insectos específicos, haciendo deseable tener varias proteínas insecticidas diferentes disponibles con el fin de ser capaces de reprimir las plagas de insectos relevantes de diferentes plantas de cultivo.

(ii) Descripción de Técnica Relacionada:

Previamente se identificaron varios tipos de proteínas Cr y 2A (véase Crickmore et al., 1998, incorporado en esta memoria como referencia) . La proteína Cr y 2Ae tiene la mayor identidad en la secuencia de aminoácidos con la proteína Cr y 2Aa1 (Donovan et al., número de acceso a GenBank M31738) , pero sigue difiriendo en aproximadamente un 9 por ciento de su secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia más próxima a la proteína Cr y 2Af se encontró en la proteína Cr y 2Ab1 (Widner y Whiteley, número de acceso a GenBank M23724) , pero ambas proteínas siguen difiriendo en aproximadamente el 5 por ciento de su secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia más próxima a la proteína Cr y 2Ag se encontró en la proteína Cr y 2Ac1 (Wu et al., número de acceso a GenBank X57252) , pero ambas proteínas siguen difiriendo en aproximadamente un 20 por ciento de sus secuencias de aminoácidos. Proteínas Cr y 2A adicionalmente conocidas incluyen la proteína Cr y 2Ad1 (Choi et al., 1999) , y otras proteínas Cr y 2Aa, Cr y 2Ab y Cr y 2Ac (Crickmore et al., 1998) . Proteínas similares a Cr y 2A y secuencias de ADN que las codifican también se muestran en la patente de EE.UU. 5.338.544, en la solicitud de patente PCT publicada WO 00/26371 y en la solicitud de patente PCT publicada WO 98/40490. La expresión de proteínas de tipo Cr y 2A en plantas ha sido descrita, p. ej., en Kota et al. (1999) y en la solicitud de patente PCT publicada WO 00/26371.

OBJETOS Y SUMARIO DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con esta invención se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos, particularmente una secuencia de ADN, que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen cr y 2Af depositado en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 4247.

Particularmente preferida de acuerdo con esta invención es una secuencia de ácidos nucleicos, particularmente una secuencia de ADN, que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína de

SEQ ID Nº. 4

Además, de acuerdo con esta invención se proporcionan secuencias de ácidos nucleicos, particularmente secuencias de ADN que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº. 4 desde la posición de aminoácido 1 a la posición de aminoácido 625, o una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína insecticida codificada por un ADN que se hibrida a la secuencia codificadora de cr y 2Af depositada en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 4247 bajo condiciones de hibridación rigurosas, teniendo dicho ADN una identidad de la secuencia de al menos el 98% con la secuencia codificante de SEQ ID Nº. 3.

Además, de acuerdo con esta invención se proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos anteriores, particularmente secuencias de ADN, que comprenden una secuencia artificial que tiene una utilización del codón diferente en comparación con la secuencia que se produce de forma natural, pero que codifican la misma proteína

o su fragmento insecticida, preferiblemente dicha utilización del codón se asemeja a la de plantas, particularmente la planta hospedante en la que se ha de transformar la secuencia de ácidos nucleicos, particularmente el ADN.

Incluso adicionalmente se proporciona, de acuerdo con esta invención, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen cr y 2Af depositado en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 4247, una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 4 desde la posición de aminoácido 1 a la posición de aminoácido 625, o una proteína con 5 a 10 aminoácidos añadidos, reemplazados

o suprimidos sin modificar la actividad insecticida de la proteína, o una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína insecticida codificada por un ADN que se hibrida a la secuencia codificadora de cr y 2Af depositada en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 4247 bajo condiciones de hibridación rigurosas, teniendo dicha proteína una identidad de la secuencia de al menos el 98% de la proteína de la SEQ ID Nº 4, de la secuencia codificante de SEQ ID Nº 3.

Particularmente preferida en esta memoria es la proteína según se define en el párrafo precedente que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 4, o una proteína con menos de 5 aminoácidos añadidos, reemplazados o suprimidos sin modificar la actividad insecticida de la proteína.

También se proporcionan en esta memoria genes quiméricos que comprenden el ADN según se define anteriormente bajo el control de un promotor expresable en plantas, y células vegetales, plantas o semillas transformadas de modo que contengan esos genes quiméricos, particularmente células vegetales, plantas o semillas seleccionadas del grupo que consiste en: maíz, algodón, arroz, tabaco, colza oleaginosa, especies de Brassica, berenjena, soja, patata, girasol, tomate, caña de azúcar, té, habas, tabaco, fresa, clavo, pepino, sandía, pimiento, avena, cebada, trigo, dalia, gladiolo, crisantemo, remolacha azucarera, sorgo, alfalfa y cacahuete. De acuerdo con esta invención, el gen quimérico se puede integrar en el ADN nuclear, del plástido o mitocondrial de las células vegetales, o también puede contener un ADN que codifique un péptido diana o de tránsito eficaz para fijarse como objetivo a la vacuola, cloroplasto, mitocondria, plástido, o para la secreción.

Además, de acuerdo con esta invención se proporcionan microorganismos transformados de modo que contengan cualquiera de las secuencias de ADN anteriores, particularmente los seleccionados del género Pseudomonas, Agrobacterium, Escherichia o Bacillus.

También se proporciona en esta memoria un procedimiento para hacer a un planta resistente a un insecto, que comprende transformar células vegetales con los genes quiméricos anteriores, y regenerar plantas transformadas procedentes de este tipo de células que son resistentes a insectos. En una realización, dicho insecto se selecciona del grupo que consiste en: Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armígera, Anticarsia gemmatalis y Ostrinia nubilalis, Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis y Scirpophaga innotata.

Esta invención se refiere también al uso de la proteína definida anteriormente para reprimir insectos seleccionados del grupo que consiste en: Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armígera,... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen cr y 2Af depositada en la BCCM-LMBP bajo del número de acceso LMBP 4247, b) la secuencia de aminoácidos de la proteína de SEQ ID Nº 4, c) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 4 desde la posición 1 de aminoácido a la posición 625 de aminoácido, y d) la secuencia de aminoácidos de una proteína insecticida codificada por un ADN que se hibrida a la secuencia codificadora de cr y 2Af depositada en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 4247 bajo condiciones de hibridación rigurosas, teniendo dicho ADN una identidad de la secuencia de al menos el 98% con la secuencia codificadora de SEQ ID Nº 3.

2. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos es ADN.

3. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 2, que comprende una secuencia de ADN artificial que tiene una utilización de los codones diferente en comparación con la secuencia de ADN que se produce de forma natural, pero que codifica la misma proteína o su fragmento insecticida.

4. Una proteína que comprende una secuencia de ácidos nucleicos, seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen cr y 2Af depositada en la BCCM-LMBP bajo del número de acceso LMBP 4247, b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 4 desde la posición 1 de aminoácido a la posición 625 de aminoácido, o una proteína de este tipo con 5 a 10 aminoácidos añadidos, reemplazados o suprimidos sin modificar la actividad insecticida de la proteína, o c) la secuencia de aminoácidos de una proteína insecticida codificada por un ADN que se hibrida a la secuencia codificadora de cr y 2Af depositada en la BCCM-LMBP bajo el número de acceso LMBP 4247 bajo condiciones de hibridación rigurosas, teniendo dicha proteína una identidad de la secuencia de al menos el 98% con la proteína de SEQ ID Nº 4.

5. La proteína de la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 4, o una proteína de este tipo con menos de 5 aminoácidos añadidos, reemplazados o suprimidos sin modificar la actividad insecticida de la proteína.

6. Un gen quimérico que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 3 o una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de la reivindicación 4 ó 5 bajo el control de un promotor expresable en plantas.

7. El agente quimérico de la reivindicación 6 que comprende, además, un ADN que codifica un péptido diana o de tránsito destinado a fijar como objetivo las vacuolas, mitocondrias, cloroplastos, plástidos, o para la secreción.

8. Células vegetales, plantas o semillas transformadas de modo que comprendan el gen quimérico de la reivindicación 6.

9. Las células vegetales, plantas o semillas de la reivindicación 8, que se seleccionan del grupo que consiste en: maíz, algodón, arroz, tabaco, colza oleaginosa, especies de Brassica, berenjena, soja, patata, girasol, tomate, caña de azúcar, té, habas, tabaco, fresa, clavo, pepino, sandía, pimiento, avena, cebada, trigo, dalia, gladiolo, crisantemo, remolacha azucarera, sorgo, alfalfa y cacahuete.

10. Un microorganismo transformado de modo que comprenda la secuencia de ácidos nucleicos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Un procedimiento para hacer a una planta resistente a un insecto, que comprende transformar células vegetales con el gen quimérico de la reivindicación 6, y regenerar plantas transformadas a partir de dichas células que son resistentes a insectos.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho insecto se selecciona del grupo que consiste en: Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armígera, Anticarsia gemmatalis y Ostrinia nubilalis, Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis y Scirpophaga innotata.

13. Uso de la proteína de la reivindicación 4 ó 5 para reprimir insectos seleccionados del grupo que consiste en: Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Helicoverpa armígera, Anticarsia gemmatalis y Ostrinia nubilalis, Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Sesamia inferens, Cnaphalocrocis medinalis, Marasmia patnalis, Marasmia exigua, Marasmia ruralis y Scirpophaga innotata.