Proteínas de fusión humanas recombinantes de EPO-Fc con vida media prolongada y actividad eritropoyética in vivo mejorada.

Una proteína de fusión que tiene una vida media prolongada in vivo en comparación con origen natural o recombinante humana nativa que comprende eritropoyetina:

(a) una parte de péptido de eritropoyetina que tiene un residuo cisteína en la proximidad de un terminal C de la misma, directamente ligado a

(b) un fragmento humano de Fc IgG1 que comprende una región bisagra y los dominios CH2 y CH3, en donde dicha región bisagra tiene

(i) la secuencia de aminoácidos VEPKSGDKTSTCPPCP o

(ii) una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a la misma y que tiene un residuo de no-cisteína en el aminoácido 6 medido desde el N-terminal de dicha región bisagra,

mediante el cual el residuo de cisteína de dicha región bisagra situada más cerca de dicha porción de péptido de eritropoyetina está separado al menos 12 aminoácidos aparte de dicho residuo de cisteína de dicha porción de péptido de eritropoyetina.

Proteínas de fusión humanas recombinantes de EPO-Fc con vida media prolongada y actividad eritropoyética in vivo mejorada.

Campo Técnico

Esta aplicación se refiere a proteínas de fusión de la eritropoyetina humana.

Antecedentes 10

La eritropoyetina humana (EPO por sus siglas en ingles) , un miembro de la familia del factor de crecimiento hematopoyético, se sintetiza principalmente en el riñón adulto y el hígado fetal en respuesta a la hipoxia tisular debido a la disminución de la disponibilidad de oxígeno en la sangre [1]. La función principal de la EPO es actuar directamente sobre ciertos progenitores y precursores de glóbulos rojos en la médula ósea para estimular la síntesis 15 de la hemoglobina y los glóbulos rojos maduros. También controla la proliferación, la diferenciación y maduración de los glóbulos rojos. La eritropoyetina humana recombinante tiene la misma secuencia de aminoácidos al igual que la eritropoyetina de origen natural, se ha producido y aprobado para tratar la anemia asociada con la insuficiencia funcional del riñón, cáncer y otras condiciones patológicas [2]. Además de sus propiedades eritropoyéticas, informes de investigación recientes [3] indican que la EPO también actúa sobre células de la médula no ósea tales como las 20 neuronas, lo que sugiere otras posibles funciones fisiológicas / patológicas de la EPO en el sistema nervioso central (CNS por sus siglas en ingles) y otros órganos / sistemas . Dado que los receptores de EPO se han encontrado en muchos órganos diferentes, la EPO puede tener múltiples efectos biológicos, como el de actuar como un agente anti-apoptótico.

La eritropoyetina humana es una glicoproteína con un peso molecular de 30, 4 kilodaltons. Los hidratos de carbono representan aproximadamente 39% de su masa total. El gen eritropoyético se encuentra en el cromosoma 7q11-22 y se extiende por una región de 5.4kb con cinco exones y cuatro intrones [4]. El precursor de la EPO consiste en 193 aminoácidos. De la escisión de la secuencia líder y el último aminoácido Arg por modificación post-traduccional se obtiene la EPO madura que teniendo esta 165 aminoácidos. La glicosilación, con tres sitios ligados a 30 N en Asn 24, Asn38, Asn83 y un sitio O-ligado en Ser126, juega un papel crucial en la biosíntesis, estructura terciaria y la bioactividad in vivo de la EPO [5]. La EPO funciona uniendola a un receptor de la eritropoyetina, una transmembrana glicosilada y fosforilada polipéptida con el peso molecular de 72-78 kilodaltons. Esta unión provoca la homodimerización de los receptores que conducen a la activación de varias vías de transducción de señales: JAK2 / STAT5 del sistema, proteínas G, canales de calcio, y quinasas. Se necesitan dos moléculas de proteína EPO 35 para unirse simultáneamente a una molécula de receptor para lograr una óptima activación de receptores[6].

0004] Como el primer factor de crecimiento hematopoyético aprobado para la terapia humana, la EPO humana recombinante (rHuEPO por sus siglas en ingles) se ha utilizado para el tratamiento de la anemia resultante de la insuficiencia renal crónica, cánceres (principalmente anemia asociada a la quimioterapia) , enfermedades 40 autoinmunes, SIDA, cirugía, trasplante de médula ósea y los síndromes mielodisplásicos, etc. Curiosamente, los estudios recientes han observado también que la rHuEPO tiene funciones que no pertenecen al sistema sanguineo y muestra el potencial de ser utilizado como un fármaco neuroprotector para la isquemia cerebral, trauma cerebral, enfermedad inflamatoria y trastornos degenerativos neuronales [7] .

Actualmente, tres tipos de rHuEPO o rHuEPO análogos están disponibles comercialmente, principalmente a rHuEPO alfa, rHuEPO beta, y darbepoetina alfa [8]. Estas tres proteínas recombinantes se unen al mismo receptor de la eritropoyetina, pero difieren en estructura, grado de glicosilación, afinidad de unión al receptor y metabolismo in vivo. Desde la introducción inicial de rHuEPO-alfa en la década de 1980, los médicos reconocieron rápidamente el requisito de dosis / inyección frecuente de la droga como una deficiencia significativa. La media de la vida media in 50 vivo de la rHuEPO alfa y beta administradas por vía intravenosa o subcutánea son sólo 8, 5 y 17 horas, respectivamente [9, 10]. Por lo tanto, los pacientes necesitan un horario de inyección diario, dos o tres veces por semana, lo cual impone una carga para los pacientes y profesionales de la salud. Por lo tanto, ha habido una necesidad desde hace mucho tiempo de desarrollar eritropoyetinas recombinantes análogas que tienen una media-vida in vivo mas larga y / o aumento de la actividad eritropoyética. 55

Se han hecho intentos en la técnica anterior para cambiar genéticamente o modificar químicamente la estructura de la proteína de la eritropoyetina nativa, ya sea ralentizando su metabolismo in vivo o mejorando sus propiedades terapéuticas. Por ejemplo, parece que hay una correlación directa entre las cantidades de hidratos de carbono que contienen ácido siálico de la molécula de EPO y su metabolismo in vivo y la actividad funcional. Si se 60 aumenta el contenido de hidratos de carbono de la molécula de EPO, por consecuencia resultara con una vida media más larga y actividades mejoradas in vivo [11, 12]. Amgen ha diseñado la rHuEPO darbepoetina alfa analógica que incluye 5 ligados a N cadenas de carbohidratos, dos más que la rHuEPO. La darbepoetina alfa, también conocida como la proteína novel estimulante de la eritropoyesis (NESP por sus siglas en ingles) y se vende bajo la marca comercial AranespTM. Darbepoetina alfa difiere de EPO humana nativa en cinco posiciones 65 (Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn, Pro90Thr) que permite la unión de dos oligosacáridos adicionales ligados a N en las posiciones de residuos asparagina 30 y 88. La darbepoetina alfa se une al receptor de la EPO en una manera idéntica que la EPO nativa para inducir la señalización intracelular que implica la fosforilación de la tirosina por JAK-2 cinasa y las mismas moléculas intracelulares Ras / MAP-k, P13-k y STAT-5. Debido al mayor contenido en carbohidratos, la vida media de la darbepoetina alfa en animales y seres humanos es casi tres veces más larga que la de la rHuEPO- alfa (25, 3 horas frente a 8, 5 horas) [9]. La Darbepoetina alfa (AranespTM) también parece 5 mostrar una mayor bioactividad en comparación con la EPO de origen natural o la EPO humana recombinante in vivo [13] y ha sido aprobada por la FDA como un medicamento rHuEPO de segunda generación; este fármaco sólo necesita ser administrado una vez por semana para alcanzar los efectos terapéuticos iguales que los de inyectarse 2-3 veces por semana de rHuEPO [10, 14, 15].

Otros intentos para prolongar la vida media de la EPO se han centrado en aumentar el peso molecular de la proteína EPO a través de la conjugación química con polietilenglicol y similares. PEGylated- EPO tiene un peso molecular mucho más grande y está protegido de ser eliminado de la circulación y por lo tanto tiene una vida media plasmática más larga [16]. Sin embargo, la PEGilación puede alterar la estructura de la proteína resultante en los cambios imprevistos de la función y la especificidad de la mitad de EPO. También hay informes del aumento del 15 peso molecular de la EPO por otros métodos, tales como enlazar la molécula de EPO a una proteína portadora (albúmina humana) , o para formar la homodimerización de dos moléculas completas de EPO mediante el uso de péptidos que unen (de 3 a 17 -aminoácidos) o por químicos reactivos de reticulación [17, 18, 19, 20]. Aunque todos estos métodos han logrado cierto éxito en la extensión de la vida media y la mejora de las actividades de la EPO, la combinación de la molécula de EPO con el fragmento Fc de la inmunoglobulina humana (IgG por sus siglas en 20 ingles) en una proteína de fusión como se describe en la presente solicitud logra ventajas únicas.

La inmunoglobulina IgG humana se compone de cuatro polipéptidos enlazados covalentemente por enlaces de disulfuro (dos copias idénticas de la cadena ligera y la cadena pesada) . La proteolisis de la IgG molécula por papaína genera dos fragmentos Fab y un fragmento Fc. El fragmento Fc consta de dos polipéptidos unidos entre sí 25 por enlaces de disulfuro. Cada polipéptido, a partir de N- a C-terminal, se compone de una región bisagra, un dominio de CH2 y un dominio de CH3. La estructura fragmento de Fc es casi la misma entre todos los subtipos de inmunoglobulina humana. La IgG se encuentra entre una de las proteínas más abundantes en la sangre humana y constituye del 70 a 75% de las inmunoglobulinas totales en el suero humano. La vida media de la IgG en la circulación es la más larga entre todos... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión que tiene una vida media prolongada in vivo en comparación con origen natural o recombinante humana nativa que comprende eritropoyetina:

(a) una parte de péptido de eritropoyetina que tiene un residuo cisteína en la proximidad de un terminal C de la misma, directamente ligado a

(b) un fragmento humano de Fc IgG1 que comprende una región bisagra y los dominios CH2 y CH3, en donde dicha región bisagra tiene 10

(i) la secuencia de aminoácidos VEPKSGDKTSTCPPCP o (ii) una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia a la misma y que tiene un residuo de no-cisteína en el aminoácido 6 medido desde el N-terminal de dicha región bisagra,

mediante el cual el residuo de cisteína de dicha región bisagra situada más cerca de dicha porción de péptido de 15 eritropoyetina está separado al menos 12 aminoácidos aparte de dicho residuo de cisteína de dicha porción de péptido de eritropoyetina.

2. La proteína tal como se define en la reivindicación 1, en el que la vida media de dicha proteína es al menos tres veces mayor que dicha eritropoyetina humana nativa, y preferiblemente tiene una mayor bioactividad eritropoyética 20 en comparación con dicho eritropoyetina humana nativa.

3. Un constructo de proteína dimérica que comprende dos proteínas de fusión como se define en la reivindicación 1.

4. El constructo de proteína dimérica de la reivindicación 3 donde las dos proteínas de fusión donde cada uno 25 comprende la secuencia de aminoácidos presente en SEQ ID No: 2.

5. Una composición farmacéutica que comprende una proteína como se define en la reivindicación 1 junto con un vehículo aceptable, adyuvante o diluyente farmacéuticamente.

6. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 1.

7. Una línea de células transfectadas con una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 6.

8. Un método para producir una proteína como se define en la reivindicación 1, que comprende cultivar una línea celular transfectada con una molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en la reivindicación 7 y purificar el polipéptido codificado por el mismo.

9. La proteína tal como se define en la reivindicación 1 o la composición farmacéutica como se define en la 40 reivindicación 5 para la estimulación de la eritropoyesis en un mamífero.

10. La proteína de fusión como se define en la reivindicación 1, en el que dicho residuo no-cisteína es un aminoácido neutro, preferiblemente glicina.

11. Un dímero que comprende la primera y segunda proteína de fusión cada uno como se define en la reivindicación 1, en donde dicha región bisagra de dicha primera proteína de fusión se une a dicha región de bisagra de dicha segunda proteína de fusión por enlaces disulfuro.