Una célula de una planta transgénica transformada por ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) el cual es Proteína Fosfatasa 2A-2,

en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de la célula de la planta de tipo silvestre, en donde la PHSRP es una PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11 o secuencias que son al menos aproximadamente 50 - 60% idénticas a la secuencia entera de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:11

Proteínas fosfatasas relacionadas con el estrés y métodos de utilización en plantas.

Antecedentes de la invención

Esta invención se relaciona generalmente con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que están asociadas con respuestas al estrés abiótico y tolerancia al estrés abiótico en plantas. En particular, esta invención se relaciona con secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que le confieren a las plantas tolerancia a la sequía y/o a la temperatura.

Los estreses ambientales abióticos, tales como el estrés por sequía, el estrés por salinidad, el estrés por calor, y el estrés por frío, son los principales factores limitantes del crecimiento y la productividad de la planta. Las pérdidas de cultivos y las pérdidas de rendimiento de la mayoría de los cultivos tales como arroz, maíz y trigo provocadas por estos estreses representan un factor económico y político significativo y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países no desarrollados.

Las plantas están típicamente expuestas durante su ciclo de vida a condiciones de un contenido reducido de agua en el medio ambiente. La mayoría de las plantas tienen estrategias evolucionadas para protegerse contras estas condiciones de desecación. Sin embargo, si la severidad y la duración de las condiciones de sequía son muy grandes, los efectos sobre el desarrollo, crecimiento y rendimiento de la mayoría de las plantas son profundos. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles a altas concentraciones de sal en el suelo. La exposición continua a la sequía y a altas concentraciones de sal provoca alteraciones importantes en el metabolismo de las plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo hbox{conducen en última instancia a la muerte celular y por consiguiente a pérdidas en el rendimiento.}

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial de resolver o de mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de fitomejoramiento para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiben resistencia (tolerancia) a esos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzamiento con la línea deseada. Los recursos limitados de germoplasma para tolerancia al estrés e incompatibilidad en cruzamientos entre especies de plantas relacionadas en forma distante representan problemas significativos encontrados en la crianza tradicional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia a la sequía, al frío y a la sal en plantas modelo tolerantes a la sequía y/o a la sal son de naturaleza compleja e involucran múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas. Esta tolerancia al estrés de naturaleza múltiple ha hecho que la tolerancia al estrés sea no solamente poco exitosa, sino que también tiene una habilidad limitada para modificar por medio de ingeniería genética plantas tolerantes al estrés utilizando métodos biotecnológicos.

Está bien reconocido que la fosforilación reversible de proteínas controla muchos procesos celulares en plantas y animales. El estatus de la fosforilación de proteínas está regulado por las actividades opuestas de proteína quinasas y proteína fosfatasas. La fosforilación de proteína eucariota ocurre predominantemente sobre residuos de serina y treonina, y en menor grado, sobre residuos de tirosina. En animales, la fosforilación de proteína juega papeles bien conocidos en diversos procesos celulares tales como el metabolismo del glicógeno, el control del ciclo celular, y la transducción de señales (Smith, R. D. y Walker, J. C., 1996, Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 47: 101 - 125).

Las actividades de la proteína fosfatasa han sido reportadas en la mayoría de los compartimientos subcelulares de la planta, incluidos mitocondria, cloroplasto, núcleos y el citosol, y están asociadas con diferentes fracciones de membrana y de partículas. Algunas proteína fosfatasas están pobremente caracterizadas y pueden representar nuevas enzimas que son únicas para las plantas. Otras tienen propiedades bioquímicas que son muy similares a proteína fosfatasas de mamífero bien conocidas, tales como proteína serina/treonina fosfatasas citosólicas (MacKintosh C. y Cohen P. 1989 Biochem. J. 262: 335 - 339). Dos de tales serina/treonina fosfatasas de la planta se ha identificado que funcionan de manera similar a la proteína serina/treonina fosfatasas tipo 1 (PP1) y tipo 2 (PP2) de mamífero. Estudios bioquímicos y genéticos en plantas implican actividad de PP1 y/o PP2 en transducción de señales, regulación hormonal, mitosis, y control del metabolismo del carbono y del nitrógeno (Smith, R. D. y Walker, J. C., 1996, Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 47: 101 - 125).

Evidencia experimental ha implicado la participación de proteína fosfatasas en la cascada de señalización por estrés de la planta, y más particularmente, en la percepción del estrés y transducción de la señal enlazada a mecanismos fisiológicos de adaptación en plantas. Por ejemplo, la proteína fosfatasa 2C (PP2C) ha demostrado estar involucrada en respuestas al estrés en plantas (Sheen, J. 1998 Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 975 - 980). Se ha demostrado también que, en levadura, la PP2B fosfatasa calcineurina (CaN) es un componente central de una ruta para transducción de la señal que depende de Ca²⁺ que media la tolerancia al Na⁺, Li^-, y Mn²⁺ de Saccharomyces cerevisiae (Cunningham, K. W. y Fink, G. R. 1996 Mol. Cell. Biol. 16: 2226 - 2237). CaN actúa para limitar la acumulación intracelular de Na⁺ por medio de procesos de regulación que restringen la afluencia y mejoran el eflujo de este catión a través de la membrana plasmática.

CaN también participa en homeostasis citosólica de Ca²⁺ a través de la regulación positiva del aparato de Golgi y de bombas de iones de tipo P localizadas en la membrana vacuolar y del control negativo de un intercambiador vacuolar de H⁺/Ca²⁺. En forma muy interesante, la sobreexpresión de CaN de levadura confiere tolerancia a la sal en las plantas, lo cual indica fuertemente que la modulación de las rutas de señalización del estrés por medio de la expresión de una proteína fosfatasa activada mejora sustancialmente la tolerancia al estrés por parte de la planta (Pardo, J. M. y colaboradores.1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9681 - 9686).

Aunque algunos genes que están involucrados en respuestas al estrés en las plantas han sido caracterizados, la caracterización y clonación de genes de plantas que confieren tolerancia al estrés sigue siendo muy incompleta y fragmentada. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que el estrés por sequía y sal en algunas plantas puede ser debido a efectos génicos aditivos, en contraste con otra investigación que indica que genes específicos son transcripcionalmente activados en tejido vegetativo de plantas bajo condiciones de estrés osmótico. Aunque generalmente se asume que las proteínas inducidas por estrés juegan un papel en la tolerancia, se carece aún de evidencia directa, y las funciones de muchos genes sensibles al estrés son desconocidas.

Andreeva A y colaboradores, 1999 (Journal of Plant Physiology, vol. 155, no. 2, Agosto 1999, páginas 153 - 158), divulgan la detección de cuatro isoformas de Proteína Fosfatasa 2A en Physcomitrella patens. La detección se lleva a cabo utilizando reacción en cadena de la polimerasa sobre ADNc y genómico de Physcomitrella patens.

Hendershot J. D. y colaboradores, 1999 (DATABASE UniProt 1 Noviembre 1999, "subunidad reguladora B de 62 kDa de la Proteína Fosfatasa 2A" XP-002458411 recuperada del EBI, acceso no. Q9XGR4, Base de Datos con acceso no. Q9XGR4-ARATH), divulgan el suplemento regulador B de 62 kDa de la Proteína Fosfatasa 2A de Arabidopsis thaliana.

Hendrix. P. y colaboradores, 1994 (DATABASE UniProt 1 Junio 1994, "Subunidad reguladora B de 72/130 kDa de la proteína fosfatasa 2A de Serina/Treonina" XP-002458413 recuperada del EBI acceso no. G106190, Base de Datos con acceso no. P2R3A_HUMAN), divulgan el suplemento regulador B de 72/130 kDa de la Proteína Fosfatasa 2A de serina/treonina de Homo sapiens.

Por lo tanto existe la necesidad de identificar genes expresados en plantas tolerantes al estrés que tengan la capacidad para conferir resistencia al estrés a su planta hospedadora y a otra especie de...

1. Una célula de una planta transgénica transformada por ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) el cual es Proteína Fosfatasa 2A-2, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de la célula de la planta de tipo silvestre, en donde la PHSRP es una PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11 o secuencias que son al menos aproximadamente 50 - 60% idénticas a la secuencia entera de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:11.

2. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde la PHSRP es una PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11.

3. La célula de la planta transgénica de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que codifica una PHSRP es PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 6.

4. La célula de la planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde el ácido nucleico que codifica una PHSRP es aproximadamente al menos 50 - 60% idéntico a la secuencia de la SEQ ID NO: 6 sobre la región entera de codificación.

5. La célula de la planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde la planta es una monocotiledónea.

6. La célula de la planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde la planta es una dicotiledónea.

7. La célula de la planta transgénica de la Reivindicación 1, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, maní, algodón, semilla de colza, canola, yuca, pimienta, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especie Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especie Salix, palma aceitera, coco, hierba perenne y cultivos de forraje.

8. Una planta transgénica que comprende una célula de una planta de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 7.

9. Una semilla producida por una planta transgénica que comprende una célula de una planta de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde la semilla es una línea genéticamente pura para mayor tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula de la planta.

10. El uso de una planta o semilla de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9 para la producción de un producto agrícola.

11. Una Proteína Fosfatasa aislada Relacionada con el Estrés (PHSRP), en donde la PHSRP es la Proteína Fosfatasa 2A-2 (PP2A-2) como se define en la SEQ ID NO:11 o secuencias que son al menos 70 - 80% idénticas a la secuencia entera de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11.

12. La PHSRP de la Reivindicación 11, en donde la PHSRP es PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11.

13. Un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa aislada Relacionada con el Estrés (PHSRP), en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP codifica para Proteína Fosfatasa 2A-2 (PP2A-2) como se define en la SEQ ID NO:11 o secuencias que son al menos 70 - 80% idénticas a la secuencia entera de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11.

14. El ácido nucleico que codifica la PHSRP de la Reivindicación 13, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 6.

15. El ácido nucleico que codifica la PHSRP de la Reivindicación 13, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es al menos 70 - 80% idéntico a la secuencia de la SEQ ID NO: 6 sobre la región entera de codificación.

16. Un vector aislado de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de las Reivindicaciones 14 ó 15, en donde la expresión del vector en una célula huésped resulta en una mayor tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped.

17. Un método para producir una planta transgénica que contiene un ácido nucleico que codifica una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) que es una Proteína Fosfatasa 2A-2 (PP2A-2), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta, que comprende la transformación de una célula de una planta con un vector de expresión que comprende al ácido nucleico, la generación a partir de la célula de la planta de una planta transgénica con una mayor tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta, en donde la PHSRP es una PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11 o secuencias que son al menos aproximadamente 50 - 60% idénticas a la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la PHSRP es PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11.

19. El método de la Reivindicación 17, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 6.

20. El método de la Reivindicación 19, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es al menos 50 - 60% idéntico a la secuencia de la SEQ ID NO: 6 sobre la región entera de codificación.

21. Un método para modificación de la tolerancia al estrés por sequía y/o temperatura de una planta que comprende modificar la expresión de una Proteína Fosfatasa Relacionada con el Estrés (PHSRP) la cual es la Proteína Fosfatasa 2A-2 en la planta, en donde la PHSRP es una PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11 o secuencias que son aproximadamente al menos 50 - 60% idénticas a la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11.

22. El método de la Reivindicación 21, en donde la PHSRP es PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 11.

23. El método de la Reivindicación 21, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es PP2A-2 como se define en la SEQ ID NO: 6.

24. El método de la Reivindicación 21, en donde el ácido nucleico que codifica la PHSRP es al menos 50 - 60% idéntico a la secuencia de la SEQ ID NO: 6 sobre la región entera de codificación.

25. El método de la Reivindicación 21, en donde la tolerancia al estrés se incrementa.

26. El método de la Reivindicación 21, en donde la tolerancia al estrés se disminuye.

27. El método de la Reivindicación 21, en donde la planta no es transgénica.

28. El método de la Reivindicación 21, en donde la planta es transgénica.

29. El método de la Reivindicación 28, en donde la planta es transformada con un promotor que dirige la expresión de la PHSRP.

30. El método de la Reivindicación 29, en donde el promotor es específico del tejido.

31. El método de la Reivindicación 29, en donde el promotor es regulado en función del desarrollo.