Proteínas elastasas recombinantes y procedimientos de fabricación y uso de las mismas.

Una proteína elastasa pancreática tipo I autoactivante que comprende (i) una secuencia de activación de elastasaque comprende una secuencia de reconocimiento de elastasa operativamente ligada a (ii) la secuencia deaminoácidos de una elastasa pancreática tipo I madura.

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos recombinantes de fabricación y formulación de proteínas elastasas para su uso en el tratamiento y la prevención de enfermedades de conductos biológicos. La presente invención se refiere además a novedosas proteínas elastasas recombinantes y composiciones farmacéuticas que contienen tales proteínas. Todavía además, la presente invención se refiere al uso de composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas elastasas recombinantes para el tratamiento y la prevención de enfermedades de conductos biológicos.

2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La elastina es una proteína que puede reenrollarse espontáneamente después de estirarse. La elastina reticulada es el principal componente estructural de las fibras elásticas, que confiere elasticidad al tejido. Una proteinasa puede llamarse una elastasa si posee la capacidad para solubilizar elastina reticulada madura (Bieth, JG “Elastases: catalytic and biological properties” en las pág. 217-320 (Mecham Edition, Regulation of Matrix Accumulation, Nueva York, Academic Press, 1986) . Varias solicitudes de patente publicadas (documentos WO 2001/21574; WO 2004/073504; y WO 2006/036804) indican que la elastasa, sola y en combinación con otros agentes, es beneficiosa en el tratamiento de enfermedades de conductos biológicos, que incluyen conductos biológicos que están experimentando, o susceptibles a experimentar, obstrucción y vasoespasmo. Para terapia con elastasa de sujetos humanos se desea el uso de una elastasa humana para reducir el riesgo de reacción inmunitaria a una elastasa no humana.

Sin embargo, hasta la fecha, no hay medios viables comercialmente conocidos de producción de elastasa biológicamente activa en forma suficientemente pura y en cantidades suficientes para aplicaciones clínicas. Debido a que las elastasas son poderosas proteasas que pueden hidrolizar numerosas proteínas distintas de elastina, la actividad proteolítica de la elastasa posee posibles obstáculos para su producción recombinante. Por ejemplo, la actividad de elastasa madura puede dañar la célula huésped que está expresándola, degradarse a sí misma o degradar agentes usados para ayudar en la producción o caracterización de la elastasa.

Las elastasas se expresan frecuentemente como preproproteínas, que contienen un péptido señal, un péptido de activación y una porción activa madura. La escisión de la secuencia señal tras la secreción da una proproteína que puede tener poca o ninguna actividad enzimática, y cuya secuencia de aminoácidos contiene la secuencia de aminoácidos de un péptido de activación y una proteína madura. Generalmente, para expresión recombinante, un precursor inactivo puede expresarse en lugar de la enzima activa madura para evadir el daño a la célula que la expresa. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 5.212.068 describe la clonación de ADNc de elastasa pancreática humana (denominada allí dentro elastasa “IIA”, “IIB”, “IIIA” y “IIIB”) . Las diversas elastasas se expresaron como ADNc de longitud completa, que incluyen las secuencias señal nativas, en células COS-1 de mamífero. Además, versiones manipuladas de las elastasas, que contienen una secuencia señal de B. subtilis y una secuencia señal de º-galactosidasa, también se expresaron en B. subtilis y E. coli, respectivamente. La patente de EE.UU. nº 5.212.068 también sugiere que expresa elastasas en S. cerevisiae. Generalmente, ejemplos de trabajo de expresión de elastasa en la patente de EE.UU. nº 5.212.068 muestran baja actividad de la elastasa recuperada o requieren una etapa de activación que implica tratamiento con tripsina, para generar la elastasa activa. Además, las elastasas estuvieron ampliamente presentes en cuerpos de inclusión cuando se expresaron en E. coli, y solo pequeñas porciones de la elastasa expresada fueron solubles y activas. Ninguna de las preparaciones de elastasa descritas en la patente de EE.UU. nº 5.212.068 se purificó a calidad farmacéutica.

Dall'Acqua y col., 1999, Protein Engineering 12, pág. 981-986, desvela la expresión y secreción del tipo de elastasa de neutrófilos humanos recombinantes de Pichia pastoris, y menciona la ausencia de la pro secuencia de elastasa, que por tanto no necesita una etapa de activación.

Así, hay una necesidad en la materia de procedimientos de fabricación recombinantes que permitan la generación de cantidades terapéuticas de elastasas de calidad farmacéutica biológicamente activas, y preferentemente eviten una etapa de activación de tripsina que es costosa para preparación a gran escala y puede producir contaminación por tripsina del producto final. La administración de una elastasa que contiene tripsina a un paciente podría producir la activación de los receptores 1 y 2 activados por proteasa, que puede reducir algunos de los efectos beneficiosos del tratamiento de elastasa.

La citación o identificación de cualquier referencia en la Sección 2 o en cualquier otra sección de la presente solicitud no debe interpretarse como una admisión de que tal referencia esté disponible como técnica anterior a la presente invención.

3. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones. Hasta el punto de que la siguiente descripción puede explicar detalles referentes a la materia que no está cubierta por las reivindicaciones, tal materia se proporciona para información solo.

La presente invención proporciona procedimientos eficaces novedosos de preparación de proteínas elastasas recombinantes y el uso de las proteínas recombinantes en composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, formulaciones de elastasa o dosificaciones unitarias, para el tratamiento y prevención de enfermedades de conductos biológicos.

La presente invención se refiere a proteínas proelastasas auto-activadas, ácidos nucleicos que codifican proteínas proelastasas auto-activadas, células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos, procedimientos de preparación de proteínas proelastasas auto-activadas y el uso de proteínas proelastasas auto-activadas en la fabricación de proteínas elastasas biológicamente activas maduras, por ejemplo, para su uso en formulaciones farmacéuticas. El término “auto-activadas” (o “autoactivadas”) se usa en el presente documento indistintamente con el términos “auto-activante” y no pretende implicar que ha tenido lugar una etapa de activación. El término “activación” se usa en el presente documento indistintamente con el término “conversión” y no pretende implicar que una proteína resultante de “activación” posea necesariamente actividad enzimática.

Como se usa en el presente documento más adelante, y a menos que se indique lo contrario, el término “elastasa” generalmente se refiere a proteínas elastasas maduras con actividad de elastasa, además de proteínas elastasas inmaduras, que incluyen proteínas proelastasas inmaduras (también denominadas en el presente documento proproteínas elastasas) y proteínas preproelastasas inmaduras (también denominadas en el presente documento preproproteínas elastasas) .

Las elastasas preferidas de la invención son elastasas pancreáticas tipo I, por ejemplo, elastasa pancreática tipo I humana y elastasa pancreática tipo I porcina. Las elastasas pancreáticas tipo I se denominan algunas veces en el presente documento “elastasa-1”, “elastasa I”, “elastasa tipo 1”, “elastasa de tipo 1” o “ELA-1”. La elastasa pancreática tipo I humana también se denomina en el presente documento hELA-1 o ELA-1 humana, y la elastasa pancreática tipo I porcina también se denomina en el presente documento pELA-1 o ELA-1 porcina.

Una proteína elastasa madura de la invención tiene normalmente una secuencia de aminoácidos codificada por un gen elastasa que se produce naturalmente o una variante de tal secuencia. Variantes de secuencia preferidas, que incluyen variantes que contienen sustituciones de aminoácidos, se describen en el presente documento. Una proteína proelastasa es un precursor ampliamente inactivo de una proteína elastasa madura, y una proteína preproelastasa contiene además una secuencia señal para la secreción de proteína. Pre y pro secuencias de las proteínas elastasas de la invención son normalmente no nativas para los genes de elastasa que codifican las proteínas elastasas maduras de la invención. Así, en un sentido, las proteínas elastasas inmaduras de la invención son proteínas “quiméricas”, con sus porciones maduras codificadas por... [Seguir leyendo]

1. Una proteína elastasa pancreática tipo I autoactivante que comprende (i) una secuencia de activación de elastasa que comprende una secuencia de reconocimiento de elastasa operativamente ligada a (ii) la secuencia de aminoácidos de una elastasa pancreática tipo I madura.

2. La proteína de la reivindicación 1,

en la que el segundo residuo de aminoácido en el extremo N para el enlace que se escinde para dar proteína elastasa pancreática tipo I madura es prolina, o en la que dicha secuencia de reconocimiento de elastasa comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 11, 13, 15, 20 y 93, o en la que dicha secuencia de activación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 80, 72 y 73, o en la que dicha proteína comprende un dominio de escisión que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 42, 48, 49, 53 y 55, en la que opcionalmente dicha secuencia de elastasa madura comprende una secuencia que tiene al menos el 85% de identidad de secuencias con la secuencia de aminoácidos de la posición 6 hasta el extremo de SEC ID Nº: 84 o SEC ID Nº: 1, o en la que dicha proteína comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 64, 65, 67 y 69; y/o en la que dicha proteína contiene una secuencia señal.

3. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

5. Una célula huésped genéticamente manipulada para expresar la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3,

o una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 4, en la que opcionalmente al menos una copia de dicho vector está integrada en el genoma de la célula huésped.

6. Un procedimiento de producción de una proteína elastasa pancreática tipo I, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 5 en condiciones en las que se produzca una proteína proelastasa, que comprende adicionalmente opcionalmente someter la proteína a condiciones de activación de forma que se produzca una proteína elastasa pancreática tipo I madura.