Proteínas de fusión.

Un polipéptido de fusión para la expresión en una célula hospedadora,

en el que dicho polipéptido de fusión tiene,en la secuencia, una estructura básica que comprende un extremo N terminal, un dominio TolAIII para obtener unaexpresión aumentada del polipéptido de fusión en la célula hospedadora, una proteína compañera no TolA cuyaexpresión se desea y un extremo C terminal y que opcionalmente también comprende una etiqueta de purificaciónpor afinidad.

Proteínas de fusión

La presente invención se refiere a proteínas de fusión (polipéptidos de fusión) , particularmente para su uso en sistemas de expresión y/o purificación.

Las proteínas purificadas son necesarias para diversas aplicaciones. Sin embargo, algunas veces, el aislamiento de proteínas puras en cantidades suficientes es problemático. Para estudios de función de proteínas, a menudo se necesitan grandes cantidades de una proteína de interés (por ejemplo una proteína mutada) . Para la producción de proteínas heterólogas se han usado diversos sistemas de expresión. Escherichia coli (E. coli) continúa siendo el hospedador más común a pesar de los enormes avances realizados en otros hospedadores en el área de la expresión de proteínas en los diez últimos años. E. coli es muy conocida porque la expresión de proteínas en la bacteria es relativamente sencilla y existe una inmensa cantidad de conocimiento sobre la propia bacteria y por (lo que algunas veces es más importante) el bajo coste asociado con la producción.

Las proteínas que pueden expresarse en E. coli directamente o como fusiones (de un “compañero de fusión” y una proteína o polipéptido) , también se conocen como proteínas de fusión. La finalidad de los compañeros de fusión es proporcionar etiquetas de afinidad (por ejemplo una etiqueta Hisn, etiquetas de glutatión-S-transferasa, de dominio de unión a celulosa, de inteína) para hacer proteínas más solubles (por ejemplo glutatión-S-transferasa) , para permitir la formación de enlaces disulfuro (por ejemplo tiorredoxina) o para exportar proteínas fusionadas al periplasmo donde las condiciones para la formación de enlaces disulfuro son más favorables (por ejemplo, DsbA y DsbC) . Las proteínas usadas como compañeros de fusión son normalmente pequeñas (menores de 30 kDa) .

La proteína TolA es una proteína periplasmática implicada en (1) mantener la integridad de la membrana interna y

(2) la captación de colicinas y bacteriófagos. La primera función se pone de manifiesto por el aumento de la inestabilidad de la membrana externa (por ejemplo sensibilidad a SDS) de mutantes TolA-. Diversos autores han demostrado esta función y puede depender de la interacción con la proteína TolB (Levengood-Freyermuth et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 222-228; Wan & Baneyx, 1998, Protein Expression & Purification 14: 13-22) . Wan y Banex (1998, citado anteriormente) han demostrado que la co-expresión del dominio TolAIII C-terminal de TolA (véase más adelante) facilita la recuperación de proteínas recombinantes periplasmáticas en el medio de cultivo de E. coli, lo que confirma que la sobreproducción del dominio TolAIII rompe la membrana externa y hace que las proteínas periplasmáticas se filtren al medio de cultivo.

La segunda función de TolA se basa en el uso de TolA como un receptor por proteínas de fagos (Lubkowski, J. et al., 1999, Structure With Folding & Design 7: 711-722) y colicinas (Gokce, I. et al., 2000, J. Mol. Biol. 304: 621-632) . Esto se ha puesto de manifiesto por la resistencia a fagos/colicina de mutantes de TolA y por demostración directa de las interacciones de TolA-proteína mediante métodos físicos. La proteína TolA se compone de tres dominios. Un domino corto N terminal está compuesto de una sola hélice transmembrana, que ancla a TolA a la membrana interna. El segundo dominio, más largo, es polar y principalmente a-helicoidal. Un dominio III C terminal (TolAIII) es pequeño y se compone de 92 aminoácidos. Su estructura 3D se explicó recientemente en un complejo con el dominio N1 de la proteína del gen 3 de recubrimiento menor de bacteriófagos filamentosos Ff (Holliger, P. et al., 1999, J. Mol. Biol. 288: 649-657) . Está estrechamente plegada dentro de una proteína ligeramente alargada con la ayuda de un enlace disulfuro (Figura 1) .

Lubkowski et al. (1999; citado anteriormente) describen una proteína de fusión que comprende 1-86 restos (el dominio N1) de la proteína del gen 3, g3p, de recubrimiento menor de bacteriófagos Ff hacia el extremo N y los restos 295-425 (incluyendo el dominio TolAIII) de TolA, un correceptor de g3p, hacía el extremo C y una cola de Ala3His6 C-terminal (SEC ID Nº: 1) . Lubkowski et al. utilizaron la proteína de fusión para aclarar la estructura cristalina de un complejo formado entre los dominios TolAIII y N1 de g3p.

Se conocen diversos homólogos de la proteína TolA, por ejemplo de E. coli (Nº de acceso en SwissProt P19934) , de especies de Salmonella (por ejemplo Nos de acceso en Genbank gi16764117 y gi1675986, especies de Pectobacterium (por ejemplo Nº de acceso en Genbank gi16116636) y especies de Haemophilus (por ejemplo Nº de acceso en Genbank gi2126342) .

Los autores de la presente invención han descubierto que el domino TolAIII tiene propiedades destacables que son de particular uso como una proteína compañera de fusión para conseguir altos niveles de expresión en una célula hospedadora.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un polipéptido de fusión para la expresión en una célula hospedadora, en el que el polipéptido de fusión tiene una estructura básica, en secuencia, un extremo N, un dominio TolAIII para conseguir potenciar la expresión del polipéptido de fusión en la célula hospedadora, una proteína compañera que no es TolAI cuya expresión se desea y un extremo C, y que opcionalmente también comprende una etiqueta de purificación por afinidad.

Como se usa en el presente documento, los términos “polipéptido” y “proteína” son sinónimos y se refieren a una secuencia de dos o más restos aminoacídicos unidos.

Los autores de la presente invención han demostrado que, cuando el dominio TolAIII se localiza hacía el extremo N de un polipéptido de fusión, facilita niveles más altos de los esperados de la expresión del polipéptido de fusión TolAIII en una célula hospedadora. Las fusiones al dominio TolAIII serán útiles, por ejemplo, para obtener proteínas y polipéptidos compañeros purificados y/o para estudiar las propiedades de estos compañeros.

El polipéptido de fusión puede comprender adicionalmente un péptido de señal. Esto permitirá que el polipéptido de fusión se dirija a una localización intra-o extra-celular específica. El péptido de señal puede localizarse en el extremo N o cerca del extremo N del polipéptido de fusión. El péptido de señal puede escindirse del polipéptido de fusión durante el proceso de direccionamiento.

Teniendo el polipéptido de fusión la estructura básica: extremo N-TolAlll -proteína compañera -extremo C, puede esperarse que se expresará en altos rendimientos en el citoplasma. Los péptidos de señal que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención se ajustan a una serie de normas generales que se describen en Von Heijne, G. 1985, J. Mol. Biol. 184 (1) : 99-105.

El dominio TolAIII puede optimizarse con codones para la expresión en la célula hospedadora.

El polipéptido de fusión puede comprender adicionalmente un conector entre el dominio TolAIII y la proteína compañera no TolAIII. El conector puede proporcionar una separación física entre el dominio TolAIII y la proteína compañera no TolAIII o puede ser funcional. El conector puede comprender al menos un sitio de escisión para una endopeptidasa. Por ejemplo, el sitio de escisión puede comprender la secuencia de aminoácidos DDDDK (SEC ID Nº: 3; para enteroquinasa) y/o LVPR (SEC ID Nº: 4; para trombina) y/o IEGR (SEC ID Nº: 5; para el factor Xa) .

En una realización, el polipéptido de fusión de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente una etiqueta de purificación por afinidad. La etiqueta de purificación por afinidad puede localizarse en o cerca del extremo N del polipéptido de fusión. Por ejemplo, la etiqueta de purificación por afinidad es una etiqueta Hisn Nterminal, siendo n=4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (SEC ID Nos: 6-12, respectivamente; preferentemente n=6 [SEC ID Nº: 8]) , opcionalmente con la etiqueta Hisn unida al polipéptido de fusión mediante uno o más restos de Ser (preferentemente dos) . La etiqueta de purificación por afinidad proporcionará un medio para inmovilizar el polipéptido de fusión, tal como, por ejemplo, una etapa en la purificación.

En una realización, el polipéptido de fusión comprende un péptido de señal en el extremo N y una etiqueta de purificación por afinidad cerca del extremo N. Si el péptido... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de fusión para la expresión en una célula hospedadora, en el que dicho polipéptido de fusión tiene, en la secuencia, una estructura básica que comprende un extremo N terminal, un dominio TolAIII para obtener una expresión aumentada del polipéptido de fusión en la célula hospedadora, una proteína compañera no TolA cuya expresión se desea y un extremo C terminal y que opcionalmente también comprende una etiqueta de purificación por afinidad.

2. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un péptido de señal.

3. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el péptido de señal se sitúa a nivel o cerca del extremo N terminal del polipéptido de fusión.

4. El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el que para la expresión en la célula hospedadora, el domino TolAIII se ha optimizado por codones.

5. El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende un conector entre el dominio TolAIII y la proteína compañera no TolAI.

6. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el conector comprende al menos un sitio de escisión para una endopeptidasa.

7. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el sitio de escisión comprende la secuencia de aminoácidos DDDDK (SEC ID Nº: 3) y/o LVPR (SEC ID Nº: 4) y/o IEGR (SEC ID Nº: 5) .

8. El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que adicionalmente comprende una etiqueta de purificación por afinidad.

9. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la etiqueta de purificación por afinidad se sitúa a nivel o cerca del extremo N terminal del polipéptido de fusión.

10. El polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la etiqueta de purificación por afinidad es una etiqueta Hisn N terminal con n=4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (SEC ID Nos: 6-12, respectivamente; preferentemente n=6 [SEC ID Nº: 8]) , estando la etiqueta Hisn opcionalmente unida al polipéptido de fusión mediante uno o más restos de Ser (preferentemente 2) .

11. El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio TolAIII consiste en los restos aminoacídico.

32. 421 (SEC ID Nº: 13) de la secuencia de TolA de Escherichia coli (Nº de Acceso en SwissProt P19934) .

12. El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula hospedadora es bacteriana (por ejemplo Escherichia coli) .

13. El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido no TolA es la proteína BCL-XL.

14. Una molécula de ADN que codifica el polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

15. Una molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 14, en la que cuando la molécula de ADN se transcribe, las propiedades del ARNm se optimizan para una expresión en la célula hospedadora.

16. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 14 o con la reivindicación 15, para la expresión del polipéptido de fusión definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

17. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 16, que tiene un promotor inducible (por ejemplo, el promotor T7 inducible mediante IPTG) que conduce la expresión del polipéptido de fusión.

18. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 16 o con la reivindicación 17, que tiene un marcador de resistencia a un antibiótico (por ejemplo el gen bla que confiere resistencia a ampicilina y a cloranfenicol) .

19. El vector de clonación para producir el vector de expresión definido en cualquiera de las reivindicaciones 16-18, que comprende ADN que codifica el dominio TolAIII cadena arriba o cadena abajo de un sitio de clonación que permite la inserción en la fase de lectura de un ADN que codifica un polipéptido no TolA.

20. El vector de clonación de acuerdo con la reivindicación 19, que adicionalmente comprende un ADN que codifica al menos un sitio de escisión (por ejemplo la secuencia de aminoácidos DDDDK [SEC ID Nº: 3] y/o LVPR [SEC ID Nº: 4] y/o 1 BGR [SEC ID Nº: 5]) de una endopeptidasa, estando situado el sitio de escisión entre el ADN que codifica el domino TolAIII y el sitio de clonación.

21. El vector de clonación acuerdo con la reivindicación 19 o con la reivindicación 20, en el que el sitio de clonación comprende al menos una secuencia diana de una endonucleasa de restricción (por ejemplo BamHI y/o Kpnl) .

22. El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, que adicionalmente comprende un ADN que codifica una etiqueta de purificación por afinidad como se define en la reivindicación 8 o en la reivindicación 9.

23. El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-22, que adicionalmente comprende un promotor inducible (por ejemplo, el promotor T7 inducible mediante IPTG) .

24. El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-23, que adicionalmente comprende un ADN que codifica un marcador de resistencia a un antibiótico (por ejemplo el gen bla que confiere resistencia a ampicilina y a cloranfenicol) .

25. El vector de clonación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19-24, que tiene la estructura de pTolE, pTolT o pToIX (como se muestra en la Figura 2 con referencia a la descripción) .

26. El uso del dominio TolAIII para la producción de un polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

27. El uso del dominio TolAIII para la producción de la molécula de ADN como se define en la reivindicación 14 o en la reivindicación 15.

28. El uso del dominio TolAIII para la producción de un vector de expresión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16-18.

29. El uso del dominio TolAIII para la producción de un vector de clonación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 19-25.

30. Una célula hospedadora que contiene el ADN como se define en la reivindicación 13 y/o el vector de expresión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 16-18 y/o el vector de clonación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 19-25.

31. El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5-13 para la inmovilización del polipéptido no TolA que comprende la etapa de:

unir el polipéptido de fusión a un polipéptido que se une a TolA (por ejemplo el sitio de reconocimiento de TolA

de la colicina N o de otras colicinas, la región de unión a TolA de la proteína gp3-D1 de bacteriófagos o la región

de unión a TolA de TolB o de otras proteínas Tol) ;

32. El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9-13 para la inmovilización del polipéptido no TolA que comprende la etapa de:

unir la etiqueta de afinidad del polipéptido de fusión a un resto de unión.

33. El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5-13 para la purificación y aislamiento del polipéptido no TolA que comprende las etapas de:

(i) unir el polipéptido de fusión a un polipéptido que se une a TolA (por ejemplo el sitio de reconocimiento de TolA de la colicina N o de otras colicinas, la región de unión a TolA de la proteína g3p-D1 de bacteriófagos o la región de unión a TolA de TolB o de otras proteínas Tol) ;

(ii) escindir el polipéptido no TolA del dominio TolAIII usando una endopeptidasa; y

(iii) separar el polipéptido no TolA escindido del dominio TolAIII.

34. El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8-13 para la purificación y aislamiento del polipéptido no TolA que comprende las etapas de:

(i) unir la etiqueta de afinidad del polipéptido de fusión a un resto de unión;

(ii) escindir el polipéptido no TolA del dominio TolAIII usando una endopeptidasa; y

(iii) separar el polipéptido no TolA escindido del dominio TolAIII del mismo.

35. El uso del polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13 para el estudio de las propiedades de interacción del polipéptido no TolAI o del polipéptido de fusión, por ejemplo auto-interacción, interacción con otra molécula o interacción con un estímulo físico.

36. Un método de alta expresión de un polipéptido como un polipéptido de fusión en una célula hospedadora, que comprende la etapa de expresar, en una célula hospedadora, el polipéptido como un polipéptido de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.