Un polipéptido establecido en la SEQ ID NO.: 43 o un polipéptido que comprende por lo menos una región de agente de transporte unida covalentemente a una región de agente activo,

en donde la región de agente de transporte es una región rica en prolina, en donde la región de agente de transporte está en el extremo del terminal carboxi de dicho polipéptido y la región de agente activo está en el extremo del terminal amino de dicho polipéptido, y dicha región de agente activo se selecciona del grupo que consiste de ADP-ribosil transferasa C3 y un fragmento del mismo que retiene una actividad ADP-ribosil transferasa, en donde la región rica en prolina está en la SEQ ID NO.: 48

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con un conjugado o proteínas de tipo fusión (polipéptidos) que comprenden, por ejemplo, C3 (ver adelante) (es decir, proteína similar a C3, proteínas quiméricas C3). Aunque, adelante, las proteínas de tipo fusión de la presente invención, se discutirán particularmente en relación al uso para facilitar la regeneración de axones y la neuroprotección, se entiende que las proteínas de fusión se pueden explotar en otros contextos.

La presente invención en particular pertenece al campo de reparación del sistema nervioso de mamífero (por ejemplo reparación de un sitio de lesión del sistema nervioso central (SNC) o un sitio de lesión del sistema nervioso periférico (SNP)), regeneración de axón y reinervación de axón, crecimiento de neurita y protección de neurodegeneración y daño isquémico.

Las GTPasas de la familia Rho regulan el crecimiento de axón y la regeneración. La inactivación de Rho con exotransferasa C3 Clostridium botulinum (simplemente como se refiere aquí adelante C3) puede estimular la regeneración y la reinervación de axones lesionados; el C3 es una toxina purificada de Clostridium botulinum (ver Saito et al., 1995, FEBS Lett 371:105-109; Wilde et al 2000. J. Biol. Chem. 275:16478). Los compuestos de la familia C3 de Clostridium botulinum inactivan Rho mediante ADP-ribosilación y actúan así como antagonistas del efecto o función Rho (antagonistas Rho).

La presente invención en particular se relaciona con un medio de suministro intracelular de la proteína C3 (por ejemplo C3 en sí mismo u otros análogos activos tal como transferasas similares a C3 -ver adelante) o otros antagonistas Rho para reparar el daño en el sistema nervioso, para evitar muerte celular isquémica, y para tratar varias enfermedades en donde se requiere la inactivación de Rho. Los medios de suministro pueden tomar la forma de antagonistas Rho similares a C3 quiméricos (es decir conjugados). Estos antagonistas conjugados proporcionan una mejora significativa sobre los compuestos C3 (solos) debido a que ellos tienen 3 a 4 órdenes de magnitud más potente con respecto a la estimulación del crecimiento de axón en sustratos inhibidores que en el C3 recombinante solo. Ejemplos de estos antagonistas Rho se han hecho como proteínas recombinantes creadas para facilitar la penetración de la membrana celular (es decir para mejorar la captación celular de los antagonistas), mejorar la respuesta de dosis cuando se aplica a las neuronas para estimular el crecimiento sobre sustratos inhibidores de crecimiento, y para inactivar Rho. Ejemplos de estos antagonistas conjugados Rho se describen adelante en relación con las designaciones C3APL, C3APLT, C3APS, C3-TL, C3TS, C3Basic1, C3Basic2 y C3Basic3.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN

La lesión traumática de la médula espinal resulta en deterioro funcional permanente. La mayoría de los déficits asociados con lesión de médula espinal resultan de la pérdida de axones que se dañan en el sistema nervioso central (SNC). De forma similar, otras enfermedades del SNC se asocian con pérdida y retracción axonal, tal como apoplejía, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) demencia, enfermedades priónicas, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple y glaucoma. Común a todas estas enfermedades es la pérdida de conexiones axonales con sus objetivos, y muerte celular. La capacidad para estimular el crecimiento de axones de la población neuronal enferma o afectada mejoraría la recuperación de la pérdida de las funciones neurológicas, y la protección de muerte celular puede limitar el grado de daño. Por ejemplo, luego de una apoplejía de materia blanca, se dañan y se pierden los axones, aunque los cuerpos celulares neuronales están vivos, y la apoplejía en la materia gris mata muchas células neuronales y no neuronales (gliales). Los tratamientos que son efectivos en provocar la reinervación de axones lesionados son igualmente efectivos en tratar algunos tipos de apoplejía (Boston life sciences, Sept. 6, 2000 Press release). Los agentes neuroprotectores se prueban frecuentemente como compuestos potenciales que pueden limitar el daño después de apoplejía. Los compuestos que muestran la promoción de crecimiento y la neuroprotección son especialmente buenos candidatos para el tratamiento de la apoplejía y enfermedades neurodegenerativas. De forma similar, aunque la siguiente discusión se relacionará de manera general con el suministro de antagonistas Rho, etc. con un daño traumático del sistema nervioso, esta invención también se puede aplicar a daño por origen desconocido, tal como durante apoplejía, esclerosis múltiple, demencia por VIH, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedades priónicas u otras enfermedades del SNC en donde se dañan los axones en el ambiente del SNC. También, el Rho es un objetivo importante para el tratamiento del cáncer y metástasis (Clark et al (2000) Nature 406:532-535), e hipertensión (Uehata et al. (1997) Nature 389:990) y se reporta que el RhoA tiene un papel cardioprotector (Lee et al. FASEB J. 15:1886-1884). Por lo tanto, la nueva proteína similar a C3 se espera que sea útil para una variedad de enfermedades que requieren la inhibición de la actividad Rho.

Se ha propuesto el uso de varios antagonistas Rho como agentes para estimular la regeneración de axones (corte), es decir lesiones del nervio; por favor ver, por ejemplo, las Solicitudes de Patentes Canadienses nos. 2,304,981 (McKerracher et al) y 2,300,878 (Strittmatter). Estos documentos de solicitud de patente proponen el uso de antagonistas Rho conocidos tal como por ejemplo C3, las proteínas C3 quiméricas, etc. (ver adelante) así como también sustancias seleccionadas de entre compuestos trans-4-amino (alquil)-1-piridilcarbamoilciclohexano conocidos (también ver adelante) o inhibidores quinasa Rho para uso en la regeneración de axones. El C3 inactiva Rho mediante ADP-ribosilación y es bastante no tóxico para las células (Dillon y Feig (1995) Methods in Enzymology: Small GTPases and their regulators Part. B.256:174-184).

Aunque la siguiente discusión se relacionará de manera general o se dirigirá a la reparación en el SNC, las técnicas descritas aquí se pueden extender para uso en muchas otras enfermedades que incluyen, pero no se restringen a, cáncer, metástasis, hipertensión, enfermedad cardiaca, apoplejía, neuropatía diabética, y trastornos neurodegenerativos tal como apoplejía, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ALS). El tratamiento con los antagonistas Rho se utilizarán para mejorar la velocidad del crecimiento de axón de nervios periféricos y por lo tanto son efectivos para la reparación de los nervios periféricos después de cirugía, por ejemplo después reimplantar miembros amputados. También, el tratamiento con nuestros compuestos de fusión (proteínas) se espera que sea efectivo para el tratamiento de varias neuropatías periféricas debido a sus efectos de promoción de crecimiento de axón.

Como se mencionó anteriormente, la lesión traumática de la médula espinal resulta en deterioro funcional permanente. La regeneración de axón no ocurre en el SNC de mamífero adulto debido a las proteínas inhibidoras de crecimiento vinculadas al sustrato que bloquean el crecimiento de axón. Muchos compuestos, tal como factores tróficos, mejoran la diferenciación neuronal y estimulan el crecimiento de axón en cultivo de tejido. Sin embargo, muchos factores que mejoran el crecimiento y la diferenciación no son capaces de promover el crecimiento regenerativo de axón sobre sustratos inhibidores. Para demostrar que un compuesto conocido para estimular el crecimiento de axón en el cultivo de tejido refleja más exactamente el potencial para uso terapéutico para la regeneración de axón en el SNC, es importante para los estudios de cultivo celular incluir la demostración de que un compuesto puede permitir el crecimiento de axón sobre sustratos inhibidores de crecimiento. Un ejemplo de factores tróficos y de diferenciación que estimulan el crecimiento en sustratos permisivos en cultivo de tejido, son neurotrofinas tales como factor de crecimiento del nervio (NGF) y factor de crecimiento derivado de cerebro. El NGF, sin embargo, no promueve el crecimiento sobre sustratos inhibidores (Lehmann, et al. (1999) 19: 7537-7547) y este no es efectivo en promover la regeneración de axón in vivo. El factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) no es efectivo para promover la regeneración in vivo (Mansour-Robaey, et al. J. Neurosci. (1994) 91: 1632-1636). El BDNF no promueve...

1. Un polipéptido establecido en la SEQ ID NO.: 43 o un polipéptido que comprende por lo menos una región de agente de transporte unida covalentemente a una región de agente activo, en donde la región de agente de transporte es una región rica en prolina, en donde la región de agente de transporte está en el extremo del terminal carboxi de dicho polipéptido y la región de agente activo está en el extremo del terminal amino de dicho polipéptido, y dicha región de agente activo se selecciona del grupo que consiste de ADP-ribosil transferasa C3 y un fragmento del mismo que retiene una actividad ADP-ribosil transferasa, en donde la región rica en prolina está en la SEQ ID NO.: 48.

2. El uso de un polipéptido como se define en la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de glaucoma.

3. El uso de un polipéptido como se define en la reivindicación 1 para la fabricación de una composición farmacéutica.

4. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de una composición farmacéutica para suprimir la inhibición de crecimiento de axón neuronal.

5. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de una composición farmacéutica para facilitar el crecimiento de axón.

6. El uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar lesión del nervio.

7. Una composición farmacéutica que comprende: a) un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 y b) un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende adicionalmente un bioadhesivo biológico, en la medida en que se relaciona con la SEQ ID NO.: 48 la composición farmacéutica comprende el polipéptido que consiste de la SEQ ID. NO.: 37 (C3APLT).

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende adicionalmente fibrina, en la medida en que se relaciona con la SEQ ID NO.: 48 la composición farmacéutica comprende el polipéptido que consiste de SEQ ID. NO.: 37 (C3APLT).