Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas.

Una proteína bouganina modificada en donde dicha bouganina modificada tiene una propensión reducida paraactivar una respuesta inmunitaria en comparación con una bouganina no modificada,

en donde dicha bouganinatiene una sustitución de aminoácidos de uno o más de X1, X2, X3, X4 o X5 en un epítopo de linfocitos T seleccionadodel grupos que consiste en:

a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (región epitópica R1, SEC ID Nº: 8)

b) LGVX4KLEFSIEAIHG (región epitópica R2, SEC ID Nº: 9); y

c) NGQEX5AKFFLIVIQM (región epitópica R3, SEC ID Nº: 10) en donde:

X1 es T o A o Q;

X2 es G o A;

X3 es Q o G;

X4 es N o D o T o A o R o Q o E o G o H o K o S; y

X5 es Q o A.

Proteínas bouganina modificadas, citotoxinas y procedimientos y usos de las mismas Campo de la invención La invención se refiere a proteínas bouganina modificadas y a citotoxinas que contienen las proteínas modificadas útiles como agentes terapéuticos contra el cáncer. Específicamente, los epítopos de linfocitos T se retiran o modifican para reducir la inmunogenicidad de las toxinas bouganina.

Antecedentes de la invención Existen muchos casos en los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmunitaria no deseada contra la proteína terapéutica. Se ha demostrado que diversos anticuerpos monoclonales de ratón son terapias prometedoras en diversos entornos de enfermedades humanas pero en algunos casos han fallado debido a la inducción de grados significativos de una respuesta de anticuerpos antimurinos (HAMA) [Schroff, R. W. y col (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. y col (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. Para anticuerpos monoclonales, se han desarrollado diversas técnicas en intentos de reducir la respuesta HAMA [documentos WO 89/09622; EP 0239400; EP 0438310; WO 91/06667]. Estas estrategias de ADN recombinante han reducido generalmente la información genética de ratón en la construcción de anticuerpo final mientras que aumenta la información genética humana en la construcción final. No obstante, los anticuerpos “humanizados” resultantes han inducido aún, en algunos casos, una respuesta inmunitaria en pacientes [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449, 456; Rebello, P. R. y col (1999) Transplantation 68: 1417-1420].

La clave para la inducción de una respuesta inmunitaria es presencia dentro de la proteína de péptidos que pueden estimular la actividad de linfocitos T mediante la presentación de moléculas del MHC de clase II, denominadas “epítopos de linfocitos T”. Dichos epítopos de linfocitos T se definen normalmente como cualquier secuencia de restos de aminoácidos con la capacidad de unirse a moléculas del MHC de Clase II. Implícitamente, un “epítopo de linfocito T” significa un epítopo que cuando está unido a moléculas del MHC puede reconocerse por un receptor de linfocitos T (TCR) , y que puede, al menos en principio, causar la activación de estos linfocitos T acoplándose a un TCR para promover una respuesta de linfocitos T.

Las moléculas del MHC de Clase II son un grupo de proteínas muy polimórficas que desempeñan una función principal en la selección y activación de linfocitos T auxiliares. El grupo antigénico leucocitario humano DR (HLA-DR) es el isotipo predominante de este grupo de proteínas; sin embargo, los isotipos HLA-DQ y HLA-DP realizan funciones similares. En a la población humana, los individuos portan de dos a cuatro alelos DR, dos alelos DQ y dos alelos DP. La estructura de diversas moléculas DR se ha resuelto y estas aparecen como un péptido de extremos abiertos que se une al surco con diversos bolsillos hidrófobos que acoplan restos hidrófobos (restos de bolsillo) del péptido [Brown y col (1993) Nature 364: 33; Stern y col (1994) Nature 368: 215]. El polimorfismo que identifica los diferentes alotipos de las moléculas de clase II contribuye a una amplia diversidad de diferentes superficies de unión para péptidos dentro del surco de unión a péptidos y el nivel de población garantiza la máxima flexibilidad con respecto a la capacidad para reconocer proteínas extrañas y provocar una respuesta inmunitaria frente a organismos patógenos.

Una respuesta inmunitaria contra una proteína terapéutica se realiza mediante la ruta de presentación del péptido del MHC de clase II. En este caso, proteínas exógenas se absorben y procesan para la presentación en asociación con las moléculas del MHC de clase II de tipo DR, DQ o DP. Las moléculas del MHC de Clase II se expresan por células presentadoras de antígeno (APC) profesionales, tales como macrófagos y células dendríticas entre otras. El acoplamiento de un complejo peptídico MHC de clase II por un receptor de linfocito T afín sobre la superficie del linfocito T, junto con la unión cruzada de determinados otros correceptores tales como la molécula CD4, puede inducir un estado activado dentro del linfocito T. La activación conduce a la liberación de citocinas activando adicionalmente otros linfocitos tales como linfocitos B para producir anticuerpos o linfocitos citolíticos T activadores como una respuesta inmunitaria celular completa.

La identificación del epítopo de linfocitos T es la primera etapa para la eliminación epitópica como se reconoce en los documentos WO98/52976; WO00/34317; WO02/069232; WO02/079232; y WO02/079415. En estas enseñanzas, se retiran epítopos de linfocitos T predichos por el uso de sustitución de aminoácidos sensata dentro de la proteína de interés. Junto con técnicas informáticas, existen procedimientos in vitro para medir la capacidad de péptidos sintéticos de unirse a moléculas del MHC de clase II. Un procedimiento ejemplar utiliza líneas de linfocitos B de alotipo MHC definido como una fuente de superficie de unión de MHC de clase II y puede aplicarse a identificación de ligandos de MHC de clase II [Marshall K. W. y col. (1994) J. Immunol. 152: 4946-4956; O’Sullivan y col (1990) J. Immunol.

145: 1799-1808; Robadey C. y col (1997) J. Immunol 159: 3238-3246]. Sin embargo, dichas técnicas no están adaptadas para la exploración de múltiples epítopos posibles con respecto a una amplia diversidad de alotipos de MHC, ni pueden confirmar la capacidad de un péptido de unión para actuar como un epítopo de linfocitos T.

Las técnicas para aprovechar complejos solubles de moléculas MHC recombinantes en combinación con péptidos sintéticos también han comenzado a usarse [Kern, F. y col (1998) Nature Medicine 4: 975-978; Kwok, W. W. y col (2001) TRENDS in lmmunol. 22: 583-588]. Estos reactivos y procedimientos se usan para identificar la presencia de clones

de linfocitos T a partir de muestras de sangre periférica de sujetos humanos o en animales experimentales que pueden unir complejos peptídicos MHC particulares y no están adaptados para la exploración de múltiples epítopos posibles con respecto a una amplia diversidad de alotipos de MHC.

Los ensayos biológicos de activación de linfocitos T ofrecen una opción práctica para proporcionar una lectura de la capacidad de una secuencia peptídica/proteica de ensayo para suscitar una respuesta inmunitaria. Como ejemplos de este tipo de estrategias se incluyen el trabajo de Petra y col. usando ensayos de proliferación de linfocitos T con respecto a la proteína bacteriana estafiloquinasa, seguido de mapeo epitópico usando péptidos sintéticos para estimular líneas de linfocitos T [Petra, A. M. y col (2002) J. Immunol. 168: 155-161]. De manera similar, ensayos de proliferación de linfocitos T utilizando péptidos sintéticos de la proteína de la toxina del tétano han dado como resultado la definición de regiones epitópicas inmunodominantes de la toxina [Reece J. C. y col (1993) J. Immunol. 151: 61756184]. El documento WO99/53038 desvela una estrategia mediante la cual epítopos de linfocitos T en una proteína de ensayo puede determinarse usando subconjuntos aislados de células inmunitarias humanas, promoviendo su diferenciación in vitro y cultivo de las células en presencia de péptidos sintéticos de interés y mediciones de cualquier proliferación inducida en los linfocitos T cultivados. La misma técnica también la describen Stickler y col. [Stickler, M. M. y col (2000) J. Immunotherapy 23: 654-660], en la que en ambos casos el procedimiento se aplica a la detección de epítopos de linfocitos T dentro de la subtilisina bacteriana. Dicha técnica requiere aplicación cuidadosa de técnicas de aislamiento celular y de cultivo celular con complementos de citocinas múltiples para obtener los subconjuntos celulares inmunitarios deseados (células dendríticas, linfocitos T CD4+ y o CD8+) y no conduce a una rápida selección de alto rendimiento usando muestras de donantes múltiples.

Recientemente también se ha avanzado una estrategia de combinación que usa ensayos de proliferación de linfocitos T basados en población y en simulación por ordenador de la unión de MHC peptídica en el diseño de proteínas empobrecidas para epítopo [documento WO 03/104803].

Como se ha expuesto anteriormente y como una consecuencia de los mismos, sería deseable identificar y retirar o al menos reducir epítopos de células de linfocitos T de un péptido, polipéptido o proteína principal terapéuticamente valioso pero originalmente inmunogénico.

Sumario de la invención La invención se diseña para superar la realidad práctica de que las proteínas solubles introducidas con intención... [Seguir leyendo]

1. Una proteína bouganina modificada en donde dicha bouganina modificada tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con una bouganina no modificada, en donde dicha bouganina tiene una sustitución de aminoácidos de uno o más de X1, X2, X3, X4 o X5 en un epítopo de linfocitos T seleccionado del grupos que consiste en:

a) AKX1DRKX2LX3LGVX4KL (región epitópica R1, SEC ID Nº: 8) b) LGVX4KLEFSIEAIHG (región epitópica R2, SEC ID Nº: 9) ; y c) NGQEX5AKFFLIVIQM (región epitópica R3, SEC ID Nº: 10) en donde:

X1 es T o A o Q;

X2 es G o A; X3 es Q o G; X4 es N o D o T o A o R o Q o E o Go Ho K o S; y X5 es Q o A.

2. Una proteína bouganina modificada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína 15 bouganina modificada comprende:

en donde:

X1 es T o A o Q; X2 es G o A;

X3 es Q o G; X4 es N o D o T o A o R o a o E o G o H o K o S; y X5 es Qo A (SEC ID Nº: 12) .

3. Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X1 es A.

4. Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X2 es A.

5. Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X4 es N.

6. Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que X5 es A.

7. Una proteína bouganina modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la bouganina modificada comprende la siguiente secuencia

8. Una citotoxina que comprende

(a) un resto diana unido a;

(b) una proteína bouganina modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una citotoxina que comprende

(a) un ligando que se une a una célula cancerosa unida a;

(b) una proteína bouganina modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7

10. La citotoxina de la reivindicación 9, en la que el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a una célula cancerosa.

11. La citotoxina de la reivindicación 10, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a Ep-CAM en la superficie de la célula cancerosa.

12. La citotoxina de la reivindicación 11, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo que se une a Ep-CAM es un anticuerpo humanizado o un fragmento de anticuerpo que se une al dominio extracelular de Ep-CAM-humana y comprende secuencias de la región determinante de la complementariedad derivadas de un anticuerpo MOC-31.

13. La citotoxina de la reivindicación 12, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 16.

14. La citotoxina de la reivindicación 10, en la que el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a un antígeno asociado a tumor en la superficie de la célula cancerosa.

15. La citotoxina de la reivindicación 14, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 28.

16. Un uso de una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 en la fabricación de un medicamento para inhibir o destruir una célula cancerosa.

17. Una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para su uso en la inhibición o la destrucción de una célula cancerosa.

18. Un uso de una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-15 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

19. Una citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-15 para su uso en el tratamiento del cáncer.

20. El uso de la reivindicación 16 o 18, o la citotoxina para su uso de la reivindicación 17 o 19, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer hepático, cáncer renal, melanomas, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B.

21. Una composición farmacéutica que comprende la citotoxina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 y un vehículo diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.

22. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de un animal con cáncer que comprende

(a) identificar epítopos de linfocitos T de la bouganina;

(b) modificar uno o más restos de aminoácidos en un epítopo de linfocitos T para preparar una bouganina modificada que tenga una propensión reducida para activar linfocitos T de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;

(c) preparar una citotoxina que tenga un ligando de unión a cáncer unido a la bouganina modificada; y

(d) suspender la citotoxina en un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer hepático, cáncer renal, melanomas, cáncer gastrointestinal, cáncer de próstata, cáncer pulmonar microcítico y no microcítico, sarcomas, gliomas, linfomas de linfocitos T y B.

24. Una molécula de ácido nucleico que codifica una bouganina modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

25. Una molécula de ácido nucleico que codifica una citotoxina de acuerdo con la reivindicación 8-15.

26. Un péptido epitópico de linfocitos T que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con el epítopo de linfocitos T no modificado que comprende una secuencia modificada que comprende: AKX1DRKX2LX3LGVX4KL en la que al menos uno de X1, X2, X3 y X4 está modificado desde la secuencia no modificada de las siguiente manera:

X1 es T o A o Q; X2 es G o A; X3 es Q o G; y

X4 es N o D o T o A o R o Q o E o G o H o K o S (SEC ID Nº: 8) .

27. Un péptido epitópico de linfocitos T que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con el epítopo de linfocitos T no modificado que comprende una secuencia modificada que comprende: LGVX4KLEFSIEAIHG

en la que X4 es N o Do T o A o R o Q o E o G o H o K o S (SEC ID Nº: 9) .

28. Un péptido epitópico de linfocitos T que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con el epítopo de linfocitos T no modificado que comprende una secuencia modificada que comprende: NGQEX5AKFFLIVIQM en la queX5 es Q o A (SEC ID Nº: 10) .

29. Una molécula de ácido nucleico que codifica el péptido epitópico de linfocitos T de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28.

30. Una proteína bouganina modificada que tiene una propensión reducida para activar una respuesta inmunitaria en comparación con la bouganina no modificada que comprende la secuencia:

FIGURA 1

Las figuras ilustran la expresión de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina en el sobrenadante de células E104 inducidas a escala de laboratorio (matraz agitador) . Una parte alícuota del sobrenadante, 16 μl, se cargó en condiciones no reductoras en un gel de poliacrilamida SDS-PAGE y se analizó por transferencia de Western usando un anticuerpo anti-4D5 policlonal de conejo, seguido de un anticuerpo anti-conejo de cabra (1/2000) , o anti cadena L-Kappa humana de cabra conjugado con HRP (1/1000) , para confirmar la identidad y el tamaño de la proteína recombinante. La flecha indica la longitud completa de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina. La transferencia de Western del sobrenadante del cultivo E104 no inducido reveló bandas no correspondientes lo que demuestra la especificidad de los anticuerpos.

Reactividad de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina, detectada por citometría de flujo. La reactividad y la especificidad de VB6-845 y VB6-845-CL-de-bouganina se evaluaron con las líneas celulares Ep-CAM-positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3 y la línea celular Ep-CAM negativa A-375. Brevemente, se incubaron VB6-845 y VB6-845-CL-debouganina con 0, 45 x 106 células durante una hora en hielo. Después del lavado, VB6-845 y VB6-845-CL-debouganina unidas a la superficie celular se detectaron con anti-bouganina de conejo durante una hora en hielo. Las células se lavaron y se incubaron con anti IgG de conejo de oveja conjugado con FITC durante 30 minutos en hielo. Posteriormente, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS con FCS al 5 % que contenía yoduro de propidio para evaluar la unión de los anticuerpos por citometría de flujo.

No se detectaron cambios en la fluorescencia media después de incubación con VB6-845 y VB6-845-CL-debouganina con A-375. Por otro lado, se observó un cambio en la fluorescencia media con las líneas celulares Ep-CAM positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3.

Reactividad de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845.

La actividad biológica de VB6-845-gelonina se comparó con VB6-845 por citometría de flujo. La reactividad y la especificidad de VB6-845-gelonina y VB6-845 se evaluaron con las líneas celulares Ep-CAM-positivas, CAL 27 y NIH:OVCAR-3 y la línea celular Ep-CAM negativa A-375. Brevemente, VB6-845-gelonina y VB6-845 se incubaron con 0, 45 x 106 células durante una hora en hielo. Después del lavado, la VB6-845-gelonina y VB6-845 unidas a la superficie celular se detectaron con una etiqueta anti His de ratón durante una hora en hielo. Las células se lavaron y se incubaron con anti IgG de ratón de oveja conjugado con FITC durante 30 minutos en hielo. Posteriormente, las células se lavaron, se resuspendieron en PBS con FCS al 5 %, que contenía yoduro de propidio para evaluar la unión de los anticuerpos por citometría de flujo.

Condiciones:

- 0, 3 x 106 células/grupo.

- concentraciones de VB6-845 y Proxinium mezcladas en iguales volúmenes.

- 1 h de incubación en hielo.

- dilución 1/200 de anti-bouganina de conejo-biotina como 2º Ab-1 hora en hielo.

- fluorocromo – dilución 1/120 de estreptavidina – citocromo – 1/2 h en hielo.

- 100 % unido – 0 μg/ml de Proxinium.

Ensayo de competencia entre VB6-845 y Proxinium' por citometría de flujo: VB6-845 a 1 y 10 μg/ml y concentraciones en aumento de Proxinium' que variaban de 0 a 100 μg/ml, se incubaron con células NIH:OVCAR-3. Después de 1 hora de incubación a 4 ºC, las células se lavaron y la unión de VB6-845 se detectó con un anti-bouganina de conejo biotinilado seguido por estreptavidina-citocromo. Se realizó el mismo experimento con 4B5-PE que se usó como un control negativo.

Las proteínas VB6-845 y de-bouganina purificadas, a diversas concentraciones se incubaron a 30 ºC durante 90 minutos con la siguiente mezcla:

Lisado de reticulocitos de conejo Flexi 35 μl Mezcla de aminoácidos, sin leucina 1 μ.

3. leucina 5 μl Cloruro de potasio 1, 4 μl RNasin 1 μl ARN control luciferasa, 1 mg/ml 1 μl Hasta un volumen final de 50 μl Después de completarse la reacción de traducción, se tomó una muestra de 2 μl, se mezcló con 98 μl de NaOH 1 M/H2O2 al 2 % y se incubó a 37 ºC durante 10 minutos. La proteína traducida se precipitó con la adición de TCA al 25 % enfriado con hielo/casaminoácidos al 2 % y se incubó en hielo durante 30 minutos. Después el precipitado se recogió en un filtro de fibra de vidrio Whatman GF/C (prehumedecido con TCA enfriado al 5 %) por centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos. El filtro se aclaró 3 veces con TCA al 5 % enfriado con hielo y una vez con acetona. Después de secar el filtro, se añadió mezcla de centelleo y los recuentos se determinaron en un contador de centelleo líquido.

Citotoxicidad in vitro de VB6-845-gelonina. Ensayo con MTS de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845: se incubaron células CAL 27 con una concentración equimolar de VB6-845, VB6-845-gelonina y gelonina que variaba de 100 a 0, 1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor CI50.

Citotoxicidad in vitro de VB6-845-CL-de-bouganina. Ensayo con MTS de VB6-845-CL-de-bouganina en comparación con VB6-845: se incubaron células NIH:OVCAR-3 con una concentración equimolar de VB6-845-CL-de-bouganina, VB6-845 y bouganina que variaba de 100 a 0, 1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor de CI50.

Citotoxicidad in vitro de VB6-845-gelonina. Ensayo con MTS de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845: se incubaron células CAL 27 con una concentración equimolar de VB6-845, VB6-845-gelonina y gelonina que variaba de 100 a 0, 1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor CI50.

Citotoxicidad in vitro de VB6-845-gelonina. Ensayo con MTS de VB6-845-gelonina en comparación con VB6-845: se incubaron células NIH:OVCAR-3 con una concentración equimolar de VB6-845, VB6-845-gelonina y gelonina que variaba de 100 a 0, 1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor de CI50.

Citotoxicidad in vitro de VB6-011. Ensayo con MTS de VB6-011: se incubaron células MB-435S con diferentes concentraciones de VB6-011 que variaban de 100 nM a 1 nM. Después de 5 días de incubación, se midió la viabilidad y se determinó el valor CI50.