Proteínas activas biológicas que tienen estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro.

Proteína biológicamente activa que comprende al menos dos dominios,

en la que (a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica; y (b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 350 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar tal como se determina mediante medición de espectroscopía de dicroísmo circular por la que dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa.

Proteínas activas biológicas que tienen estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro La presente invención se refiere a proteínas biológicamente activas que comprenden al menos dos dominios en las que un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica y un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 350 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar tal como se determina mediante medición de espectroscopía de dicroísmo circular (DC) , mediante lo cual dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa. Además, se dan a conocer moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas biológicamente activas de la invención y vectores y células que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden los compuestos de la invención así como para usos específicos de las proteínas biológicamente activas, moléculas de ácido nucleico, vectores y células de la invención.

Las proteínas plasmáticas comunes tales como albúmina sérica humana (HSA) e inmunoglobulinas (Ig) , incluyendo anticuerpos humanizados, muestran largas vidas medias, normalmente de 2 a 3 semanas, lo que puede atribuirse a su interacción específica con el receptor Fc neonatal (FcRn) , lo que conduce a reciclaje endosómico (Ghetie (2002) Immunol Res 25:97-113) . En cambio, la mayoría de las demás proteínas de interés farmacéutico, en particular fragmentos de anticuerpos recombinantes, hormonas, interferones, etc. experimentan un rápido aclaramiento (en sangre) . Esto es particularmente cierto para proteínas cuyo tamaño es inferior al valor umbral para la filtración renal de aproximadamente 70 kDa (Caliceti (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277) . En estos casos, la vida media plasmática de una proteína farmacéutica sin modificar puede ser considerablemente menor que una hora, haciéndola así esencialmente inútil para la mayoría de aplicaciones terapéuticas. Con el fin de lograr una acción farmacológica sostenida y también un cumplimiento mejorado del paciente, extendiéndose los intervalos de dosificación requeridos hasta varios días o incluso semanas, se establecieron previamente varias estrategias para los fines de desarrollo de fármacos biofarmacéuticos.

En primer lugar, se ha empleado el mecanismo de reciclaje de las proteínas plasmáticas naturales produciendo proteínas de fusión con la parte Fc de Ig, por ejemplo, Enbrel®, un híbrido entre el dominio extracelular del receptor de TNF! e IgG1 humana (Goldenberg (1999) Clin Ther 21:75-87) o con albúmina sérica, por ejemplo, Albuferon®, una fusión correspondiente de IFN! con HSA (Osborn (2002) J Pharmacol Exp Ther 303:540-548) . También se ha utilizado albúmina con su alta concentración plasmática de 600 ∀M de manera indirecta, sirviendo como vehículo portador para productos biofarmacéuticos que están dotados de una función de unión a albúmina, por ejemplo, mediante fusión con un dominio de unión a albúmina (ABD, albumin-binding domain) bacteriano de proteína G estreptocócica (Makrides (1996) J Pharmacol Exp Ther 277:534-542) o con un péptido seleccionado contra HSA de una biblioteca de presentación en fago (Dennis (2002) J Biol Chem 277:35035-35043; Nguyen (2006) Protein Eng Des Sel 19:291-297) .

En segundo lugar, un metodología fundamentalmente diferente para prolongar la vida media plasmática de productos biofarmacéuticos es la conjugación con polímeros químicos altamente solvatados y fisiológicamente inertes, ampliando de ese modo de manera eficaz el radio hidrodinámico de la proteína terapéutica más allá del tamaño de poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (Caliceti (2003) loc. cit.) . El acoplamiento covalente en condiciones suaves desde el punto de vista bioquímico con derivados activados de polietilenglicol (PEG) , o bien aleatoriamente mediante cadenas laterales de Lys (Clark (1996) J Biol Chem 271:21969-21977) o bien por medio de residuos de Cys introducidos específicamente (Rosendahl (2005) BioProcess International 3:52-60) ha sido moderadamente satisfactorio y está aplicándose actualmente en varios fármacos aprobados. Se han logrado ventajas correspondientes especialmente junto con pequeñas proteínas que tienen una actividad farmacológica específica, por ejemplo, Pegasys®, un IFN-!-2a químicamente pegilado recombinante (Harris (2003) Nat Rev Drug Discov 2:214-221; Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870) .

Sin embargo, el acoplamiento químico de una proteína biológicamente activa con polímeros sintéticos puede tener desventajas con respecto a la producción y el desarrollo biofarmacéuticos. Los derivados de PEG adecuados son caros, especialmente ya que es necesaria una alta pureza, y su conjugación con una proteína recombinante requiere etapas adicionales de procesamiento y purificación in vitro, que disminuyen el rendimiento y elevan los costes de fabricación. De hecho, PEG está contaminado a menudo con aldehídos y peróxidos (Ray (1985) Anal Biochem 146:307-312) y es propenso intrínsecamente a la degradación química con el almacenamiento en presencia de oxígeno. Además, la función farmacéutica de una proteína terapéutica puede dificultarse si se modifican cadenas laterales de aminoácidos en las proximidades de su sitio activo bioquímico por el proceso de pegilación. Además, el acoplamiento químico con polímeros sintéticos da como resultado habitualmente una mezcla heterogénea de moléculas que pueden mostrar una varianza sustancial de la actividad in vivo.

En tercer lugar, se ha propuesto el uso de análogos de glicosilación de proteínas biológicamente activas en las que se introducen nuevas secuencias consenso de glicosilación de unión a N para prolongar la vida media sérica; véanse el documento WO 02/02597; Perlman (2003) J Clin Endocrinol Metab 88:2327-2335; o Elliott (2003) Nat

Biotechnol 21:414-420. Sin embargo, las proteínas glicosiladas mediante ingeniería genética descritas presentaban una actividad in vivo alterada, lo que indica que las nuevas cadenas laterales de hidrato de carbono influyen en la actividad biológica de la proteína modificada por ingeniería genética. Además, es probable que las cadenas laterales de hidrato de carbono adicionales aumenten la antigenicidad de moléculas activas biológicas resultantes, lo que plantea problemas de seguridad sustanciales.

Además, se ha notificado que proteínas de fusión que comprenden la secuencia de repetición artificial derivada de Tr y panosoma cruzi PSTAD inducen una vida media plasmática prolongada de trans-sialidasa (Alvarez (2004) J Biol Chem 279:3375-3381) . Sin embargo, se ha notificado que tales repeticiones derivadas de Tr y panosoma cruzi inducen una respuesta inmunitaria humoral (Alvarez (2004) loc. cit.) . Por consiguiente, se desean medios alternativos para prolongar la acción de proteínas biológicamente activas.

El problema técnico subyacente a la presente invención es la provisión de proteínas biológicamente activas con una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro. La solución al problema técnico anterior se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, esta invención se refiere a una proteína biológicamente activa que comprende al menos dos dominios en la que

(a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica; y

(b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 350 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar tal como se determina mediante medición de espectroscopía de dicroísmo circular (DC) ,

mediante lo cual dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa.

Según esta invención, dicho segundo dominio que forma/que adopta una conformación de espiral al azar puede mediar una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa. Dicho segundo dominio, por tanto, conduce a una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de una proteína dada (o un fragmento de la misma) que tiene una/o que media una actividad biológica dada, tal como se define a continuación en el presente documento.

Tal como se documenta a continuación en el presente documento y en los ejemplos adjuntos, se descubrió sorprendentemente que las proteínas biológicamente activas... [Seguir leyendo]

1. Proteína biológicamente activa que comprende al menos dos dominios, en la que

(a) un primer dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media dicha actividad biológica; y

(b) un segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos 350 residuos de aminoácido que forma una conformación de espiral al azar tal como se determina mediante medición de espectroscopía de dicroísmo circular

por la que dicha conformación de espiral al azar media una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa.

2. Proteína biológicamente activa según la reivindicación 1, en la que dicho segundo dominio que forma una conformación de espiral al azar consiste en residuos de alanina, serina y prolina.

3. Proteína biológicamente activa según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho segundo dominio que forma una conformación de espiral al azar comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en la que dicha repetición consiste en residuos de Ala, Ser y Pro y en la que no más de 6 residuos de aminoácido consecutivos son idénticos.

4. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichos residuos de prolina constituyen más del 4 % y menos del 40 % de los aminoácidos de dicho segundo dominio que forma una conformación de espiral al azar.

5. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho segundo dominio comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO: 18) ;

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO: 20) ;

APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO: 22) ,

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO: 63) ,

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO: 24) ,

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO: 26) y

ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO: 28)

o versiones permutadas circulares o (un) multímero (s) de estas secuencias en su totalidad o partes de estas secuencias.

6. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho segundo dominio de dichos al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en de 400 a 3000 residuos de aminoácido que forman una conformación de espiral al azar.

7. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho polipéptido con actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en moléculas de unión, fragmentos de anticuerpo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas.

8. Proteína biológicamente activa según la reivindicación 7, en la que dicha molécula de unión se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F (ab’) 2, peptidomiméticos derivados de CDR, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) , lectinas y lipocalinas.

9. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dicho polipéptido con actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos, hormona de crecimiento humana, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, factor de necrosis tumoral, eritropoyetina, factor de coagulación VIII, gp120/gp160, receptores solubles I y II del factor de necrosis tumoral, reteplasa, exendina-4, anakinra, interleucina-2 y lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos.

10. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha estabilidad aumentada in vivo de dicha proteína biológicamente activa es una vida media plasmática prolongada de dicha proteína biológicamente activa que comprende dicho segundo dominio que forma una espiral al azar en comparación con dicha proteína biológicamente activa que carece de dicho segundo

dominio que forma una espiral al azar.

11. Composición que comprende la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Composición según la reivindicación 11, que es una composición farmacéutica, que comprende además opcionalmente un portador farmacéutico aceptable.

13. Molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13.

15. Célula que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 13 o el vector según la reivindicación 14.

16. Método para la preparación de la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar la célula según la reivindicación 15 y aislar dicha proteína biológicamente activa del cultivo.

17. Uso de la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el ácido nucleico según la reivindicación 13, el vector según la reivindicación 14 o la célula según la reivindicación 15 para la preparación de un medicamento que tiene una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa para el tratamiento de trastornos relacionados con una deficiencia hormonal, enfermedad autoinmune, cáncer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas/inflamatorias, trombosis, infarto de miocardio, diabetes y lesión por reperfusión u otras enfermedades renales.

18. Proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, ácido nucleico según la reivindicación 13, vector según la reivindicación 14 o célula según la reivindicación 15 para el uso como medicamento que tiene una estabilidad aumentada in vivo y/o in vitro de dicha proteína biológicamente activa.

19. Kit que comprende la proteína biológicamente activa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, el ácido nucleico según la reivindicación 13, el vector según la reivindicación 14 o la célula según la reivindicación 15.