Proteína recombinante de Haemonchus contortus y su aplicación para la producción de una vacuna frente a la hemoncosis.

Proteína recombinante de Haemonchus contortus y su aplicación para la producción de una vacuna frente a la hemoncosis.

Se ha procedido a la obtención de una proteína recombinante (rHc23) de H. contortus tras comprobar que la proteína nativa Hc23, de 23kDa de peso molecular, originaria del extracto soluble de adultos del nematodo hematófago H. contortus ha mostrado capacidad inmunoprotectora en el ganado ovino joven de 5 meses de edad frente a la trichostrongilidosis más importante (hemoncosis) desde un punto de vista económico y patológico.

Se ha caracterizado la proteína Hc23, obteniéndose las secuencias aminoacídicas y genómicas de la misma, permitiendo, por técnicas de biología molecular, ADN recombinante, la producción de una proteína estable, la rHc23. Su utilización en composiciones inmunogénicas que incluyen como adyuvante la combinación de Propionibacterium acnes inactivado + lipopolisacáridos de E. coli ha mostrado un elevado grado de protección en los animales (>85% de protección).

Proteína recombinante de Haemonchus contortus y su aplicación para la producción de una vacuna frente a la hemoncosis.

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra dentro del campo de la Sanidad Animal. De forma más concreta, se refiere a la elaboración de composiciones inmunogénicas que incluyen la proteína Hc23 o la proteína recombinante rHc23 de Haemonchus contortus para su uso en la elaboración de vacunas frente a las infestaciones por Haemonchus. También se refiere al uso de adyuvantes para mejorar la protección otorgada por las composiciones inmunogénicas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las nematodosis gastrointestinales ovinas, entre ellas la hemoncosis,

Esta parasitosis puede presentarse -en dependencia del número de vermes presentes en los hospedadores, edad de éstos, factores medioambientales, estado inmunitario -como un proceso agudo o con carácter crónico, constituyendo en ambos casos una enfermedad importante de rumiantes.

Según la FAO- (http://www.fao.org.) -la hemoncosis representa el 15 % de las gastroenteritis parasitarias en pequeños rumiantes y causa las mayores pérdidas económicas de todas las trichostrongilidosis.

La introducción de sistemas de explotación más intensivos, en praderas de regadío, conlleva un incremento de la carga ganadera y ciclos de aprovechamiento herbáceo muy cortos. Estas condiciones, junto con la incapacidad aparente de los individuos jóvenes (de menos de 6 meses de edad) para responder eficazmente a las infestaciones, suponen un incremento de los riesgos de procesos de significación clínica.

El control de esta parasitosis se basa esencialmente en el empleo de tratamientos antihelmínticos y, pese a que los antihelmínticos han sido útiles durante décadas, su utilización indiscriminada ha provocado la aparición de resistencias farmacológicas en todo el mundo (Waller PJ. (1997) . Anthelmintic resistance. Veterinar y Parasitol., 72: 391-412) . Existe, además, una creciente preocupación sobre la posible presencia de residuos tanto en los alimentos como en el medio ambiente.

El coste de los tratamientos antihelmínticos (fármacos + mano de obra) ha experimentado una notable elevación. Los costes asociados al desarrollo y comercialización de nuevos compuestos antihelmínticos han provocado que el número de nuevos fármacos sea muy reducido. En estas condiciones la inmunoprofilaxis puede ser una alternativa para el control de la hemoncosis.

Las infestaciones por H.contorlus, naturales o experimentales, provocan una protección parcial frente a las reinfestaciones. La aparición de la respuesta protectora es dependiente de la edad y raza de los animales, estimándose que hasta los 6 meses de edad no logran esta capacidad. Ello determina que los animales, en particular corderos, sean receptivos al parásito tras el destete sin que exista la posibilidad de inmunoprotección natural.

A lo largo de los años se han realizado numerosos estudios dirigidos a provocar respuestas inmunitarias protectoras en el ganado ovino frente a las infestaciones por H.contorlus, utilizando infestaciones con L3 viables, L3 atenuadas, extractos antigénicos, antígenos individuales. La menor eficacia de las vacunaciones frente a helmintos está relacionada con las variaciones antigénicas asociadas a los cambios de desarrollo que experimentan a lo largo de su ciclo vital (diversos estadios parasitarios hasta alcanzar la etapa adulta) ; además realizan migraciones intraorgánicas como un mecanismo de evasión de la respuesta inmunitaria y en ocasiones, como es el caso que nos ocupa, se localizan en determinadas zonas del hospedador que no son especialmente sensibles (estómago) frente a los agentes externos lo que dificulta la generación de una respuesta adecuada; sin entrar en la diversidad genética que pueden presentar tanto las poblaciones parásitas como los hospedadores.

Los intentos de desarrollo de una vacuna frente a la hemoncosis han sido muy numerosos utilizando diversos componentes parasitarios (Smith, W.D. and Zarlenga D.S. (2006) . Developments and hurdles in generating vaccines for controlling helminth parasites of grazing ruminants. Veterinar y Parasitology, 139: 347-359) desde aquellos que se encuentran en el nematodo cuando inicia su vida parásita (L3) (US5525508; Goud, G. N.; Zhan, B.; Ghosh, K.; Loukas, A; Hawdon, J.; Dobardzic, A; Deumic, V.; Liu, S.; Dobardzic, R; Zook, R C.; Qun, J.; Liu, Y. Y.; Hoffman, L.; ChungDebose, D.; Patel, R; Mendez, S. and Hotez, P. J. (2004) . Cloning, yeast expression, isolation and vaccine testing of recombinant Ancylostoma secreted protein 1 (ASP-1) and ASP-2 from Ancylostoma ceylanicum. Journal of Infectious Diseases 189: 919-929, Goud, G. N.; Bottazzi, M. E.; Zhan, B.; Mendez, S.; Deumic, V.; Plieskatt, J.; Liu, S.; Wang, Y.; Bueno, L.; Fujiwara, R; Samuel, A; Ahn, S. Y.; Solanki, M.; Asojo, O. A; Wang, J.; Bethony, J. M.; Loukas, A; Roy, M. and Hotez, P. J. (2005) . Expression of the Necator americanus hookworm larval antigen Na-ASP-2 in Pichia pastoris and purification of the recombinant protein for use in human clinical trials. Vaccine 23: 4754-4764; Bethony, J. M.; Loukas, A; Smout, M. J.; Mendez, S.; Wang, Y.; Bottazzi, M. E.; Zhan, B., Williamson, A L.; Lustigman, S.; Correa-Oliveira, R; Xiao, S. H. and Hotez, P. J. (2005) . Antibodies against a secreted protein from hookworm larvae reduce the intensity of infection in humans and vaccinated laborator y animals. FASEB Journal19: 1743-1755; Méndez et al., 2005) hasta componentes de la fase adulta del parásito, proteasas derivadas de su intestino, incluyendo aspartil-, cisteinil-y metaloproteasas (Knox, D.P. and Smith, W.D. (2001) . Vaccination against gastrointestinal nematode parasites of ruminants using gut-expressed antigens. Veterinar y Parasitology,

100: 21-32; Loukas, A; Bethony, J. M.; Williamson, A L.; Goud, G. N.; Mendez, S.; Zhan, B.; Hawdon, J. M.; Bottazzi, M. E.; Brindley, P. J. and Hotez, P. J. (2004) . Vaccination of dogs with a recombinant cysteine protease from the intestine of canine hookworms diminishes the fecundity and growth of worms. Journal of Infectious Diseases 189: 1952-1961; Loukas, A; Bethony,

J. M.; Mendez, S.; Fujiwara, R T.; Goud, G. N.; Ranjit, N.; Zhan, B.; Jones, K.; Bottazzi, M. E. and Hotez, P. J. (2005) . Vaccination with recombinant aspartic hemoglobinase reduces parasite load and blood loss after hookworm infection in dogs. PLoS Medicine 2: e295; Williamson, A L.; Lecchi, P.; Turk,

B. E.; Choe, Y.; Hotez, P. J.; McKerrow, J. H.; Cantley, L. C.; Sajid, M. and Loukas, A (2004) . A multi-enzyme cascade of hemoglobin proteolysis in the intestine of blood-feeding hookworms. Journal of Biological Chemistr y 279:

3560-3567) . La utilización de larvas irradiadas es capaz de inducir una inmunidad protectora en animales adultos aunque no protege a los animales jóvenes. El uso de extractos larvarios purificados (70-83 kOa de L3 desenvainada-Newton, S.E. and Munn, E.A. (1999) . The development of vaccines against gastrointestinal nematode parasites, particularly Haemonchus contortus. Parasitology Today, 15: 116-122) ha mostrado cierta protección, dependiente del adyuvante utilizado, superior con hidróxido de aluminio respecto a QuilA. Se ha logrado una protección parcial en animales mayores con antígenos de excreción y secreción de L4 y adultos del parásito (Hc15/4-Schallig, H.D.F.H.; Van Leeuwen, M.A.W. y Cornelissen, A.W.C.A. (1997) . Protective immunity induced by vaccination with two Haemonchus contortus excretor y secretor y proteins in sheep. Parasite Immunology, 19: 447-453; Bakker, N.; Vervelde, L.; Kanobana, K.; Knox. O.P.; Cornelissen, A.W.C.A.; de Vries, E. y Yatsuda, A.P. (2004) . Vaccination against the nematode Haemonchus contortus with a thiol-binding fraction from the excretor y / secretor y products (ES) . Vaccine, 22: 618-628) . Las inmunizaciones con fracciones de bajo peso molecular procedentes del extracto soluble de adultos del parásito provocaron reduciones inferiores al 60% (Domínguez-Toraño, I.A.; Cuquerella, M.; Gómez-Muñoz, M.T.; Méndez, S.; Fernández-Pérez, F.J. y Alunda, J.M. (2000) . Vaccination of manchego lambs against Haemonchus contortus with a somatic fraction (p26/23) of adult parasites. Parasite Immunology, 22: 131-138) en corderos de menos de 5 meses de edad. Valores menores se han logrado con 3 fracciones de bajo... [Seguir leyendo]

1. Molécula aislada de ácidos nucleicos, caracterizada por SEa ID NO: 1 o con, al menos, un 70% de identidad con SEa ID NO:1, que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Hc23 de H. contortus, caracterizada por SEa ID NO:2, o un polipéptido con, al menos, un 80% de identidad con SEa ID NO:2 que mantiene las propiedades antigénicas de Hc23.

2. Molécula aminoacídica purificada que comprende la secuencia de Hc23 de

H. contortus, caracterizada por SEa ID NO: 2, o una secuencia con, al menos, un 80% de identidad con SEa ID NO: 2 que mantiene las características antigénicas de Hc23.

3. Vector recombinante que incluye una secuencia comprendida en la reivindicación 1.

4. Célula hospedadora procariota transformada con los vectores recombinantes de la reivindicación 3.

5. Célula hospedadora eucariota transfectada con los vectores recombinantes de la reivindicación 3.

6. Composición inmunogénica que incluye: la proteína Hc23, la proteína recombinante rHc23 o polipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con la proteína Hc23; la molécula nucleotídica del gen de Hc23, o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia; vectores que contienen cualquiera de estas secuencias nucleotídicas; células procariotas portadoras de vectores que incluyen la molécula nucleotídica del gen de Hc23, o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia nucleotídica; o células eucariotas portadoras de vectores que incluyen la molécula nucleotídica del gen de Hc23, o secuencias con, al menos, un 70% de identidad con dicha secuencia nucleotídica.

7. Composición inmunogénica según la reivindicación 6 que incluye un adyuvante.

8. Composición inmunogénica según la reivindicación 7 en la que el adyuvante es hidróxido de aluminio.

9. Composición inmunogénica según la reivindicación 7 en la que el adyuvante es una combinación de Propionibacterium acnes inactivado + Iipopolisacáridos de E. coli.

10. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 6-9 en la elaboración de una vacuna frente a la hemoncosis en rumiantes.

11. Uso según la reivindicación 10 en que los rumiantes son ovejas.

12. Uso según la reivindicación 11 en que las ovejas tienen entre 4 y 12 meses de vida.

Fig.1

600 pb

300 pb

100 pb

Fig.2

KDa

94

67

43

30

20, 1

14, 4

Fig.3

hpg 15000

- f-GI

+ Gil

+ GIII

+ GIV

- B-GVI

18 21 24 28 35 42 Días postinfestación Fig.4 2500

..~

GI

'5 1500 ~

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rrm GIV ~ GV 500 ~ GVI

o GI Gil GIJI GIV GV GVI

Fig.5

o 14 28 42 49 63 77 88

Días postvacunación Fig.6

1.5

-

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Días postvacunación

<110> universidad complutense de Madrid

<120> Proteina recombinante de Haemonchus contortus y su produccion de una vacuna frente a la hemoncosis <130> 2012_2

<160> 7

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<220>

<221> COS

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<212> PRT

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<221> SOURCE

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Met Arg Thr Leu val Leu val Ala rle ser val Ala Ala val ser Ala 1 5 10 15

Ala Gly Leu Phe Ala His Hi s Pro Pro pro Glu cys Gly Leu pro pro phe val Asn ASp Leu pro Ala ASp ASp Gln Ala Lys Leu Lys ASp rle 45 Trp Lys Asn Trp Lys Glu Gly ASp Lys cys Tyr His Glu Gln Gly Leu 50 55 60

Thr Arg ASp Leu val Glu Thr Leu Pro Thr Glu rle Arg Arg Lys rle 65 70 75 80 Ser Lys ASp Ala Leu Leu Pro pro Pro val Arg Lys Ala Pro Glu Glu 85 90 95

val Gln Glu Gln Phe Arg Lys rl e rle Asn ASp Lys Thr rl e pro val

100 105 110

Glu Glu Lys His Lys Lys Met Asn Glu Leu Ala Gln Lys val Leu Thr

115 120 125 Gly ASp Asn Leu Lys Glu Tyr Asn Glu phe Thr Ala His rle Glu ASp

130 135 140 Arg His Lys Ala val Ala ASp Lys Ala Ala Thr Leu Ser pro Glu Ala 145 150 155 160

Lys Ala Ala Tyr ASp Lys rle Ala Lys Leu Glu Lys Glu Lys His ASp

165 170 175

rle rle Ala Ser Leu Asn Glu Gln Ala Gln Glu Glu Leu Phe Gln val

180 185 190

Phe Lys Leu Arg His Ser Lys Ser Ala Lys ASp

195 200

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