PROTEÍNA INHIBIDORA DE LA RUTA DE SEÑALIZACIÓN DE WNT.

Proteína inhibidora de la ruta de señalización de wnt, codificándose la proteína por el ADN de la figura 2.

1, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 ó 2.7 o por un ADN relacionado con este ADN mediante el código genético degenerado.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DE1998/003155.

Solicitante: DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM STIFTUNG DES OFFENTLICHEN RECHTS.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: IM NEUENHEIMER FELD 280 69120 HEIDELBERG ALEMANIA.

Inventor/es: NIEHRS,CHRISTOF, GLINKA,ANDREI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/711 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Acidos desoxirribonucleicos naturales, es decir conteniendo unicamente 2'-desoxirribosas unidas a la adenina, la guanina, la citosina o la timina y teniendo enlaces 3'-5' fosfodiester.
  • A61K38/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
  • A61K38/22 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Hormonas (derivados de pro-opiomelanocortina, pro-encefalina o pro-dinorfina A61K 38/33, p. ej. corticotropina A61K 38/35).
  • A61K39/395 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • A61K48/00 A61K […] › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
  • A61P35/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.Agentes antineoplásicos.
  • C07K14/475 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factores de crecimiento; Reguladores de crecimiento.
  • C07K16/22 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra factores de crecimiento.
  • C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/18 C12N 15/00 […] › Hormonas de crecimiento.
  • C12N5/02 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Propagación de células individuales o de células en suspensión; Su conservación; Medios de cultivo para este fin.
  • C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P21/08 C12P 21/00 […] › Anticuerpos monoclonales.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12R1/91 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Líneas celulares.
  • G01N33/53 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

PDF original: ES-2306483_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Proteína inhibidora de la ruta de señalización de wnt.

La presente invención se refiere a una proteína inhibidora de la ruta de señalización de wnt, a un ADN que codifica para una proteína de este tipo y a un procedimiento para la producción de una proteína de este tipo. La invención se refiere además al uso del ADN y de la proteína así como a anticuerpos dirigidos frente a la proteína.

La ruta de señalización de wnt desempeña un papel importante en la regulación de la diferenciación y proliferación celulares durante el desarrollo embrionario de Drosophila, Xenopus laevis y del ratón. La ruta de señalización de wnt comprende la combinación de glicoproteínas secretoras, que están codificadas por genes wnt, por ejemplo Xwnt-8, y receptores de wnt, a los que se unen las glicoproteínas. Además, la ruta de señalización de wnt está implicada en seres humanos de manera causal en el carcinoma de mama y de colon así como en el melanoma (véase Peifer, M., Science 275, (1997) , 1752-1753) . Por tanto, los inhibidores de la ruta de señalización de wnt podrían representar una posibilidad de poder intervenir terapéuticamente en el caso de enfermedades tumorales.

Si bien las solicitudes de patente de prioridad estadounidenses 08/843.704 y 08/842.898, que coinciden ampliamente con la publicación PCT WO 98 46755, describen determinadas proteínas CRSP (dkk3 = hCRSP-1 = T59) , lo hacen sin embargo sin ninguna función.

Por consiguiente, la presente invención se basa en el objetivo de proporcionar un agente con el que pueda inhibirse la ruta de señalización de wnt.

Esto se consigue según la invención mediante los objetos en las reivindicaciones.

Por consiguiente, es objeto de la presente invención una proteína inhibidora de la ruta de señalización de wnt según la reivindicación 1.

La presente invención se basa en el conocimiento del solicitante de que existe una proteína en animales, especialmente mamíferos, muy especialmente el ser humano, que inhibe la ruta de señalización de wnt. El solicitante ha encontrado que la expresión del gen wnt, Xwnt-8, en Xenopus laevis conduce a la formación de gemelos siameses. Esta malformación se evita cuando se expresa simultáneamente la proteína citada anteriormente. Esta proteína es una proteína secretora de aproximadamente 40 kD. Las variantes de la proteína están expuestas en forma de sus ADN en la figura 2. Además, el solicitante ha reconocido que se expresan variantes de la proteína en distintos tejidos (véase la tabla 1 y la figura 3) .

En la presente invención, la proteína citada anteriormente se denomina como “inhibidor de wnt” (wnt-I) .

Otro objeto de la presente invención es un ADN que codifica para (wnt-I) . Éste puede ser por ejemplo un ADN genómico

o un ADNc. Éste es un ADN que comprende lo siguiente:

(a) el ADN de la figura 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 ó 2.7

(b) un ADN relacionado con el ADN de (a) mediante el código genético degenerado.

El ADN de la figura 2 comprende siete ADN, que proceden de Xenopus laevis, ratón, ser humano o gallina y codifican para (wnt-I) . Seis de estos ADN se depositaron en la DSMZ (“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen”, Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) el 19 de septiembre de 1997 tal como sigue:

Figura 2.1 (ADN de ser humano) como phdkk-3 con DSM 11762 Figura 2.2 (ADN de gallina) tiene la denominación pcdkk-3 Figura 2.3 (ADN de ratón) como pmdkk-2 con DSM 11759 Figura 2.4 (ADN de ser humano) como phdkk-2 con DSM 11761 Figura 2.5 (ADN de ratón) como pmdkk-1 con DMS 11758 Figura 2.6 (ADN de ser humano) como phdkk-1 con DSM 11760 Figura 2.7 (ADN de Xenopus laevis) como pRNdkk-1 con DSM 11757

A continuación se describe un ADN según la invención en forma de un ADNc. Éste representa a modo de ejemplo cualquier ADN que está abarcado por la presente invención.

Para la producción de un ADNc según la invención es favorable partir de una biblioteca de ADNc de Xenopus laevis (véase Glinka, A. et al., Mechanisms Develope. 60, (1996) , 221-231) . A partir de los clones de ADNc individuales sesintetizan los correspondientes ARNm por medio de la ARN polimerasa. Éstos se microinyectan junto con el ARNm de genes wnt, por ejemplo Xwnt-8, en Xenopus laevis. Se examina la formación de gemelos siameses en Xenopus laevis.

Éstos se obtienen cuando el ARNm del gen wnt se microinyecta solo o junto con tal ARNm de Xenopus laevis, que no codifica para (wnt-I) . Por consiguiente, la no aparición de gemelos siameses se valora como prueba de la existencia de un ARNm que codifica para (wnt-I) . Un ARNm de este tipo puede reconocer directamente al correspondiente ADNc.

Un ADNc según la invención puede encontrarse en un vector o vector de expresión. El experto conoce ejemplos de éstos. En el caso de un vector de expresión para E. coli estos son por ejemplo pGEMEX, derivado de pUC, pGEX-2T, pET3b y pQE-8. Para la expresión en levadura han de mencionarse por ejemplo pY100 y Ycpad1, mientras que para la expresión en células animales se exponen por ejemplo pKCR, pEFBOS, cDM8 y pCEV4. Para la expresión en células de insecto es especialmente adecuado el vector de expresión de baculovirus pAcSGHisNT-A.

El experto conoce células adecuadas para expresar un ADNc que se encuentra en un vector de expresión según la invención. Los ejemplos de tales células comprenden las cepas de E. coli HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 y SG 13009, la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae y las células animales L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero y HeLa así como las células de insecto sf9.

El experto sabe de qué manera debe insertarse un ADNc según la invención en un vector de expresión. También conoce que puede insertarse este ADNc junto con un ADN que codifica para otro péptido o proteína, de modo que el ADNc según la invención puede expresarse en forma de una proteína de fusión.

Además, el experto conoce las condiciones para cultivar células transformadas o transfectadas. También conoce procedimientos para aislar y para purificar la proteína expresada por el ADNc según la invención. Por consiguiente, una proteína de este tipo, es también objeto de la presente invención.

Otro objeto de la presente invención es un anticuerpo dirigido frente a una proteína citada anteriormente. Un anticuerpo de este tipo puede producirse mediante procedimientos habituales. Puede ser monoclonal. Para su producción es favorable inmunizar con una proteína (de fusión) citada anteriormente o fragmentos de la misma, animales, especialmente ratones para obtener un anticuerpo monoclonal. Pueden tener lugar otras “inmunizaciones de recuerdo” en los animales con la misma proteína (de fusión) o fragmentos de la misma. El anticuerpo policlonal puede obtenerse entonces a partir del suero o la yema de huevo de los animales. Para el anticuerpo monoclonal se fusionan células esplénicas de los animales con células de mieloma.

La presente invención permite estudiar y entender mejor la ruta de señalización de wnt. Con un anticuerpo según la invención puede detectarse (wnt-I) en organismos. Además puede detectarse un autoanticuerpo dirigido frente a esta proteína con un (wnt-I) según la invención. Ambas detecciones pueden tener lugar mediante procedimientos habituales, especialmente una inmunotransferencia de tipo Western, un ELISA, una inmunoprecipitación o mediante inmunofluorescencia. Además puede detectarse la expresión del gen que codifica para (wnt-I) con un ácido nucleico según la invención, especialmente un ADN y cebadores derivados del mismo. Esta detección puede tener lugar de manera habitual, especialmente en una transferencia de tipo Southern.

Por consiguiente, con la presente invención también pueden estudiarse, es decir diagnosticarse, y entenderse mejor procesos que están relacionados con la ruta de señalización de wnt. Éstos son por ejemplo la diferenciación y proliferación celulares así como enfermedades de diferente tipo. Ejemplos de las últimas son enfermedades del ojo y de los huesos así como enfermedades tumorales, especialmente carcinoma de mama y de colon así como melanoma.

Además, la presente invención es adecuada para tomar medidas para y contra la existencia de (wnt-I) en organismos. Con un anticuerpo según la invención puede inhibirse (wnt-I) en organismos. Por otro lado puede elevarse la cantidad de (wnt-I) en organismos con un (wnt-I) según la invención,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proteína inhibidora de la ruta de señalización de wnt, codificándose la proteína por el ADN de la figura 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 ó 2.7 o por un ADN relacionado con este ADN mediante el código genético degenerado, comprendiendo la proteína al menos una de las secuencias consenso de aminoácidos I y II:

significando la indicación “-” un aminoácido, siendo el número de aminoácidos variable cuando presentan un asterísco.

2. ADN, que codifica para la proteína según la reivindicación 1, siendo el ADN aquél de la figura 2.3, 2.4, 10 2.5, 2.6 ó 2.7 o un ADN relacionado con este ADN mediante el código genético degenerado.

3. Plásmido de expresión, que comprende el ADN según la reivindicación 2.

4. Transformante, que contiene el plásmido de expresión según la reivindicación 3.

5. Procedimiento para la producción de la proteína según la reivindicación 1, que comprende el cultivo del transformante según la reivindicación 4 en condiciones adecuadas.

6. Anticuerpo monoclonal, dirigido frente a la proteína según la reivindicación 1.


 

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