Proteína de fusión OX40-inmunoglobulina trimérica y métodos de uso.

Un polipéptido de fusión, que comprende en una orientación de N-terminal a C-terminal:

un dominio de inmunoglobulina, en el que el dominio de inmunoglobulina es un dominio Fc;

un dominio de trimerización, en el que el dominio de trimerización es un dominio de trimerización superenrollado seleccionado del grupo que consiste en:

a) un dominio de cremallera de isoleucina,

b) TRAF2,

c) Trombospondina 1,

d) Matrilina-4,

e) CMP

(Matrilina-1),

f) HSF1, o

g) Cubilina; y

un dominio de unión al receptor, en el que el dominio de unión al receptor es un dominio de unión al receptor del ligando (L) de OX-40;

en el que el polipéptido de fusión se autoensambla en una proteína de fusión trimérica.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/017285.

Solicitante: PROVIDENCE HEALTH SYSTEM.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 9205 SW BARNES ROAD PORTLAND OR 97225 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: WEINBERG,ANDREW,D, MORRIS,NICHOLAS P, PETERS,CARMEN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K39/00 (Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K48/00 (Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/04 (Péptidos o polipéptidos cíclicos o puenteados, p. ej. bacitracina (ciclados solamente por enlaces — S — S — C12P 21/02))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/86 (Vectores virales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS;... > Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido... > C07H21/04 (con desoxirribosilo como radical sacárido)

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Fragmento de la descripción:

Proteína de fusión OX40-inmunoglobulina trimérica y métodos de uso

Campo La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para generar respuestas inmunitarias potenciadas en animales, en particular en mamíferos humanos y no humanos. En concreto, la presente divulgación se refiere a una proteína de fusión del ligando de OX-40 trimérica y a métodos para su uso. Más generalmente, la presente divulgación se refiere a proteínas de fusión triméricas que incluyen un dominio de unión al receptor (ligando) , un dominio de trimerización y un dominio de dimerización, tal como un dominio Fc de inmunoglobulina.

Antecedentes Numerosas interacciones receptor-ligando están implicadas en la inducción, establecimiento y modulación de las respuestas inmunitarias dirigidas contra los antígenos. Son necesarias al menos dos señales para activar una respuesta de linfocitos T CD4 o CD8 al antígeno (Lenschow et al. (1996) Ann. Rev. Immunol. 14: 233-258) . La primera señal se libera a través del receptor de linfocitos T (TCR) por un antígeno (normalmente un péptido) unido a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o II presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno (CPA) . La segunda señal implica la unión de un ligando presente en la superficie de la CPA a una segunda molécula receptora en la superficie del linfocito T. Esta segunda señal se denomina coestimulación y el ligando de la CPA a menudo se denomina molécula coestimuladora.

Durante la activación de los linfocitos T CD4+ se libera una coestimulación importante mediante la interacción receptor OX-40/ligando de OX-40. Se ha demostrado que el receptor OX-40 ("OX-40") (Paterson et al. (1987) Mol. Immunol. 24:1281-1290; Calderheadet al. (1993) J. Immunol. 151:5261-5271) solo está presente en los linfocitos T CD4+ activados por antígeno in vivo (Weinberg et al. (1994) J. Immunol. 152:4712-4721; Wienberg et al. (1996) Nature Medicine 2:183-189) al contrario que el receptor CD28, que está presente en la superficie de muchas subclases de linfocitos T (con independencia de si están activados o no) . Por ejemplo, OZ-40 está presente en los linfocitos T CD4+ activados que reconocen autoantígenos en el lugar de la inflamación en las enfermedades autoinmunitarias, pero no en la periferia. También se ha demostrado que OX-40 está presente en la superficie de un porcentaje de linfocitos T CD4+ aislados de linfocitos que se infiltran en tumores y células de ganglios linfáticos drenantes extraídos de pacientes con tumores de células escamosas de cabeza y cuello y melanomas (Vetto et al. (1997) Am. J. Surg. 174: 258-265) . Se ha demostrado que el ligando de OX-40, un miembro de la superfamilia del

factor de necrosis tumoral (TNF) coestimula los linfocitos T que se han activado con un anticuerpo anti-CD3 (es decir, de un modo no específico de antígeno) (Godfrey et al. (1994) J. Exp. Med. 180: 757-762) . A pesar del reconocimiento de las propiedades coestimulantes del ligando de OX-40, sus beneficios no se han explotado previamente por completo para potenciar una respuesta inmunitaria específica de antígeno. El documento US-A5457035 divulga OX-40L unido a un dominio Fc o a una cremallera de leucina. El documento US 2002 054873 divulga OX-40L unido a un dominio Fc.

Sumario La presente divulgación se refiere a polipéptidos de fusión que incluyen un dominio de ligando, un dominio de 45 trimerización y un dominio Fc de inmunoglobulina, que pueden formar proteínas de fusión multiméricas estables. Se proporcionan composiciones y métodos que son útiles para potenciar y mantener una respuesta inmunitaria de un mamífero a un antígeno. Más específicamente, la presente divulgación proporciona nuevas proteínas de fusión ligandos de OX40 ("OX-40L") así como ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que forman proteínas de fusión ligandos de OX40. La presente divulgación proporciona también métodos de uso de las proteínas de fusión ligandos de OX40 triméricas para potenciar y/o mantener una respuesta inmunitaria específica de antígeno en un sujeto.

La invención se detalla adicionalmente en la descripción, figuras y ejemplos no limitantes expuestos a continuación.

Breve descripción de los dibujos 55 La figura 1 ilustra esquemáticamente un ejemplo de proteína multimérica, a saber una proteína de fusión OX-40L.

La figura 2 es una imagen de un gel de agarosa que ilustra el inserto Fc/ILZ/OX-40L de tamaño correcto y el vector.

La figura 3A es un gráfico de líneas que ilustra la cantidad de polipéptido de fusión eluido en cada fracción de elución tras la unión a una columna de proteína G. La figura 3B es una imagen de un gel de acrilamida al 10 % en condiciones reductoras y teñido con azul de Coomassie, que ilustra una elución máxima en el pico 6-7.

Las figuras 4A-D son transferencias de tipo Western que ilustran la unión de IgG antihumana (A y B) y anticuerpos 65 anti-OX-40L antihumanos (C y D) a proteína purificada. A y C ilustran transferencias de geles realizadas en condiciones reductoras, mientras que B y D ilustran transferencias de geles realizadas en condiciones no reductoras.

En cada panel se muestra una dilución en serie.

La figura 5 es una imagen digital de un gel de acrilamida teñido con azul de coomassie que ilustra el perfil de elución en el medio de elución ActiSep.

La figura 6 es un gráfico que ilustra los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño de comparación de las proteínas de fusión OX-40L humanas con y sin un dominio de trimerización.

La figura 7 es un gráfico que ilustra la proliferación de linfocitos T en respuesta a la exposición a la proteína de fusión OX-40L humana multimérica.

Breve descripción del listado de secuencias Las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos enumeradas en el listado de secuencias adjunto se muestran usando abreviaturas de letras estándar para las bases nucleotídicas y un código de una letra para los aminoácidos, según se define en el Capítulo 37 del C.F.R. parte 1.822. Solo se muestra una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la hebra complementaria está incluida en cualquier referencia a la hebra mostrada. Todas las secuencias designadas en el presente documento con el número de registro en GENBANK® hacen referencia a secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos accesibles por vía electrónica a partir del 6 de mayo de 2005.

La SEC ID N.º: 1 es la secuencia polinucleotídica de un dominio de unión al receptor OX-40 humano.

La SEC ID N.º: 2 es la secuencia de aminoácidos de un dominio de unión al receptor OX-40 humano.

La SEC ID N.º: 3 es la secuencia polinucleotídica de un dominio de trimerización de una cremallera de isoleucina (ILZ) .

La SEC ID N.º: 4 es la secuencia de aminoácidos de un dominio de trimerización de una cremallera de isoleucina (ILZ) de Gcn4 mutante de levadura.

La SEC ID N.º: 5 es la secuencia polinucleotídica de un dominio Fc de inmunoglobulina humana.

La SEC ID N.º: 6 es la secuencia de aminoácidos de un dominio Fc de inmunoglobulina humana.

La SEC ID N.º: 7 es la secuencia polinucleotídica de un polipéptido de fusión del ligando de OX-40 humano.

La SEC ID N.º: 8 es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión del ligando de OX-40 humano.

La SEC ID N.º: 9 es la secuencia del ligando de OX-40 indicada con el número de registro en GENBANK® NM 003326.

La SEC ID N.º: 10 es la secuencia de nucleótidos del cebador hFcyl-5'.

La SEC ID N.º: 11 es la secuencia de nucleótidos del cebador hOX-40L-3'.

La SEC ID N.º: 12 es la secuencia polinucleotídica de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un polipéptido de fusión, que comprende en una orientación de N-terminal a C-terminal: 5 un dominio de inmunoglobulina, en el que el dominio de inmunoglobulina es un dominio Fc; un dominio de trimerización, en el que el dominio de trimerización es un dominio de trimerización superenrollado seleccionado del grupo que consiste en:

a) un dominio de cremallera de isoleucina, b) TRAF2, c) Trombospondina 1,

d) Matrilina-4, e) CMP (Matrilina-1) , 20 f) HSF1, o g) Cubilina; y un dominio de unión al receptor, en el que el dominio de unión al receptor es un dominio de unión al receptor del 25 ligando (L) de OX-40; en el que el polipéptido de fusión se autoensambla en una proteína de fusión trimérica.

2. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión de OX-40L trimérica se puede unir al 30 receptor OX-40 y estimular al menos una actividad mediada por OX-40.

3. El polipéptido de fusión de la reivindicación 2, en el que la actividad mediada por OX-40 es la proliferación de linfocitos T CD4+.

4. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el dominio de unión al receptor OX-40 comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEC ID N.º: 2.

5. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el dominio de cremallera de isoleucina comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEC ID N.º: 4 con la capacidad para formar un dominio de 40 trimerización superenrollado.

6. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el dominio Fc de inmunoglobulina comprende los dominios CH2 y CH3 del FC de IgG humana.

7. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEC ID N.º: 8.

8. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 8.

9. El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, en el que el polipéptido está codificado por un ácido nucleico que hibrida en condiciones muy rigurosas con un ácido nucleico con la secuencia de polinucleótidos de SEC ID N.º: 7.

10. El polipéptido de fusión de la reivindicación 9, en el que el polipéptido está codificado por un ácido nucleico con la secuencia de polinucleótidos de SEC ID N.º: 7 o una secuencia de polinucleótidos que comprende al menos un 55 codón degenerado con respecto a la SEC ID N.º: 7 que codifica un polipéptido idéntico.

11. Una proteína de fusión que comprende una pluralidad de los polipéptidos de fusión de la reivindicación 1.

12. La proteína de fusión de la reivindicación 11, que consiste en tres o seis polipéptidos de fusión. 60

13. Un ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de fusión de la reivindicación 1 a 10 o la proteína de fusión de la reivindicación 11 o 12.

14. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 13, la secuencia de polinucleótidos que comprende en 65 dirección de 5' a 3’:

una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio Fc;

una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio de trimerización superenrollado; y

un polinucleótido que codifica el dominio de unión al receptor del ligando OX40.

15. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 13, en el que el ácido nucleico hibrida en condiciones muy rigurosas con un ácido nucleico con la secuencia de polinucleótidos de SEC ID N.º: 7.

16. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 15, en el que el ácido nucleico comprende la secuencia de polinucleótidos de SEC ID N.º: 7.

17. Una composición que comprende el polipéptido de fusión de la reivindicación 1 a 10 o la proteína de fusión de la reivindicación 11 o 12, o que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de la reivindicación 1 15 a 10 o la proteína de fusión de la reivindicación 11 o 12.

18. Un polipéptido de fusión de la reivindicación 1 a 10 o la proteína de fusión de la reivindicación 11 o 12 o el ácido nucleico recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17 para usar en un método de potenciación de una respuesta inmunitaria en un sujeto,

comprendiendo el método: administrar a un sujeto expuesto a un antígeno, una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión, ácido nucleico recombinante o composición farmacéutica, de modo que se potencia la respuesta inmunitaria al antígeno por el sujeto.

19. La proteína de fusión, el ácido nucleico recombinante o la composición farmacéutica de la reivindicación 18, en 25 la que el sujeto es un sujeto humano.

20. La proteína de fusión de la reivindicación 19, en la que el sujeto está expuesto al antígeno antes de administrar la proteína de fusión.

21. La proteína de fusión de la reivindicación 20, en la que la proteína de fusión se administra al sujeto entre aproximadamente 0 y 10 días después de la exposición al antígeno.

22. La proteína de fusión de la reivindicación 20 o 21, en la que el antígeno y la proteína de fusión se administran al

mismo tiempo. 35

23. La proteína de fusión de la reivindicación 20 o 21, en la que la proteína de fusión se administra expresando un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión de OX-40L, en el que el polipéptido de fusión se ensambla en la proteína de fusión en al menos una célula del sujeto.

24. La proteína de fusión de la reivindicación 23, en la que el ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión de OX-40L se introduce ex vivo en al menos una célula y al menos una célula que comprende el ácido nucleico recombinante se introduce en el sujeto.

25. La proteína de fusión de la reivindicación 24, en la que la al menos una célula es una célula presentadora de 45 antígenos o una célula tumoral.

26. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en la que el método comprende administrar la proteína de fusión introduciendo en el sujeto un vector viral o plasmídico que comprende el ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de OX-40L, en el que el polipéptido de fusión se ensambla en la 50 proteína de fusión.

27. La proteína de fusión de la reivindicación 26, en la que el vector viral es un vector adenovírico, un vector retrovírico o un vector herpesvírico.

28. La proteína de fusión de la reivindicación 27, en la que el vector viral es un virus atenuado o inactivado.

29. La proteína de fusión de la reivindicación 18, en la que el antígeno es un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno tumoral.

Número de Fracción