Proteína de fusión que comprende un dominio de Caspasa y un dominio de unión de receptor nuclear de hormonas y procedimientos y usos de la misma.

Una proteína de fusión que comprende

(a) un dominio de Caspasa capaz de inducir apoptosis y

(b) un dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormonas, en el que el dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormonas es activado después de la unión de un ligando al dominio de unión a ligando del receptor nuclear.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/005013.

Solicitante: HELMHOLTZ ZENTRUM MUNCHEN DEUTSCHES FORSCHUNGSZENTRUM FUR GESUNDHEIT UND UMWELT (GMBH).

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: INGOLSTÄDTER LANDSTRASSE 1 85764 NEUHERBERG ALEMANIA.

Inventor/es: KUHN, RALF, WURST,WOLFGANG, CHU,YUANYUAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/64 (que provienen de tejido animal, p. ej. renina)
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Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Proteína de fusión que comprende un dominio de Caspasa y un dominio de unión de receptor nuclear de hormonas y procedimientos y usos de la misma La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un dominio de Caspasa y un dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormonas, un ácido nucleico codificante de la proteína de fusión, un vector o célula que comprende el ácido nucleico, un procedimiento de producción de la proteína de fusión, un organismo transgénico no humano que contiene el ácido nucleico o el vector, el uso de la proteína de fusión para la inducción mediada por ligando de la apoptosis de una célula, o para estudiar la función de una célula, tejido y/u órgano, un procedimiento in vitro para inducir la apoptosis de una célula que expresa una proteína de fusión o para identificar un ligando o una proteína de fusión, el ácido nucleico, el vector y/o la célula para uso como un medicamento o para el tratamiento de una enfermedad que requiere el aumento de la apoptosis, particularmente para el tratamiento del cáncer o durante o después del trasplante, particularmente como mecanismo de seguridad.

Uno de los objetivos de la investigación genética y genómica se centra en la elucidación de la función de los genes individuales dentro de las células y organismos. Muchos genes están activos solo en ciertas células y, de ese modo, contribuyen a la compleja organización del cuerpo de los mamíferos compuesto de cientos de diferentes tipos de células. A nivel de todo el organismo ni los genes individuales ni las familias de genes interactúan pero existe una población de tipos de células y cumplen funciones biológicas.

Para investigar estas funciones celulares de forma experimental, una herramienta poderosa es el análisis de mutantes. Al igual que los mutantes genéticos que se utilizan para estudiar la función de los genes individuales y crear modelos de enfermedad genética es deseable poder crear mutantes para tipos de células o poblaciones de células específicas con el fin de estudiar su papel funcional in vivo. Este aspecto es de especial interés para la creación de modelos animales de enfermedades degenerativas humanas que se caracterizan por la pérdida de poblaciones de células específicas, p. ej., la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson, o para imitar el daño de órganos específicos como el corazón o el hígado.

Además, las células tomadas de un donante individual o las células cultivadas en cultivos in vitro pueden ser trasplantadas o transferidas a un receptor confines de investigación o terapéuticos. Después de la transferencia celular, es deseable poder extirpar específicamente todas o algunas de las células trasplantadas bien para estudiar las funciones que estas células cumplen en el cuerpo del receptor o para realzar la seguridad de la terapia celular si las células trasplantadas se enhebran al receptor mediante, p. ej., tumorigénesis o una reacción de injerto contra el anfitrión (Cohen, et al., Inmunol Today, 20, 172-176 (1999)) (Cohen, et al., Leuk Lymphoma, 34, 473-480 (1999)) (Cohen, et al., Hum Gene Ther, 10, 2701-2707 (1999) (Berger, et al., Blood, 103, 1261-1269 (2004)).

Además, en una terapia contra el cáncer denominada terapia con gen suicida las células tumorales están equipadas con un vector de expresión para un gen que permite destruir estas células después de la administración de un fármaco específico (Hurwitz, et al., Hum Gene Ther, 10, 441-448 (1999)) (Fillat, et al., Curr Gene Ther, 3, 13-26 (2003)) (Niculescu-Duvaz y Springer, Mol Biotechnol, 30, 71-88 (2005)) (Portsmouth, et al., Mol Aspects Med, 28, 4- 41 (2007)).

En conclusión, un aspecto importante de la investigación biológica y médica es poder manipular la composición celular de un organismo tal como el cuerpo de un mamífero. Idealmente, estarían disponibles procedimientos que permiten la extirpación de células de una manera específica y también sincronizada y que son seguros, sencillos y universalmente aplicables a todos los tipos de células y órganos del cuerpo de un mamífero.

En las últimas dos décadas se ha desarrollado una variedad de procedimientos genéticos para extirpar células seleccionadas del cuerpo, mayormente utilizando el ratón como organismo modelo. Estas estrategias se pueden clasificar en procedimientos no inducibles que no pueden ser regulados desde fuera y conducen a la muerte celular preprogramada durante el desarrollo y en procedimientos inducibles que emplean inicialmente transgenes inofensivos que son capaces de mediar en la muerte celular después de la administración de una molécula inductora.

Los diversos procedimientos se distinguen además por los mecanismos bioquímicos que conducen a la muerte celular, es decir, bien por la acumulación de productos tóxicos y muerte celular necrótica o bien por el uso de vías endógenas que conducen a la muerte celular programada por apoptosis. El sistema inmune innato reacciona de manera diferente con las células que se sometieron a la muerte celular patológica (necrosis) o fisiológica (apoptosis), de manera que el aclaramiento de las células necróticas está asociado con respuestas proinflamatorias de macrófagos fagocíticos (Cocco y Ucker, Mol Biol Cell, 12, 919-930 (2001)) (Krysko, et al., Apoptosis, 11, 1709-1726 (2006)). Por lo tanto, el último procedimiento es el más apropiado para modelar los procesos de enfermedad que implican la muerte celular apoptótica.

Las estrategias para la extirpación celular no inducible en ratones han utilizado transgenes que emplean la expresión específica del tipo de célula de proteínas tóxicas como la cadena A de la toxina de la Difteria (Breitman, et al., Science, 238, 1563-1565 (1987)) (Breitman, et al., Mol Cell Biol, 10, 474-479 (1990)) (Kaur, et al., Development, 105, 613-619 (1989)) o de Ricina (Landel, et al., Genes Dev, 2, 1168-1178 (1988)). Este procedimiento fue posteriormente refinado de manera que la expresión de la toxina de la Difteria puede ser controlada por la actividad de la Cre recombinasa. En ratones transgénicos dobles de este tipo, la Cre recombinasa se expresa a partir de un promotor específico del tipo de célula mientras que el transgen de la toxina de la Difteria está bajo el control de un promotor activo ubicuo pero la expresión de la toxina sólo se produce después de la supresión mediada por Cre de un segmento de ADN inhibidor (Brockschnieder, et al., Mol Cell Biol, 24, 7636-7642 (2004)) (Brockschnieder, et al., Genesis, 44, 322-327 (2006)) (Ivanova, et al., Genesis, 43, 129-135 (2005)). Las estrategias de extirpación celular no inducible se basan únicamente en la actividad de la región del promotor específico del tipo de célula, cuya actividad no puede ser influenciada adicionalmente in vivo. Por ello, la extirpación de células se produce después de la activación inicial de la región del promotor utilizado durante el desarrollo embrionario.

Para obtener también control sobre el momento de la extirpación celular se han desarrollado una variedad de estrategias de extirpación inducible. Dos de estos procedimientos se basan en la expresión transgénica de enzimas procariotas que modifican profármacos específicos en derivados citotóxicos. Los profármacos no son reconocidos por las enzimas de los mamíferos. Por ello, las células que expresan la enzima procariota solo son destruidas después de la administración del profármaco específico.

El uso de un derivado de la timidina cinasa derivada del virus Herpes Simplex (HSV-tk) permite la destrucción de células que se dividen, expresando HSV-tk, por la administración de Ganciclovir (GANC) (Sofroniew, et al., Brain Res, 835, 91-95 (1999)) (Visnjic, et al., J Bone Miner Res, 16, 2222-2231 (2001)) (Rindi, et al., Development, 126, 4149-4156 (1999)) (Tian, et al., Am J Pathol, 163, 789-801 (2003)) (Ito, et al., Nat Med, 11, 1351-1354 (2005)) (Dancer, et al., Gene Ther, 10, 1170-1178 (2003)) (Lalancette-Hebert, et al., J Neurosci, 27, 2596-2605 (2007)) (Zhang, et al., Febs J, 272, 2207-2215 (2005)). GANC es fosforilada solo por HSV-tk y después bloquea la replicación del ADN conduciendo a la muerte de las células mitóticas. Las células que quedan, posmitóticas, no pueden ser extirpadas con el sistema HSV-tk/GANC.

El uso del gen Nitrorreductasa (NTR) derivado de E. Coli permite la destrucción de las células que expresan NTR mediante la administración del profármaco CB1954 (Clark, et al., Gene Ther, 4, 101-110 (1997)) (Cui, et al., Glia, 34, 272-282 (2001)) (Isles, et al., J Neurobiol, 47, 183-193 (2001)) (Gusterson, et al., Recent Results Cancer Res, 163, 31-45 (2003)). El derivado citotóxico conduce a la formación de reticulaciones de ADN entre cadenas que están mal reparadas por las células. El sistema NTR es independiente del ciclo celular y se puede aplicar a células que no se dividen (Grove, et al., Cancer Res, 63, 5532-5537 (2003)). El profármaco CB1954, sin embargo, ha evolucionado a partir de la terapia del cáncer y se ha observado un efecto espectador significativo debido a la diseminación local del profármaco activado que conduce a la muerte de las células vecinas (Bridgewater, et al., Hum Gene Ther, 8, 709- 717 (1997)) (Nishihara, et al., Anticancer Res, 18, 1521-1525 (1998)). Aunque este efecto es beneficioso para la terapia del cáncer disminuye la utilidad del sistema NTR para la extirpación de células específicas.

En otro enfoque inducible, células que expresan un receptor para la toxina de la Difteria (DTR) a partir de un transgen específico del tipo de célula pueden ser destruidas por la administración in vivo de la cadena A de la toxina de la Difteria (DTA) (Buch, et al., Nat Methods, 2, 419-426 (2005)) (Chang y Yang, Sci STKE, 2003, PL1 (2003)) (Stoneman, et al., Circ Res, (2007)). La DTA es tóxica después de la internalización que es mediada por el DTR transgénico.

Aparte del uso de toxinas o enzimas que conducen a productos citotóxicos, se han desarrollado dos procedimientos para la extirpación de célula inducible que aprovechan mecanismos celulares endógenos de muerte celular programada.

En el sistema descrito el Takebayashi (Takebayashi, et al., Cancer Res, 56, 4164-4170 (1996)), la transmembrana y el dominio intracelular del receptor de muerte Fas (aminoácido 135-305) se han fusionado de forma N-terminal al dominio de unión a ligando del receptor de estrógenos de rata. Esta proteína de fusión era constitutivamente expresada en células L929 conocidas por ser sensibles a apoptosis mediada por Fas. A partir de estudios con receptor de estrógenos de tipo silvestre se ha encontrado que después de la administración del ligando el dominio ER experimenta un cambio conformacional que conduce a la disociación de las proteínas de choque térmico ligadas y a la dimerización del receptor. La administración de estradiol a las células L929 que expresan Fas-ER, linfocitos T o células HeLa conducen a muerte celular por apoptosis (Takebayashi, et al., Cancer Res, 56, 4164-4170 (1996)) (Kawaguchi, et al., Cancer Lett, 116, 53-59 (1997)) (Kametaka, et al., Cancer Sci, 94, 639-643 (2003)).

En una Variación de este procedimiento, el dominio ER no modificado se reemplazó por un dominio de unión a ligando ER de murino mutante (aminoácidos 287-599) que alberga un único intercambio de aminoácidos (G525R). Esta mutación conduce a una afinidad considerablemente reducida por estradiol pero el receptor todavía puede ser activado por el 4-OH-tamoxifeno. Esta proteína de fusión Fas-ER (G525R) se ensayó en la línea celular L929 de ratón (Kodaira, et al., Jpn J Cancer Res, 89, 741-747 (1998)). El procedimiento Fas-ER utiliza la vía de la apoptosis CD95 extrínseca para inducir la muerte celular. Dado que esta vía está restringida in vivo en gran parte a células del sistema inmune (Krammer, Nature, 407, 789-795 (2000)) la mayoría de los otros tipos de células del cuerpo pueden no ser sensibles a las proteínas de fusión Fas-ER.

Un procedimiento de extirpación celular que utiliza componentes expresados de forma ubicua de las vías de la apoptosis intrínseca fue descrito por primera vez por MacCorkle (MacCorkle, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 95, 3655-3660 (1998)). Para este procedimiento, un dominio FKBP de la proteína de unión de FK506 se fusionó con el N-término de Caspasa-1 o Caspasa-3 y se expresó en células de linfoma de células T Jurkat humanas. Después de la administración de FK506 dímero (FK1012; Pruschy, et al., Chem Biol, 1, 163-172 (1994)), un inductor químico de dimerización (CID), las proteínas de fusión experimentan oligomerización y conducen a muerte celular por apoptosis.

Este sistema se desarrolló adicionalmente por la fusión de uno o más dominios (Fv) de la FKBP modificados al N- término de Fas, Bax, Caspasa-1, -3, -8 y -9 (Fan, et al., Hum Gene Ther, 10, 2273-2285 (1999)) (Hou y Hsu, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 289, H477-487 (2005)). El dominio Fv se puede dimerizar por los análogos AP1903 (Fan, et al., Hum Gene Ther, 10, 2273-2285 (1999)) o AP20187 (Chang, et al., J Biol Chem, 278, 16466-16469 (2003)) de FK1012 que exhiben una mayor afinidad por el dominio Fv modificado que la FKBP de tipo silvestre. Sin embargo, FK506 y análogos que se unen a FKBP exhiben una fuerte acción inmunosupresora in vivo (Bierer, et al., Curr Opin Immunol, 5, 763-773 (1993)). El sistema de apoptosis CID se ha utilizado para la extirpación de células endoteliales trasplantadas in vivo que eran transducidas con un vector viral que expresa una proteína de fusión Fv-Caspasa-9 (Nor, et al., Gene Ther, 9, 444-451 (2002)) y mostrar la terapia del gen suicida de las células de cáncer de próstata con un vector viral que expresa una proteína Fv-Caspasa-1 (Shariat, et al., Cancer Res, 61, 2562-2571 (2001)). Este sistema se utilizó adicionalmente en ratones transgénicos que expresan una proteína de fusión Fv-Caspasa-3 en hepatocitos como un modelo de lesión hepática inducible (Mallet, et al., Nat Biotechnol, 20, 1234-1239 (2002)) y en ratones transgénicos que expresan una proteína de fusión Fv-Caspasa-8 en adipocitos para crear un modelo de la lipoatrofia inducible (Pajvani, et al., Nat Med, 11, 797-803 (2005)).

Aunque se han emprendido grandes esfuerzos para encontrar sistemas que permitan la extirpación de célula inducible en el cuerpo de los mamíferos las tecnologías existentes tienen severas limitaciones que limitan su uso práctico: 1. La expresión de la toxina de la difteria a partir de un promotor específico del tipo de célula o la activación de un gen de la toxina de la difteria por la Cre recombinasa expresada a partir de un promotor específico del tipo de célula no permite la inducción de la extirpación celular desde fuera y no proporciona control sobre el momento de la extirpación celular.

2. La extirpación de células que expresan HSV-timidina cinasa por la administración de GANC permite la inducción desde fuera pero este sistema está limitado a células que proliferan activamente. Las células restantes como las neuronas maduras no pueden ser extirpadas.

3. El sistema de nitrorreductasa se deriva de la terapia del cáncer y puede conducir a la muerte celular inespecífica de células vecinas.

4. La activación de un gen receptor de la toxina de la difteria a través de la Cre recombinasa expresada a partir de un promotor específico del tipo de célula seguido por la administración de la toxina de la difteria es poco práctico porque requiere dos transgenes independientes y la generación de ratones transgénicos dobles.

5. La utilidad de la proteína de fusión Fas-ER (G525R) se limita sólo a células que son sensibles a la vía de apoptosis extrínseca CD95, es decir, en su mayoría células del sistema inmune.

6. El sistema CID inducible en combinación con dominios de Caspasa activos se ha desarrollado para su uso in vitro y tiene limitaciones para la aplicación in vivo con respecto a la farmacología de los compuestos que inducen. El inductor FK1012 de primera generación (como un dímero de FK506; Pruschy, et al., Chem Biol, 1, 163-172 (1994)), y supuestamente también los análogos que se unen a la proteína FKPB endógena, de la que se deriva el dominio dimerizador CID, son inmunosupresores (Bierer, et al, Curr Opin Immunol, 5, 763- 773 (1993)). La farmacocinética, el metabolismo y la toxicidad de estos compuestos in vivo (p. ej. AP20187; (Chang, et al, J Biol Chem 278, 16466-16469 (2003)) no se ha caracterizado. Además, no se sabe si alguno de estos compuestos penetra la barrera sangre-cerebro de manera que la utilidad del sistema CID para su uso en el cerebro es impredecible.

En contraste con la diversidad de la aplicación de la investigación biológica y médica de los sistemas de apoptosis inducible para células de mamíferos, se han hecho esfuerzos muy limitados para optimizar las técnicas de la apoptosis inducible hacia un uso universal en mamíferos. Sistemas alternativos de inducción de la apoptosis de diferente especificidad del ligando podrían mejorar aún más la flexibilidad de la ingeniería celular y tisular in vivo.

La razón de esta situación no satisfactoria se explica fácilmente por una serie de requisitos que se deberían cumplir, al menos en parte, por un sistema universalmente útil de apoptosis inducible en mamíferos.

I) debería actuar a través de un único polipéptido que puede ser expresado a partir de un único transgen, II) debería utilizar mecanismos endógenos a la célula, III) debería poder inducir la muerte celular en al menos la mayoría de los tipos de células y órganos de mamíferos, especialmente también en las células del cerebro, IV) no debería incluir secuencias de péptidos inmunogénicos, V) debería ser inducido por compuestos que tienen mínimos efectos sobre células distintas de las células diana, y VI) debería ser inducido por compuestos que, preferentemente, se pueden aplicar también por administración oral, que sean seguros para su uso en humanos y debería actuar, preferiblemente, en todos los órganos, incluido, especialmente, el cerebro.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención era proporcionar una proteína de fusión alternativa que proporcione apoptosis inducible y que evite, preferiblemente, una o más de las limitaciones anteriores. Particularmente, el objetivo que se resolverá mediante la invención de la presente solicitud es la disponibilidad de un sistema de apoptosis inducible alternativo a los sistemas Casp-FKBP y Fas-ER, que tiene un diferente dominio de unión a ligando o un diferente dominio de inducción de apoptosis. Un sistema de apoptosis inducible alternativo de este tipo es particularmente deseable para todas aquellas aplicaciones que requieren activación universal en cualquier órgano y en cualquier tipo de célula del cuerpo del mamífero, incluido el cerebro.

Sorprendentemente, este objeto se ha resuelto mediante una proteína de fusión que comprende un dominio de Caspasa capaz de inducir apoptosis y un dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormonas, en el que el dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormona se activa después de la unión de un ligando al dominio de unión a ligando del receptor nuclear.

Dado el limitado conocimiento sobre la bioquímica de las proteínas de los receptores de esteroides y los mecanismos moleculares de la apoptosis, actualmente no es posible diseñar racionalmente proteínas de fusión que inducen apoptosis biológica activa e inducible. En concreto, no se ha descrito que una proteína tal como una Caspasa que requiere, naturalmente, el procesamiento proteolítico para desarrollar actividad enzimática o que una proteína que actúa como una proteasa pueda fusionarse con éxito con el dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormona (LBD) en una proteína de fusión inducible por ligando. En concreto, después de la fusión de un dominio de Caspasa con un receptor esteroideo LBD era impredecible si dicha proteína de fusión desarrollaba actividad biológica ya que el mecanismo molecular de activación de Caspasa es esencialmente desconocido. Para el único ejemplo descrito de la fusión de una molécula relacionada con la apoptosis, el receptor Fas, con el mutante ER(T) del LBD, es importante observar que el dominio intracitoplasmático del receptor Fas no actúa como una proteasa y se ha encontrado que una simple fusión de este dominio con ER(T) es biológicamente inactiva. La actividad biológica sólo puede ser detectada en una proteína de fusión que también incluía la región transmembrana del receptor Fas (Takebayashi, et al., Cancer Res, 56, 4164-4170 (1996)) de manera que es poco probable que esta proteína de fusión llegue a ser activada solo por disociación de la proteína de choque térmico o por dimerización inducida sino más bien por un tercer mecanismo, aún desconocido. Con respecto a las proteínas de fusión de Caspasa descritas anteriormente con uno o más dominios de dimerización (CID) derivados de FKBP se ha encontrado que la oligomerización forzada conduce a la activación de Caspasa pero el mecanismo subyacente sigue siendo desconocido. En este sistema los dominios CID se han fusionado en el extremo N-terminal de los dominios de Caspasas o Caspasa. Las proteínas de fusión con dominios dimerizadores en el extremo C-terminal de los dominios de Caspasas o Caspasa no se han descrito y se desconoce si tales moléculas desarrollarían actividad biológica. La expresión de una proteína de fusión Caspasa de nuevo diseño en células de mamífero puede ser, en general, una tarea difícil ya que puede que los dos dominios de la proteína de fusión no adquieran su conformación natural durante la traducción. Además, la estructura tridimensional de una proteína de fusión de este tipo puede ser inapropiada para la interacción de un par de dominios de Caspasa, para la actividad proteolítica de Caspasa activada o para la activación inducida por ligando de la pareja de fusión. Además, una proteína de fusión de nuevo diseño puede exhibir una corta vida media o formar agregados que conducen a su rápida degradación por la maquinaria del proteasoma, o el ARNm de la proteína de fusión exhibe una corta vida media o puede contener sitios de empalme crípticos.

Los autores de la invención podían mostrar ahora que las proteínas de fusión que comprenden un dominio de Caspasa, particularmente un dominio de Caspasa 8 o 9, y un dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormona, particularmente el receptor de estrógenos ER(T2) de mamífero mutante, expresado en las células de mamífero, inducían apoptosis en estas células después de la exposición a un ligando para ese dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormona, particularmente el ligando sintético 4-hidroxi-tamoxifeno. Se puso de manifiesto que, dentro de la proteína de fusión puede usarse Caspasa en toda su longitud o bien un fragmento de la misma funcionalmente activo.

El análisis cuantitativo de apoptosis después de la administración del ligando utilizando las células que expresan transitoriamente la proteína de fusión de la invención reveló que la muerte celular observada en combinación con la expresión de las proteínas de fusión es un efecto específico. En particular, los autores de la invención proporcionan la primera evidencia de tres proteínas de fusión Caspasa-ER(T2) muy eficientes: myrCasp8-ER(T2), Casp8-ER(T2) y Casp9full-ER(T2) (véanse los Ejemplos).

También la integración genómica estable de proteínas de fusión activas ER(T2) confirmó los resultados obtenidos para la expresión transitoria, a saber, la capacidad de la proteína de fusión para inducir muerte celular dependiente de 4-OH-tamoxifeno en células transfectadas de forma estable.

Tomados en conjunto, los autores de la invención han demostrado por primera vez que los constructos de fusión de dominios de Caspasa y dominio de unión a ligando del receptor nuclear de hormona proporcionan un sistema altamente eficiente para extirpar condicionalmente células de mamífero. Además, dado que las Caspasas, particularmente Caspasa 8 y Caspasa 9, se expresan de forma ubicua en tejidos de mamíferos y están ambas involucradas en las diferentes vías de apoptosis, la potencial aplicación universal de las fusiones del receptor nuclear de hormona con Caspasas, tal como Caspasa 8 o Caspasa 9, para la extirpación celular inducible es de relevancia comercial en biotecnología.

La presente invención es la primera divulgación de una proteína que requiere naturalmente procesamiento proteolítico para desarrollar actividad enzimática y que una proteína de fusión que comprende una proteína que actúa como una proteasa, podía fusionarse con éxito con un receptor esteroideo LBD en una proteína de fusión inducible por ligando.

Las proteínas de fusión del dominio de unión a ligando del receptor nuclear de hormona de Caspasa resultante permiten la inducción muy eficiente de activación de Caspasa que conduce a apoptosis en células de mamífero después de la administración de un ligando que se une al dominio de unión a ligando.

El sistema de apoptosis inducible mejorado de la presente invención proporciona un sistema universal de apoptosis para uso en células de mamífero y organismos que permite estudiar la función biológica de células seleccionadas o un tipo de célula en el cuerpo del mamífero y, de ese modo, la creación de una amplia gama de modelos animales de enfermedades humanas. Este sistema de apoptosis permite además eliminar las células trasplantadas que contienen un vector de expresión de proteína de fusión del cuerpo de un receptor después de la inducción o destruir las células tumorales que fueron transducidas o transfectadas con un vector de expresión de proteína de fusión.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende (a) un dominio de Caspasa capaz de inducir apoptosis y (b) un dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormona en donde el dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormona se activa después de la unión de un ligando al dominio de unión a ligando del receptor nuclear.

Por ello, la presente invención permite la muy eficiente modificación de la composición celular del cuerpo del mamífero, mediante apoptosis inducible específica del tipo de célula. Dicho proceso posee las siguientes ventajas sobre la tecnología actual: (i) la proteína de fusión Caspasa, en particular, la fusión de Caspasa-8 o -9 con el LBD ER(T2), permite inducir la actividad de Caspasa y, de ese modo, apoptosis en dependencia de los ligandos del receptor de esteroides, en particular, el 4-OH-tamoxifeno, y (ii) la proteína de fusión Caspasa, en particular, la fusión de Caspasa-8 o -9 con el LBD ER(T2), es el primer sistema de apoptosis basado en Caspasa, inducible alternativo descrito con una eficiencia comparable al sistema dimerizador FKBP para la modificación de la composición celular del cuerpo de un mamífero.

En una realización preferida de la invención, después de la exposición a un ligando del dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormona, la proteína de fusión es capaz de inducir apoptosis en una célula, preferiblemente en una célula eucariota, que expresa la proteína de fusión.

Por lo tanto, el primer componente de la proteína de fusión es un dominio de Caspasa que es cualquier dominio de Caspasa (de tipo silvestre o variante) capaz de inducir apoptosis.

Las Caspasas son componentes centrales de la maquinaria para apoptosis. La apoptosis, o muerte celular programada, desempeña una función central en el desarrollo y homeostasis de los organismos multicelulares (Jacobson, et al., Cell, 88, 347-354 (1997)). En los seres humanos, tanto la apoptosis excesiva como insuficiente puede conducir a consecuencias patológicas graves. La supresión de la maquinaria apoptótica causa enfermedades autoinmunes y es un distintivo de cáncer (Hanahan y Weinberg, Cell, 100, 57-70 (2000)) (Thompson, Science, 267, 1456-1462 (1995). Por otra parte, la sobreexpresión anormal de la apoptosis contribuye a trastornos neurológicos (Yuan y Yankner, Nature, 407, 802-809 (2000)).

Catorce Caspasas de distintos mamíferos se han identificado hasta el momento; al menos 7 de estas, a saber Caspasas 2, 3, 6, 7, 8, 9 y 10, desempeñan importantes funciones durante la apoptosis (Shi, Mol Cell, 9, 459-470 (2002)).,.

Las Caspasas involucradas en la apoptosis se dividen generalmente en dos categorías, las Caspasas iniciadoras, que incluyen sin limitación las Caspasas 1, 8, 9, y 10, y las Caspasas efectoras que incluyen sin limitación las Caspasas 3, 6, y 7.

Una Caspasa iniciadora se caracteriza, en general, por un prodominio N-terminal extendido (> 90 aminoácidos) importante para su función, mientras que una Caspasa efectora contiene 20-30 restos en su secuencia prodominio.

Las Caspasas son producidas en células como zimógenos catalíticamente inactivos y deben experimentar activación proteolítica durante la apoptosis. La activación de una Caspasa efectora (p. ej., Caspasa 3) se realiza mediante una Caspasa iniciadora (p. ej., Caspasa 8 o 9) a través de la escisión de restos de aspartato interno específicos que separan las subunidades grandes y pequeñas. Las Caspasas iniciadoras se autoactivan; como esta activación desencadena una cascada de activación de Caspasa aguas abajo, está estrechamente regulada y requiere el montaje de un complejo multicomponente denominado apoptosoma (Bao y Shi, Cell Death Differ, 14, 56-65 (2007)). Las Caspasas iniciadoras contienen uno de dos motivos de interacción proteína-proteína, la CARD (dominio de reclutamiento de Caspasa) o el DED (dominio efector de muerte). Estos motivos interactúan con motivos similares presentes en proteínas adaptadoras oligomerizadas, trayendo múltiples moléculas de Caspasa iniciadora en estrecha proximidad y facilitando su autoactivación (Shi, Mol Cell, 9, 459-470 (2002 )).

Sin embargo, los mecanismos exactos por los que las Caspasas iniciadoras son activadas por el apoptosoma continúan sin conocerse. Se han propuesto varios modelos: i) el modelo de proximidad inducida resume el proceso general de la activación de Caspasa iniciadora, ii) el modelo de dimerización impulsada por la proximidad describe cómo las Caspasas iniciadoras responden a la proximidad inducida, iii) el modelo de conformación inducida supone que la conformación activada para el sitio activo de una Caspasa iniciadora se logra mediante la interacción directa con el apoptosoma o a través de homo-oligomerización facilitada por el apoptosoma (Bao y Shi, Cell Death Differ, 14, 56-65 (2007)). La unidad de Caspasa funcional es un homodímero, comprendiendo cada monómero una subunidad grande de 20 kDa y una pequeña de 10 kDa. La homodimerización es mediada por interacciones hidrófobas, con 6 cadenas beta antiparalelas de cada subunidad catalítica formando una sola hoja beta de 12 cadenas contiguas. Varias hélices alfa y cadenas beta cortas están situadas en cualquier lado de la hoja beta central, dando lugar a un pliegue globular. Los sitios activos, formados por cuatro bucles que sobresalen del andamiaje, están situados en dos extremos opuestos de la hoja beta (Shi, Mol Cell, 9, 459-470 (2002)). Una vez activadas las Caspasas efectoras son responsables de la escisión proteolítica de un amplio espectro de dianas celulares, lo que conduce finalmente a la muerte celular.

También abarcados por la expresión “dominio de Caspasa” están variantes funcionalmente activas de un dominio de Caspasa de tipo silvestre, incluidos fragmentos de la misma. Las variantes funcionales activas se pueden obtener cambiando la secuencia del dominio de Caspasa del tipo silvestre como se define en el presente documento y se caracterizan por tener una actividad biológica similar a la presentada por el dominio de Caspasa del cual se deriva, incluida la capacidad para inducir apoptosis. La capacidad para inducir apoptosis de una variante se puede determinar, p. ej., como se describe en los Ejemplos, es decir, mediante la producción de una proteína de fusión como se describe en el Ejemplo 1, en la que la variante tiene que ser sustituida por el dominio de Caspasa, expresando la proteína de fusión y determinando apoptosis en respuesta, p. ej., a 4-OH-tamoxifeno como se describe en los Ejemplos 2 o 3.

Como alternativa, la actividad de una variante funcionalmente activa se puede determinar in vitro por la escisión de sustratos peptídicos sintéticos conjugados con cromóforos que imitan el sitio de escisión para Caspasa respectiva.

Los ensayos adecuados, que se pueden utilizar con el fin de determinar la actividad de una variante, se describen en la técnica (véase, p. ej., Kohler et al., J Immunol Methods, 265, 97-110 (2002)) (Thornberry et al., J Biol Chem, 272, 17907-11 (1997)).

La variante de una Caspasa de tipo silvestre es funcionalmente activa en el contexto de la presente invención si la actividad de los fragmentos equivale al menos a 10 %, preferiblemente al menos a 25 %, más preferiblemente al menos a 50 %, incluso más preferiblemente al menos a 70 %, todavía más preferiblemente al menos a 80 %, especialmente al menos a 90 %, particularmente al menos a 95 %, lo más preferiblemente al menos a 99 % de la actividad de Caspasa, sin alteración de la secuencia.

Una variante de las Caspasas anteriores de acuerdo con la presente invención se refiere a un mutante de Caspasa respectiva original (a saber, de tipo silvestre) que tiene una actividad de Caspasa como se definió anteriormente (p.

ej., al menos aproximadamente el 50 % de dicha Caspasa de tipo silvestre). Las variantes incluyen formas truncadas de Caspasa (como proteínas Caspasa truncadas N- o C-terminal), mutantes del tipo eliminación (donde uno o más restos o segmentos de aminoácidos que tienen más de un resto de aminoácido continuo han sido eliminados de la secuencia primaria de Caspasa de tipo silvestre), mutantes del tipo de sustitución (donde uno o más restos o segmentos de aminoácidos de la secuencia primaria de Caspasa de tipo silvestre se han sustituido por restos o segmentos de aminoácidos alternativos), o la adición de péptidos señal que alteran la localización intracelular (donde, p. ej., la secuencia señal de miristoilación GSSKSKPKDPSQR (ID de SEC Nº: 82) se han añadido al término N de Caspasa) o combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente invención el dominio de Caspasa o la variante de la misma funcionalmente activa puede ser un fragmento. El fragmento se caracteriza por derivarse de una Caspasa de origen natural como se define a continuación mediante una o más eliminaciones de aminoácidos. La eliminación o eliminaciones pueden ser de forma C-terminal, N-terminal y/o interna. Preferiblemente, el fragmento se obtiene a lo sumo por 100, más preferiblemente a lo sumo por 50, incluso más preferiblemente a lo sumo por 30, aún más preferiblemente a lo sumo por 10, lo más preferiblemente por 1, 2, 3, 4 o 5 eliminación o eliminaciones.

El fragmento funcional activo se puede caracterizar también por su homología de secuencia con el dominio de tipo silvestre. Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, el fragmento funcional activo consiste en al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, aún más preferiblemente al menos 90 %, incluso más preferiblemente al menos 95 %, lo más preferiblemente 99 % de cualquier Caspasa de origen natural, p. ej., las enumeradas anteriormente. El fragmento funcional activo como se definió anteriormente se puede derivar del péptido mediante una o más eliminaciones de aminoácidos. Las eliminaciones pueden ser de forma C-terminal, N-terminal y/o interna.

En otra realización preferida de la invención el dominio de Caspasa es una variante funcionalmente activa de una Caspasa, en donde la variante se deriva de cualquier Caspasa de origen natural, p. ej., las enumeradas anteriormente, por una o más eliminación o eliminaciones, adición o adiciones y/o sustitución o sustituciones de aminoácidos y, preferiblemente, en donde la variante tiene al menos identidad de secuencia de 50 % para un dominio Caspasa de origen natural. En una realización más preferida, la variante funcional activa tiene una identidad de secuencia de al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, aún más preferiblemente al menos 90 %, incluso más preferiblemente al menos 95 %, lo más preferiblemente 99 % para cualquier Caspasa de origen natural, p. ej., las enumeradas anteriormente.

El porcentaje de identidad de secuencia se puede determinar, p. ej., mediante la alineación de secuencias. Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se han descrito, p. ej., en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 o Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444-2448, 1988.

La herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) del NCBI (Altschul et al, J. Mol Biol 215: 403-410, 1990) está disponible de varias fuentes, incluido el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD) y en internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Las variantes de cualquier Caspasa de origen natural, p. ej., las enumeradas anteriormente, se caracterizan típicamente utilizando el Blast 2.0 del NCBI, blastp con huecos fijado para parámetros por defecto. Para las comparaciones de secuencias de aminoácidos de al menos 35 aminoácidos, la función de secuencias Blast 2 se emplea utilizando la matriz BLOSUM62 por defecto fijada para parámetros por defecto (coste de existencias de hueco de 11, y un coste de hueco por resto de 1).

Como se señaló anteriormente, la variante funcionalmente activa de una Caspasa se obtiene por alteraciones en la secuencia de Caspasa, en donde la variante retiene la función de Caspasa (véase más arriba). La expresión "variante funcionalmente activa" incluye variantes alélicas de origen natural, así como mutantes o cualquier otra variante de origen no natural.

Sin embargo, si la variante se obtiene de una Caspasa mediante una o más sustitución o sustituciones se prefiere o prefieren la sustitución o sustituciones conservadoras. Sustituciones conservadoras son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales y propiedades químicas. Ejemplos de tales familias son aminoácidos con cadenas laterales básicas, con cadenas laterales ácidas, con cadenas laterales alifáticas no polares, con cadenas laterales aromáticas no polares, con cadenas laterales polares no cargadas, con cadenas laterales pequeñas, con cadenas laterales grandes, etc. En una realización, en la variante se incluye una sustitución conservadora. En otra realización, dos sustituciones conservadoras o menos están incluidas en el péptido. En una realización adicional, tres sustituciones conservadoras o menos están incluidas en la variante.

Ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: Ala → Ser; Arg → Lys; Asn → Gln o His; Asp → Glu; Cys → Ser; Gln → Asn; Glu →Asp; His → Asn o Gln; Ile → Leu o Val; Leu → Ile o Val; Lys → Arg o Gln o Asn; Met → Leu o Ile; Phe → Met o Leu o Tyr; Ser → Thr; Thr → Ser; Trp → Tyr; Tyr → Trp o Phe; Val → Ile o Leu, en donde el aminoácido mencionado en primer lugar (antes de la flecha) indica el aminoácido original sin sustitución y el aminoácido o aminoácidos mencionado o mencionados en segundo lugar (después de la flecha) indica o indican el aminoácido que va a sustituir a los respectivos primeros aminoácidos.

En el caso de una o más adición o adiciones de aminoácidos, éstas pueden dar como resultado la clonación de Caspasa o variante de la misma funcionalmente activa, p. ej., debido a la utilización de sitios de restricción particulares, y puede que alteren o no (aumenten o disminuyan) la actividad de Caspasa. Como alternativa, los aminoácidos pueden ser añadidos con el fin de lograr un resultado deseado, p. ej., adición de una etiqueta para proporcionar la depuración conveniente.

Las proteínas Caspasa que se pueden utilizar en el dominio de Caspasa de la proteína de fusión de la presente invención incluyen, pero no se limitan a un cierto tipo de proteasas inductoras de apoptosis pertenecientes a las familias de mamíferos de Caspasas iniciadoras y efectoras (Ho y Hawkins, Febs J, 272, 5436-5453 (2005)) (Bao y Shi, Cell Death Differ, 14, 56-65 (2007)) (Shi, Mol Cell, 9, 459-470 (2002) ). Estas familias incluyen Caspasa-3 (las secuencias de aminoácidos de dicha Caspasa de murino y de humano se muestran en la ID de SEC Nº: 58 y 59, respectivamente), Caspasa-7 (las secuencias de aminoácidos de dicha Caspasa de murino y de humano se muestran en la ID de SEC Nº: 60 y 61, respectivamente), Caspasa-6 (las secuencias de aminoácidos de dicha Caspasa de murino y de humano se muestran en la ID de SEC Nº: 62 y 63, respectivamente), Caspasa-8 (las secuencias de aminoácido de dicha Caspasa de murino y de humano se muestran en la ID de SEC Nº: 64 y 65, respectivamente), Caspasa-10 (la secuencia de aminoácidos de dicha Caspasa humana se muestra en la ID de SEC Nº: 66), Caspasa-9 (las secuencias de aminoácidos de dicha Caspasa de murino y de humano se muestran en la ID de SEC Nº: 67 y 68, respectivamente), Caspasa-2 (las secuencias de aminoácidos de dicha Caspasa de murino y de humano se muestran en la ID de SEC Nº: 69 y 70, respectivamente), Caspasa-12 (la secuencia de aminoácidos de dicha Caspasa de murino se muestra en la ID de SEC Nº: 71), y similares, o mutantes de las mismas. También son aplicables otras Caspasas de vertebrados conocidas en la técnica.

Preferiblemente, en el contexto de la presente invención el dominio de Caspasa es una Caspasa o variante de la misma funcionalmente activa seleccionada del grupo que consiste en Caspasa-2, Caspasa-3, Caspasa-6, Caspasa- 7, Caspasa-8, Caspasa-9, Caspasa-10, y Caspasa-12, o variante de las mismas funcionalmente activa, lo más preferiblemente Caspasa-8 o Caspasa-9 o una variante de las mismas funcionalmente activa. Más preferiblemente, Caspasa es una Caspasa de mamífero, especialmente una Caspasa de murino o de humano, aún más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en Caspasa-2, Caspasa-3, Caspasa-6, Caspasa-7, Caspasa-8, Caspasa-9, Caspasa-10 y Caspasa-12, lo más preferiblemente Caspasa-8 o Caspasa-9, especialmente Caspasa-8 o Caspasa-9 de murino o de humano. Ejemplos preferidos de secuencias de Caspasas son las de las ID de SEC Nº: 58 a 71, especialmente los de ID de SEC Nº: 64, ID de SEC Nº: 65, ID de SEC Nº: 67 o ID de SEC Nº: 68.

En otra realización preferida de la invención el dominio de Caspasa de la proteína de fusión como se definió anteriormente comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de ID de SEC Nº: 64, ID de SEC Nº: 65, ID de SEC Nº: 67 o ID de SEC Nº: 68; o variantes, particularmente fragmentos, de las mismas funcionalmente activas.

Lo más preferiblemente, en la proteína de fusión de la invención, el dominio de Caspasa es preferiblemente una Caspasa-9 de murino que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID de SEC Nº: 67 o una forma truncada N-terminal de la misma, o una Caspasa-8 de murino que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID de SEC Nº 64 o una Caspasa-8 modificada que es fusionada con una secuencia señal de miristoilación en el término N. Formas truncadas adecuadas de Caspasa-9 comprenden restos de aminoácidos 92 a 454 de ID de SEC Nº: 67; Caspasa-8 modificada adecuada que tiene una fusión N-terminal con un péptido señal de miristoilación comprende la secuencia GSSKSKPKDPSQR (ID de SEC Nº: 82).

El segundo componente de la proteína de fusión de la invención es el dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormona (LBD) (tipo silvestre o una variante). El LBD de tipo silvestre está situado a la mitad del terminal de carboxilo del receptor, consta en general de aproximadamente 300 aminoácidos.

Debe señalarse que el dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormona (LBD) de la presente invención puede ser activado después de la unión de un ligando al LBD. De acuerdo con la presente invención, la actividad de Caspasa de la proteína de fusión en una célula es significativamente mayor en presencia de ligando en comparación con su actividad en ausencia de ligando para el LBD o variante del mismo.

Una "actividad significativamente mayor", de acuerdo con la presente invención, se refiere a un aumento en la tasa de mortalidad de al menos 25 %, preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 75, lo más preferiblemente al menos 90 %. La tasa de mortalidad se puede determinar como se detalla en el Ejemplo 2 o 3, en donde se va a utilizar la proteína de fusión respectiva en lugar de las utilizadas para los Ejemplos y el ligando va a escogerse de acuerdo con el LBD. Por ejemplo, la tasa de mortalidad se puede determinar en el plazo de 3 días en presencia del ligando, p. ej., 4-OH-Tamoxifeno en una concentración de 10-6 molar (o inferior) para un clon de células MEF5 que expresa un vector de expresión de proteína de fusión de Caspasa-ER(T2) integrada de forma estable.

Proteínas de fusión que incluyen receptores de esteroides de tipo silvestre y mutante se han generado ya para regular la actividad de la pareja de fusión mediante ligandos naturales o sintéticos (Picard, Curr Opin Biotechnol, 5, 511-515 (1994)). Se cree que las proteínas de choque térmico que están unidas al dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormona (LBD), y que se disocian después de unir el ligando, mantienen la pareja de fusión inactiva en ausencia de ligando (Picard, Curr Opin Biotechnol, 5, 511-515 (1994)). Esta inhibición puede ocurrir bien por impedimento estérico o bien por despliegue parcial de la estructura de la proteína. El mecanismo exacto de este fenómeno no se ha resuelto de tal manera que un constructo predecible de proteínas de fusión LBD inducible y reguladas no es posible (Picard, Curr Opin Biotechnol, 5, 511-515 (1994)).

Por lo tanto, la derivación de nuevas proteínas de fusión es actualmente más bien un enfoque empírico que un enfoque teórico. El único parámetro conocido que podría ser importante para la regulabilidad de una proteína de fusión es la longitud de la región de conexión entre la pareja de la fusión y el LBD (Picard, Curr Opin Biotechnol, 5, 511-515 (1994)). Si la separación es bastante larga la pareja de fusión puede estar activa incluso en ausencia de ligando, pero si la distancia es demasiado corta la actividad de la pareja de fusión puede ser suprimida completamente, incluso en presencia de ligando. Una segunda propiedad intrínseca de las proteínas de fusión LBD es la presencia de una función oculta de localización nuclear que se activa solamente después de la unión del ligando de manera que las proteínas de fusión generalmente se acumulan en el núcleo.

Además, se ha encontrado que el LBD del receptor de estrógenos de tipo silvestre forma un dímero después de la unión del ligando natural estradiol o del ligando sintético 4-OH-Tamoxifeno (Kumar y Chambon, Cell, 55, 145-156 (1988)), otros ligandos sintéticos como ICI 164384 no inducen dimerización (Fawell, et al., Cell, 60, 953-962 (1990)). El mecanismo exacto del proceso de dimerización no está caracterizado pero se han descrito mutantes puntuales que son incapaces de dimerizarse. Estas mutaciones caen en el mismo subdominio LBD que es también importante para la especificidad de la unión del ligando de manera que mutantes que exhiben propiedades de unión al ligando alteradas pueden ser también afectados por dimerización (Fawell, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 87, 6883-6887 (1990)). Para las proteínas parejas de fusión que actúan como un monómero, una dimerización forzada seria un efecto no deseado pero inevitable, sin embargo, para las proteínas de fusión inducibles descritas (véase más abajo) la dimerización no interfiere gravemente con la función de la proteína.

Las proteínas de fusión inducibles con los LBD del receptor de esteroides se han generado con los siguientes tipos funcionales de proteínas: factores de transcripción como E2F1, STAT6 y Ets (Agger, et al., Oncogene, 24, 780-789 (2005)) (Kamogawa, et al, J Immunol, 161, 1074-1077 (1998)) (Pelczar, et al., Biochem Biophys Res Commun, 239, 252-256 (1997)), proteína cinasas como Raf o Btk (Samuels, et al., Mol Cell Biol, 13, 6241-6252 (1993)) (Tomlinson, et al., BMC Immunol, 2, 4 (2001)), oncogenes como Myc o Rel (Madruga, et al., Immunobiology, 202, 394-407 (2000)) (Littlewood, et al., Nucleic Acids Res, 23, 1686-1690 (1995)), y de ADN recombinasas como Cre recombinasa (Metzger, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 92, 6991-6995 (1995)) o FLP recombinasa (Hunter, et al., Genesis, 41, 99-109 (2005)). No se ha descrito la fusión de los LBD de receptores de esteroides con proteínas que requieren procesamiento adicional para llegar a estar activas o que actúan directamente como una proteasa.

En el contexto de la presente invención se puede usar un LBD de cualquier receptor nuclear de hormona. Los receptores nucleares de hormona son una clase de moléculas de proteínas que se encuentran en el interior de las células que son responsables de la detección de la presencia de hormonas y ciertas otras moléculas. Los receptores nucleares tienen la capacidad de unirse directamente al ADN y regular la expresión de los genes adyacentes. La regulación de la expresión génica mediante receptores nucleares es dependiente del ligando. En otras palabras, los receptores nucleares normalmente sólo están activos en presencia de ligando. Más específicamente, la unión del ligando a un receptor nuclear da como resultado un cambio conformacional en el receptor que a su vez activa el receptor resultante en, p. ej., un aumento de la expresión del gen. Ejemplos de receptores nucleares de hormonas de la familia de receptores similares a los del estrógeno, que es la preferida, incluyen, sin limitación, receptor de estrógenos (receptor  de estrógeno, receptor  de estrógeno), un receptor relacionado con estrógeno, un receptor cetoesteroide tal como el receptor glucocorticoide, el receptor mineralocorticoide, el receptor de progesterona o el receptor de andrógenos. Subfamilias de receptores alternativos son los receptores similares al receptor de la hormona tiroidea, similares al receptor X retinoide, similares al IB del factor de crecimiento de los nervios, similares al factor esteroidogénico y similares al factor nuclear de células germinales.

Proteínas de fusión reguladas, se han construido en particular con el LBD del bien caracterizado receptor de estrógenos (ER), bien en su forma de tipo silvestre que responde al ligando natural estradiol o por el uso de mutantes del receptor que exhiben una unión de estradiol fuertemente disminuida, pero pueden ser activado por ligandos sintéticos como el 4-OH-Tamoxifeno. El uso de tales mutantes LBD ER puede ser de importancia para aplicaciones in vivo en mamíferos, si va a ser evitada la activación espontánea de una pareja de fusión por los estrógenos de origen natural.

El primer mutante de este tipo era un LBD ER de murino que contiene un único punto de mutación que sustituye una glicina por un resto arginina en la posición 525 del ratón o en la posición 521 análoga del receptor de estrógenos de humano (ER(T)) (Brocard, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 94, 14559-14563 (1997)) (Danielian, et al., Mol Endocrinol, 7, 232-240 (1993)). Sin embargo, en comparación con el LBD ER de tipo silvestre esta mutación también disminuye la afinidad del LBD mutante por el ligando sintético 4-OH-Tamoxifeno. Un nuevo mutante LBD ER de humano que alberga tres mutaciones puntuales (G400V/M543A/L544A, llamado ER(T2)) fue descrito por Feil (Feil, et al., Biochem Biophys Res Commun, 237, 752-757 (1997)) y se encontró en fusión con Cre recombinasa para actuar en ratones transgénicos 10 veces más sensibles a la inducción de 4-OH-Tamoxifeno en comparación con el mutante ER(T) (Indra, et al., Nucleic Acids Res, 27, 4324-4327 (1999)). Se ha demostrado que el mutante ER(T) (G525) dimeriza con el ligando 4-OH-Tamoxifeno (Danielian, et al, Mol Endocrinol, 7, 232-240 (1993)); para el triple mutante ER(T2) la dimerización no se ha caracterizado.

Aparte del receptor de estrógeno, ocasionalmente se han utilizado otros mutantes de receptor de esteroides para encontrar proteínas de fusión inducibles, es decir, un receptor de progesterona humana mutante (Wang, et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU., 91, 8180-8184 (1994)) (Kellendonk, et al., Nucleic Acids Res, 24, 1404-1411 (1996)) (Kellendonk, et al., J Mol Biol, 285, 175-182 (1999)) un receptor glucocorticoide mutante (Brocard, et al., Nucleic Acids Res, 26, 4086-4090 (1998)) y un receptor de andrógenos mutante (Kaczmarczyk y Green, Nucleic Acids Res, 31, e86 (2003)). También se describen receptores modificados en el documento US 2003/109683.

Los LBD modificados para enlazar solamente un compuesto seleccionado del grupo que consiste en ligandos no naturales, anti-hormonas y ligandos no nativos son los preferidos.

La proteína de fusión ER más frecuentemente utilizada es Cre-ER(T2) que consiste en Cre recombinasa en fusión con el LBD ER(T2) en combinación con el inductor 4-OH-Tamoxifeno para aplicación in vitro o Tamoxifeno para la aplicación in vivo. La Cre-ER(T2) se utiliza con frecuencia en ratones transgénicos como un sistema que permite la recombinación del ADN inducible in vivo. En ratones transgénicos Cre-ER(T2) de este tipo, la proteína de fusión se expresa a partir de un promotor específico del tipo de célula y permite la desactivación de un gen endógeno modificado que ha sido flanqueado con dos sitios de reconocimiento Cre (loxP). La recombinación inducible con este sistema se ha demostrado in vivo para una variedad de tipos de células y órganos periféricos (Indra, et al., Nucleic Acids Res, 27, 4324-4327 (1999)) (Kuhbandner, et al., Genesis, 28, 15-22 (2000)) (Vooijs, et al., EMBO Rep, 2, 292- 297 (2001)) (Minamino, et al., Circ Res, 88, 587-592 (2001)) (Sohal, et al., Circ Res, 89, 20-25 (2001)) (Imai, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 98, 224-228 (2001)) (Bex, et al., J Urol, 168, 2641-2644 (2002)) (Bosenberg, et al., Genesis, 44, 262-267 (2006)) (Guo et al., Genesis, 32, 8-18 (2002)) (Hayashi y Mcmahon, Dev Biol, 244, 305-318 (2002)). Importante para las aplicaciones en el sistema nervioso central es el comportamiento del sistema CreER(T2) que se ha demostrado para las neuronas y células gliales en el cerebro de ratones adultos (Weber, et al., Eur J Neurosci, 14, 1777-1783 (2001)) (Leone, et al., Mol Cell Neurosci, 22, 430-440 (2003)) (Doerflinger, et al., Genesis, 35, 63-72 (2003)) (Hirrlinger, et al., Glia, 54, 11-20 (2006)) (Mori et al., Glia, 54, 21-34 (2006)) (Zhao, et al., Genesis, 44, 364-371 (2006)). Para aplicaciones in vivo se utiliza generalmente Tamoxifeno como compuesto inductor después de administración intraperitoneal, subcutánea u oral. El tamoxifeno se metaboliza en el hígado a 4- OH-Tamoxifeno del ligando ER(T2). La farmacología de Tamoxifeno en roedores y en el hombre está bien establecida y se utiliza clínicamente para la terapia del cáncer de mama femenino (Fromson, et al., Xenobiotica, 3, 711-714 (1973)) (Fromson, et al., Xenobiotica, 3, 693-709 (1973)) (Etgen, Horm Behav, 13, 97-112 (1979)) (Furr y Jordan, Pharmacol Ther, 25, 127-205 (1984)) (Grainger y Metcalfe, Nat Med, 2, 381-385 (1996)) (Buckley y Goa, Drugs, 37, 451-490 (1989)).

Alternativos dominios de unión a ligando (LBD) de receptor nuclear que se pueden utilizar como dominio LBD de la proteína de fusión de la presente invención pertenecen a la superfamilia de las proteínas del receptor nuclear (Mangelsdorf, et al., Cell, 83, 835-839 (1995)) e incluyen, pero no se limitan a los receptores de hormonas esteroideas, receptores de la vitamina-A y de la vitamina-D y receptores retinoicos. La estructura del LBD de receptores nucleares de esteroides consiste en una disposición conservada de una serie de 11-12 hélices alfa estrechamente plegadas de una manera similar (Kumar y Thompson, Steroids, 64, 310-319 (1999)).

Preferiblemente, en el contexto de la presente invención se selecciona el receptor nuclear de hormonas del grupo que consiste en un receptor de estrógeno, un receptor de progesterona, un receptor de glucocorticoides, un receptor de andrógenos y una variante del mismo funcionalmente activa, particularmente un receptor de estrógenos o una variante del mismo funcionalmente activa como se definió anteriormente. Más preferiblemente, el receptor es un receptor nuclear de hormonas de mamíferos, especialmente un receptor nuclear de hormona humano, aún más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en un receptor de estrógenos, un receptor de progesterona, un receptor de glucocorticoides, un receptor de andrógenos y una variante funcionalmente activa de los mismos.

Ejemplos de aquellos que incluyen receptores de Estrógeno (la secuencia de aminoácidos de dicho receptor alfa de estrógeno de ratón se muestra en la ID de SEC Nº: 72, de la cual el LBD comprende los restos 355-547 y la secuencia de dicho receptor alfa de estrógeno humano se muestra en la ID de SEC Nº: 73, de la cual el LBD comprende los restos 351-543), receptores de Progesterona (la secuencia de aminoácidos de dicho receptor de progesterona de ratón se muestra en la ID de SEC Nº: 74 y la secuencia de dicho receptor de progesterona humano se muestra en la ID de SEC Nº: 75, de la cual el LBD comprende los restos 641-891 o 641-933), receptores de Glucocorticoides (la secuencia de aminoácidos de dicho receptor de glucocorticoides de murino se muestra en la ID de SEC Nº: 76, y la secuencia de dicho receptor de glucocorticoides humano se muestra en la ID de SEC Nº: 77, de la cual el LBD comprende los restos 500-777), los receptores de Andrógenos (la secuencia de aminoácidos de dicho receptor de andrógenos de murino se muestra en la ID de SEC Nº: 78, y la secuencia de dicho receptor de andrógenos humano se muestra en la ID de SEC Nº: 79), y similares, o mutantes de los mismos. También pueden aplicarse otros LBD del receptor nuclear de hormonas y del receptor de esteroides conocidos en la técnica. Sin embargo, los ejemplos preferidos de secuencias de receptor nuclear de hormonas son las de ID de SEC Nº: 72 a 80, especialmente la ID de SEC Nº: 80.

Como se detalló anteriormente, los ligandos para el LBD son necesarios con el fin de activar el LBD e inducir la apoptosis de una célula, en la que se expresa la proteína de fusión.

Los ejemplos específicos de compuestos que ligan el dominio de unión al ligando incluyen 5-alfa-pregnano-3,20- diona; 11[beta]-(4-dimetilaminofenil)-17[beta]-hidroxi-17[alfa]-ropinil-4,9-estradien-3-ona; 11[beta]-(4- dimetilaminofenil)-17[alfa]-hidroxi-17[beta]-(3-hidroxipropil)-13[alfa]metil-4,9-gonadien-3-ona; 11[beta]-(4-acetilfenil)- 17[beta]-hidroxi-17[alfa]-(1-propinil)-4,9-estradien-3-ona; 11[beta]-(4-dimetilaminofenil)-17[beta]-hidroxi-17[alfa]-(3- hidroxi-1(Z)-propenil-estra-4,9-dien-3-ona; (7[beta],11[beta],17[beta])-11-(4-dimetilaminofenil)-7-metil-4′,5′- dihidroespiro[ester-4,9-dien-17,2′(3′H)-furan]-3-ona; (11[beta],14[beta],17[alfa])-4′,5′-dihidro-11-(4-dimetilaminofenil)- [espiroestra-4,9-dien-17,2′(3′H)-furan]-3-ona; Raloxifeno, Naloxifeno, 4-OH-tamoxifeno o ICI 164384.

Particularmente para LBD mutante pueden ser utilizados los siguientes ligandos con el fin de inducir la apoptosis: ER(T2): 4-OH-Tamoxifeno, Raloxifeno, Naloxifeno Receptor de progesterona mutante: RU486 (= Mifepristona), ORG31376, ORG31806, ZK98.229, ZK98.734, ZK112.993 Receptor de glucocorticoides mutante: Dexametasona, Triamcinolona acetónido, RU38486 Receptor de andrógenos mutante: Mibolerona, OH-Flutamida También abarcados por la expresión “dominio de unión a ligando” están las variantes funcionalmente activas de LBD de tipo silvestre, incluidos los fragmentos. Variantes funcionales activas pueden obtenerse cambiando la secuencia del LBD de tipo salvaje definido en el presente documento y se caracterizan por tener una actividad biológica similar a la presentada por el LBD del que se derivan, incluida la capacidad para ser activado después de la unión de un ligando. La capacidad de ser activado puede determinarse, p. ej., como se describe en los Ejemplos, es decir, produciendo una proteína de fusión como se describe en el Ejemplo 1, en el que la variante va a sustituir al LBD, expresando la proteína de fusión y comparando la apoptosis en presencia y en ausencia de un ligando para el respectivo LBD, p. ej., 4-OH-tamoxifeno, como se describe en el Ejemplo 2 o 3. La variante de un LBD es funcionalmente activa en el contexto de la presente invención, si la actividad del fragmento equivale al menos a 10 %, preferiblemente al menos a 25 %, más preferiblemente al menos a 50 %, incluso más preferiblemente al menos a 70 %, aún más preferiblemente al menos a 80 %, especialmente al menos a 90 %, particularmente al menos a 95 %, lo más preferiblemente al menos a 99 % de la actividad del LBD sin alteración de la secuencia.

Como alternativa, puede determinarse la afinidad de unión al ligando del LBD de tipo silvestre y del LBD mutante. La afinidad de unión al ligando de estos mutantes puede determinarse por incubación del LBD con ligando marcado radiactivo a varias concentraciones en presencia o en ausencia de ligando no marcado y la medición posterior del ligando marcado unido, p. ej. como se describe por Smith y Sestili, Clin Chem 26, 543-50 (1980). Una variante funcionalmente activa del LBD anterior de acuerdo con la presente invención se refiere a un mutante del LBD original respectivo (a saber, de tipo silvestre) que tiene una afinidad de unión al ligando con el ligando natural o sintético de al menos 0,1 %, preferiblemente al menos 1 %, más preferiblemente al menos 10 % del de dicho LBD de tipo silvestre.

Las variantes incluyen formas truncadas del LBD (tal como las proteínas del LBD truncadas en el terminal N o en el C), los mutantes de tipo eliminación (donde uno o más restos o segmentos de aminoácidos que tienen más de un resto de aminoácido continuo han sido eliminados de la secuencia primaria del LBD de tipo silvestre), los mutantes de tipo de sustitución (donde uno o más restos o segmentos de aminoácidos de la secuencia primaria del LBD de tipo silvestre se han sustituido con restos o segmentos de aminoácidos alternativos), o la adición de péptidos señal que alteran la localización intracelular, o combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente invención, el LBD o la variante del mismo funcionalmente activa puede ser un fragmento. El fragmento se caracteriza por derivarse de un LBD de origen natural tal como se define a continuación mediante una o más eliminaciones de aminoácidos. La eliminación o eliminaciones pueden ser de forma C-terminal, N-terminal y/o interna. Preferiblemente, el fragmento se obtiene a lo sumo mediante 100, más preferiblemente a lo sumo mediante 50, incluso más preferiblemente a lo sumo mediante 30, aún más preferiblemente a lo sumo mediante 10, lo más preferiblemente 1, 2, 3, 4 o 5 eliminación o eliminaciones.

El fragmento funcionalmente activo puede también caracterizarse por otra similitud estructural. Por consiguiente, en una realización preferida de la invención, el fragmento funcional activo consiste en al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, aún más preferiblemente al menos 90 %, incluso más preferiblemente al menos 95 %, lo más preferiblemente 99 % de cualquier LBD de origen natural, p. ej., los enumerados anteriormente. El fragmento funcional activo como se definió anteriormente se puede derivar del péptido por una o más eliminaciones de aminoácidos. Las eliminaciones pueden ser de forma C-terminal, N-terminal y/o interna. Para las variantes de receptor de progesterona se prefieren las mutaciones terminales en C, ya que aquellas tienen más probabilidades de efectuar la reducción o eliminación de la unión al ligando.

En otra realización preferida de la invención, el LBD es una variante funcionalmente activa de un LBD, en el que la variante se deriva de cualquier LBD de origen natural, p. ej., los enumerados anteriormente, mediante una o más eliminación o eliminaciones, adición o adiciones y/o sustitución o sustituciones de aminoácidos y preferiblemente en el que la variante tiene al menos 50 % de identidad de secuencia con un LBD de origen natural. En una realización más preferida, la variante funcional activa tiene una identidad de secuencia de al menos 60 %, preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, aún más preferiblemente al menos 90 %, incluso más preferiblemente al menos 95 %, lo más preferiblemente 99 % con cualquier LBD de origen natural, p. ej., aquellos enumerados anteriormente.

El porcentaje de identidad de secuencia se puede determinar como se ha descrito anteriormente en relación con la variante de una Caspasa.

Como se señaló anteriormente, la variante funcionalmente activa de un LBD se obtiene por alteraciones de la secuencia en la secuencia del LBD, en donde la variante retiene la función del LBD (véase más arriba). La expresión "variante funcionalmente activa" incluye variantes alélicas de origen natural, así como mutantes o cualquier otra variante de origen no natural.

Sin embargo, si la variante se obtiene de un LBD mediante una o más sustitución o sustituciones se prefieren la sustitución o sustituciones conservadoras. Las sustituciones conservadoras son como las detalladas anteriormente.

En el caso de una o más adición o adiciones de aminoácidos, éstos pueden dar como resultado la clonación del LBD o de la variante funcionalmente activa del mismo, p. ej., debido al uso de un sitio de restricción particular, y pueden o no alterar (aumentando o disminuyendo) la actividad del LBD. Como alternativa, los aminoácidos pueden ser añadidos con el fin de lograr un resultado deseado, p. ej., adición de una etiqueta para proporcionar la depuración conveniente.

Como se ha detallado anteriormente, particularmente para mutantes receptores de la aplicación in vivo se prefiere que no puedan ser activados por el ligando de origen natural respectivo con el fin de evitar la inducción de apoptosis después de la presencia del ligando en el cuerpo del animal respectivo. De acuerdo con esto, en el contexto de la presente invención se prefieren los mutantes anteriormente especificados. En particular, se prefieren los receptores de estrógenos con mutación en un solo punto que sustituyen una glicina por un resto de arginina en la posición 525 del ratón o en la posición 521 análoga del receptor de estrógenos humano (ER(T)) o con tres puntos de mutación (G400V/M543A/L544A, nombrados ER(T2)). Las alternativas son el receptor de progesterona humana mutante especificado anteriormente, el receptor de glucocorticoides mutante y un receptor de andrógenos mutante, así como cualquier otro receptor nuclear de hormonas mutante conocido por la persona experta.

En una realización muy preferida de la invención, la variante funcionalmente activa del receptor nuclear de hormonas es el LBD del ER(T2) mutante del receptor de estrógenos humano (restos 282-595 del receptor de estrógenos humanos según lo publicado en: Feil, et al, Biochem Biophys Res Commun, 237, 752-757 (1997)) con intercambios en los aminoácidos de glicina por valina en la posición 400 (G400V), a partir de metionina por alanina en la posición 543 (M543A), de leucina por alanina en la posición 544 y que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID de SEC Nº: 80.

Los ligandos preferidos para la activación del LBD mutante ER(T2) son antiestrógenos no esteroideos, el ligando más preferido es 4-OH-Tamoxifeno (nombre químico: [trans-1-(4β-dimetilaminoetoxifenil)-1,2-difenilbut-1-eno]). Como alternativa, puede utilizarse el ICI 164384.

Dentro de la proteína de fusión, el dominio de unión a ligando del receptor nuclear de hormonas puede estar unido con el terminal en N o el terminal en C del dominio de Caspasa; sin embargo, preferiblemente el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas está vinculado al terminal en C del dominio de Caspasa. El dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas puede ligarse bien directamente al dominio de Caspasa o bien mediante un enlazador. Preferiblemente, el enlazador está compuesto de aminoácidos.

En una realización de la invención, el enlazador consta de 1 a 100 restos de aminoácidos, preferiblemente de 1 a 40 aminoácidos, más preferiblemente 1 a 10 aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 aminoácidos. Especialmente, el enlazador consiste esencialmente en aminoácidos neutros. Un enlazador ejemplar está compuesto de glicina, alanina y/o valina o particularmente consiste en la secuencia Ala-Asp-Gln (como se muestra en la ID de SEC Nº: 20).

Un enlazador alternativo comprende una parte de las secuencias de dominio D y F del receptor nuclear de hormonas que flanquean el dominio de unión al ligando (Metzger, et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU., 92, 6991-6995 (1995)).

Además de los componentes enumerados y especificados anteriormente, la proteína de fusión puede comprender componentes adicionales tales como una secuencia señal de miristoilación tal como GSSKSKPKDPSQR (ID de SEC Nº: 82), una señal de direccionamiento subcelular como una secuencia nuclear de localización o cualquier otra secuencia adecuada, tal como una etiqueta, p. ej., para depuración. Otras secuencias adecuadas son conocidas por las personas expertas y están dentro del conocimiento de la persona con experiencia seleccionar y combinar secuencias adicionales con los componentes de la proteína de fusión definida anteriormente.

Las miristoilación es una modificación irreversible de proteínas postraduccional encontrada en animales, plantas, hongos y virus. En esta modificación de la proteína un grupo miristoílo (derivado de ácido mirístico) se une, de forma covalente, mediante un enlace amida al grupo alfa-amino de un resto de glicina N-terminal de un polipéptido naciente. La modificación es catalizada por la enzima N-miristoil-transferasa, y se produce más comúnmente en restos de glicina expuestos durante la eliminación de la metionina N-terminal co-transduccional. La miristoilación desempeña una función vital en la localización de la membrana y en la transducción de señal en las respuestas de las plantas al estrés ambiental. Una secuencia señal de miristoilación puede incluirse con el fin de aumentar la concentración local de la proteína de fusión en membranas que podrían conducir a una más rápida y más eficiente inducción de la apoptosis.

Una secuencia señal de localización nuclear proporciona el transporte activo en el núcleo de las células eucariotas.

Un dominio de péptido señal de este tipo tiene preferiblemente una longitud de 5 a 74, preferiblemente de 7 a 15 restos de aminoácidos. Más preferiblemente, el dominio del péptido señal comprende un segmento de 6 restos de aminoácido en donde al menos 2 restos de aminoácido, preferiblemente 3 restos de aminoácido son aminoácidos básicos cargados positivamente. Los aminoácidos básicos incluyen, pero no se limitan a lisina, arginina e histidina.

Proteínas de fusión muy preferidas de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de una proteína CASP8-ER(T2) mostrada en la ID de SEC Nº: 20 y una proteína myrCASP8-ER(T2) mostrada en la ID de SEC Nº: 23 (secuencia de ADN adecuada codificante de dichas proteínas de fusión que se muestran en la ID de SEC Nº: 19 y 22, respectivamente), y la secuencia de aminoácidos de una proteína CASP9full-ER(T2) mostrada en la ID de SEC Nº 29 y una proteína CASP9trunc-ER(T2) mostrada en la ID de SEC Nº: 32 (una secuencia de ADN adecuada codificante de dicha proteína de fusión que se muestra en la ID de SEC Nº: 28 y 31, respectivamente), y la secuencia de aminoácidos de una proteína CASP3-ER(T2) mostrada en la ID de SEC Nº: 37 (una secuencia de ADN adecuada codificante de dicha proteína de fusión que se muestra en la ID de SEC Nº: 36).

Las proteínas de fusión más preferidas consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la ID de SEC Nº: 20, ID de SEC Nº: 23, ID de SEC Nº: 29, ID de SEC Nº: 32 o ID de SEC Nº: 37. Proteínas de fusión especialmente preferidas consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la ID de SEC Nº: 20, ID de SEC Nº: 23, ID de SEC Nº: 29, ID de SEC Nº: 32 o ID de SEC Nº: 37.

Un objeto adicional de la invención se refiere a un ácido nucleico codificante de la proteína de fusión de la invención, en donde el ácido nucleico puede estar comprendido en un vector. La expresión ácido nucleico incluye ADN y ARN, tales como ADN genómico, ADNc y ARNm, o combinaciones de los mismos. El ácido nucleico puede comprender, además de la secuencia codificante de la proteína de fusión, secuencias adicionales, p. ej., requeridas para la transcripción y/o traducción del ácido nucleico codificante de la proteína de fusión. Esto puede incluir un promotor, un potenciador, secuencias de transcripción y/o de iniciación o terminación de la traducción, marcadores de selección, secuencias que protegen o dirigen el ARN o la proteína de fusión dentro de la célula. La selección y combinación de estas secuencias está dentro del conocimiento de la persona con experiencia en la técnica y se pueden seleccionar de acuerdo con la célula, el ácido nucleico o la proteína de fusión para la que se destina. Las secuencias de ácidos nucleicos preferidas están identificadas en las ID de SEC Nº: 18, 21, 27, 30 y 35.

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a un constructo comprendido de material genético diseñado para la transformación directa de una célula diana. Un vector contiene múltiples elementos genéticos orientados posicionalmente y secuencialmente con otros elementos necesarios tal que el ácido nucleico en una casete de ácido nucleico pueda ser transcrito y, cuando sea necesario, traducido en las células transfectadas. El término vector como se utiliza en el presente documento puede referirse a ácido nucleico, p. ej., ADN derivado de un plásmido, cósmido, fagémido o bacteriófago, en el que uno o más fragmentos de ácido nucleico pueden ser insertados o clonados los cuales codifican las proteínas particulares. El término "plásmido" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un constructo comprendido de material genético extracromosómico, por lo general de un dúplex circular de ADN que puede replicarse de forma independiente de ADN cromosómico. El plásmido no se replica necesariamente.

El vector puede contener uno o más sitios de restricción únicos, y puede poder replicación autónoma en un anfitrión u organismo definido de tal manera que se reproduzca la secuencia clonada. La molécula vector puede conferir algún fenotipo bien definido al organismo anfitrión, que es bien seleccionable o bien fácilmente detectado. El vector puede tener una configuración lineal o circular. Los componentes de un vector pueden contener, pero no se limitan a una molécula de ADN que incorpora: (1) ADN; (2) una secuencia codificante de la proteína de fusión de la invención; y (3) elementos reguladores para transcripción, traducción, procesamiento del ARN, estabilidad del ARN, y replicación.

El propósito del vector es proporcionar la expresión de una secuencia de ácido nucleico en células o tejido. La expresión incluye la transcripción eficiente de un gen o secuencia de ácido nucleico insertados. Los productos de expresión pueden ser proteínas, polipéptidos o ARN. La secuencia de ácido nucleico puede estar contenida en una casete de ácido nucleico. La expresión del ácido nucleico puede ser continua, constitutiva o regulada. El vector puede también utilizarse como un elemento procariota para replicación del plásmido en bacterias y selección para el mantenimiento del plásmido en bacterias.

En una realización, el vector comprende los siguientes elementos unidos secuencialmente a una distancia apropiada para permitir la expresión funcional: un promotor, una secuencia líder 5' de ARNm, un sitio de iniciación de la traducción, una casete de ácido nucleico que contiene la secuencia de la proteína de fusión que va a ser expresada, una región no traducida 3' del ARNm, y una secuencia señal de poliadenilación. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "vector de expresión" se refiere a un vector de ADN que contiene toda la información necesaria para producir una proteína recombinante en una célula heteróloga.

Además, el término "vector" como se usa en el presente documento puede incluir también vectores virales. Un "vector viral" en este sentido es aquel que se incorpora físicamente en una partícula viral mediante la inclusión de una parte de un genoma viral dentro del vector, p. ej., una señal de empaquetamiento, y no sea simplemente ADN o un gen localizado tomado de una parte de un ácido nucleico viral. Así, mientras que una parte de un genoma viral puede estar presente en un vector de la presente invención, esa parte no causa la incorporación del vector en una partícula viral y, por ello, es incapaz de producir una partícula viral infecciosa.

Un vector tal como se utiliza en el presente documento puede incluir también elementos de secuencias de ADN que permiten la replicación extracromosómica (episomal) del ADN. Los vectores capaces de replicación episomal se mantienen como moléculas extra-cromosómicas y pueden replicarse. Estos vectores no son eliminados por simple degradación sino que continúan siendo copiados. Estos elementos se pueden derivar de un genoma viral o de mamífero. Estos proporcionan expresión prolongada o "persistente".

Ejemplos de vectores son pCAG (véanse los Ejemplos), pBR322, la serie pUC, pBluescript, pTZ, pSP y pGEM. Los componentes del ácido nucleico o del vector se seleccionan de tal manera que el ácido nucleico es expresado y la proteína de fusión es producida por la célula diana.

Otro objeto de la invención se refiere a una célula que comprende el ácido nucleico y/o el vector de la presente invención.

"Células" y "células eucariotas" de acuerdo con la presente invención incluyen células aisladas del organismo vivo definido a continuación y cultivadas in vitro. Estas células pueden ser transformadas (inmortalizadas) o no transformada (directamente derivadas del organismo vivo; cultivo de células primario).

"Microorganismo" de acuerdo con la presente invención se refiere a microorganismos procariotas (p. ej., E. Coli) y eucariotas (p. ej., levaduras).

Los "organismos" de acuerdo con la presente invención son organismos multicelulares y pueden ser vertebrados tales como los mamíferos (seres humanos y animales no humanos que incluyen roedores tales como ratones o ratas) o no mamíferos (p. ej., peces), o pueden ser invertebrados tales como insectos o gusanos, o pueden ser vegetales (plantas superiores, algas u hongos). Los organismos vivos más preferidos son los ratones y los seres humanos.

El término "mamífero" como se usa en el contexto de la presente invención incluye los mamíferos no humanos y los seres humanos.

La célula puede ser cualquier célula adecuada, especialmente una célula eucariota, p. ej., una célula fúngica, vegetal o animal. También se incluyen líneas celulares de estas células. Preferiblemente, es una célula de mamífero, especialmente una célula o línea celular de murino o de humano. Ejemplos de tales células de mamífero son las células HEK 293, células CHO, células HeLa, células CaCo, células NIH 3T3 o línea celular MEF5/N9 de fibroblasto embrionario de ratón (véanse los Ejemplos). Ejemplos de células de insectos son las células SF9, de drosofila, de mariposa y de abeja. La célula puede ser también una línea celular, que sea particularmente útil para el estudio de la apoptosis o la identificación de ligando para el LBD. La presente invención también proporciona líneas celulares estables transformadas con los plásmidos de la presente invención.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para producir la proteína de fusión de la invención que comprende - cultivar la célula de la invención como se definió anteriormente que comprende el ácido nucleico y/o el vector de la presente invención bajo condiciones propicias para la producción de la proteína de fusión.

Una célula de la invención definida anteriormente que comprende el ácido nucleico y/o el vector de la presente invención y que ha sido obtenida a partir de una línea celular que expresa de forma estable la proteína de fusión de la invención o por transfección o por transformación como se definió anteriormente, puede ser cultivada y propagada en cultivo celular.

Las células que se cultivan directamente a partir de un animal o persona se conocen como células primarias. Con la excepción de algunas derivadas de tumores, los cultivos celulares más primarios tienen una limitada vida útil.

Después de un cierto número de duplicaciones de la población las células experimentan el proceso de la senectud y dejan de dividirse, aunque en general conservan la viabilidad.

Una línea celular establecida o inmortalizada ha adquirido la capacidad de proliferarse indefinidamente bien a través de mutación al azar o bien por modificación deliberada, tal como la expresión artificial del gen de la telomerasa. Hay numerosas líneas celulares bien establecidas representativas de tipos de células particulares y está dentro del conocimiento de la persona con experiencia para seleccionar una línea celular adecuada.

Para el cultivo, las células se cultivan y se mantienen a una temperatura y mezcla gaseosa adecuadas (típicamente, 37 ºC, 5 % de CO2) en una incubadora celular. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo de célula, y la variación de las condiciones para un tipo de célula particular puede dar como resultado diferentes fenotipos que se expresan. Aparte de la temperatura y de la mezcla gaseosa, el factor más habitualmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para medios de crecimiento pueden variar en el pH, la concentración de glucosa, factores de crecimiento, y la presencia de otros componentes nutrientes. Al medio de crecimiento también pueden añadirse antibióticos. Entre las manipulaciones comunes llevadas a cabo sobre las células en cultivo están los cambios del medio y el pase de las células. Sin embargo, la selección de condiciones adecuadas es conocida por la persona experta. Sin embargo, para producir la proteína de fusión el cultivo se lleva a cabo, preferiblemente, en ausencia de un ligando para el LBD, que induciría la apoptosis de las células y, por lo tanto, sería contraproducente.

Si es necesario, la proteína de fusión se puede aislar también de las células. Si una cantidad suficiente de la proteína de fusión ha sido secretada en el medio (p. ej., debido a secuencias de señal secretoras adecuadas), ésta se puede separar de las células, p. ej., eliminando el medio sobrenadante. De lo contrario, puede ser necesario romper las células. Esto se puede efectuar, p. ej., mediante lisis de las células, p. ej., por medio de ultrasonidos o medio hipotónico. Para eliminar los componentes insolubles, la muestra obtenida puede, por ejemplo ser centrifugada, especialmente de 10.000 · g a 15.000 · g, y se puede utilizar el sobrenadante obtenido.

Todavía otro objeto de la invención se refiere a un organismo transgénico no humano, preferiblemente un mamífero transgénico no humano, que contiene el ácido nucleico y/o el vector de la presente invención.

En general, los animales transgénicos no humanos de la invención exhiben una expresión de la proteína de fusión de la invención, opcionalmente específicamente tejido, p. ej., mediante el uso de un promotor específico para tejido; por lo tanto, son muy adecuados, por ejemplo, para estudiar la función de una célula, tejido y/u órgano, p. ej., en varias etapas de desarrollo. Se da preferencia a la utilización de ratones transgénicos. Otros ejemplos de un mamífero no humano de acuerdo con la invención es una rata, una cobaya, un conejo, una vaca, una cabra, una oveja, un caballo, un cerdo, un perro, un gato o un mono.

El animal no humano transgénico puede ser producido por una serie de técnicas conocidas por la persona experta. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender las siguientes etapas: a. introducir, en al menos un ovocito, una célula madre, una célula precursora y/o una célula inmortalizada de un mamífero no humano, por una parte al menos un ácido nucleico codificante de una proteína de fusión y/o al menos un vector que contiene al menos uno de dichos ácidos nucleicos, con la proteína de fusión de la invención, y, opcionalmente, por otro lado, al menos un gen marcador de transfección adecuado, b. seleccionar la célula transfectada de la etapa a., c. introducir la célula que ha sido seleccionada de acuerdo con la etapa b. en al menos un blastocisto de mamífero no humano, d. introducir el blastocisto de la etapa c. en una madre adoptiva mamífero no humana, preferiblemente pseudoembarazada, y e. identificar el mamífero no humano transgénico que se ha desarrollado a partir de dicho blastocisto.

Los procedimientos para la introducción de blastocistos son conocidos por la persona experta. El blastocisto puede, por ejemplo, ser introducido por inyección (Hogan, B., Beddington, R., Constantini, F. y Lacy, E., A laboratory Manual (1994), Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Un mamífero no humano transgénico puede ser identificado, por ejemplo, por extracción del ADN genómico del mamífero no humano transgénico, por ejemplo de la cola de un ratón. En una PCR posterior (reacción en cadena de la polimerasa), se hace uso de cebadores que reconocen específicamente el transgen para el ácido nucleico de acuerdo con la invención. De esta manera se puede detectar la integración del transgen.

Otra posibilidad de efectuar la identificación es por medio de inmunotransferencia Southern. En este procedimiento, el ADN genómico se transfiere a una membrana y se detecta utilizando sondas de ADN, por ejemplo, sondas de ADN marcadas radiactivamente, que son específicas para el transgen codiciado.

Los procedimientos para producir un mamífero no humano transgénico de acuerdo con la invención por medio de la regeneración de una célula madre no humana, ovocito, célula precursora o célula inmortalizada para dar un animal no humano transgénico, en particular ratones transgénicos, son conocidos por la persona con experiencia a partir del documento DE 196 25 049 y las patentes de EE.UU. US 4.736.866; US 5.625.122; US 5.698.765; US 5.583.278 y US 5.750.825, y abarca animales transgénicos que se pueden producir, por ejemplo, inyectando directamente vectores de expresión de acuerdo con la invención en embriones o espermatocitos o por transfección de vectores de expresión en células madre embrionarias (Polites y Pinkert: DNA Mykroinjection and Transgenic Animal Production, páginas 15-68 en Pinkert, 1994: Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press, San Diego, USA; Houdebine 1997, Harwood Academic Publishers, Amsterdam, Países Bajos; Doetschman: Gene Transfer in Embryonic Stem Cells, páginas 115-146 en Pinkert, 1994, véase más arriba; Wood: Retrovirus-Mediated Gene Transfer, páginas 147-176 en Pinkert, 1994, véase más arriba; Monastersky: Gene Transfer Technology: Alternative Techniques and Applications, páginas 177-220 en Pinkert, 1994, véase más arriba).

Un mamífero no humano transgénico de acuerdo con la invención se puede preparar también inyectando directamente un ácido nucleico de acuerdo con la invención en el pronúcleo de un mamífero no humano.

Un gran número de procedimientos para la preparación de animales transgénicos no humanos, en particular ratones transgénicos, son también conocidos por la persona con experiencia a partir de, entre otros, los documentos WO 98/36052, WO 01/32855, DE 196 25 049, US 4.736.866, US 5.625.122, US 5.698.765, US 5.583.278 y US 5.750.825 y abarcan animales transgénicos que se pueden obtener, por ejemplo, inyectando directamente vectores de acuerdo con la invención en embriones o espermatocitos o transfectando vectores o ácidos nucleicos en células madre embrionarias (Polites y Pinkert, en Pinkert, (1994) Transgenic animal technology, A Laboratory Handbook, Academic Press, Londres, Reino Unido, páginas 15-68; Doetschmann, en Pinkert, 1994, véase más arriba, páginas 115 a 146).

Un objeto adicional de la invención se refiere al uso de la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de la invención para la inducción mediada por ligando de la apoptosis de una célula, preferiblemente de una célula eucariota, más preferiblemente de una célula de mamífero, especialmente de una célula humana. En los sistemas de patentes que no permiten las reivindicaciones dirigidas a procedimientos terapéuticos y/o diagnósticos del cuerpo humano o del animal, estos procedimientos terapéuticos y/o diagnósticos están excluidos; sin embargo, se incluyen p. ej., procedimientos de investigación. La proteína de fusión, p. ej., puede ser utilizada para estudiar la función de una célula, tejido y/u órgano. También el organismo no humano transgénico de acuerdo con la invención puede utilizarse para estudiar la función de una célula en varias etapas de su desarrollo o como un modelo de enfermedad.

El sistema de apoptosis inducible de la invención proporciona un sistema de extirpación de células universal para uso en células de mamíferos y organismos que permite estudiar la función biológica de células seleccionadas o un tipo de célula en el cuerpo de los mamíferos y, de ese modo, la creación de una amplia gama de modelos animales de enfermedades humanas. Tal sistema de apoptosis inducible es particularmente deseable para todas aquellas aplicaciones que requieren su activación universal en cualquier órgano y cualquier tipo de célula del cuerpo de los mamíferos, incluyendo el cerebro. Debe señalarse que el animal transgénico no humano se puede usar para estudiar la función de las células, p. ej. en ratones, mediante apoptosis inducible. Con esta finalidad, la región codificante de las proteínas de fusión de la invención se puede combinar con secuencias adecuadas como se detalló anteriormente, por ejemplo, una región de promotor específico de un tipo de célula, y el transgen de la proteína de fusión se insertará en la línea germinal de ratón mediante inyección pronuclear u otros procedimientos conocidos en la técnica. La administración de ligando que activa la actividad de Caspasa de la proteína de fusión conduce a la extirpación total o parcial de las células diana seleccionadas en ratones transgénicos con proteína de fusión en cualquier etapa ontogénica elegida. La muerte celular restringida temporal y/o espacial especificada previamente es de uso particular para modelar enfermedades neurodegenerativas en ratones y desarrollar terapias modelo que compensen la pérdida de funciones celulares a través de la regeneración mejorada o a través de la transferencia celular. Como alternativa a la utilización de ratones transgénicos de la línea germinal, la región codificante de la proteína de fusión se puede combinar con una región de promotor activo específico o ubicua del tipo de célula e insertada en el genoma de un vector viral que se utiliza para transducir la unidad de expresión de la proteína de fusión localmente en tejidos somáticos de ratones juveniles o adultos embrionarios.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir la apoptosis de una célula que expresa una proteína de fusión de acuerdo con la invención, comprendiendo el procedimiento - poner en contacto el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas de la célula con un ligando capaz de inducir la apoptosis de la célula.

Particularmente, el procedimiento se puede utilizar para tratar un paciente como se describe a continuación. Como alternativa, el procedimiento puede ser un procedimiento in vitro, lo que permite estudiar la apoptosis en una célula, identificando nuevos ligandos para el LBD, etc., como se describe dentro de la presente descripción de la invención.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento para identificar un ligando para un dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormonas o una variante del mismo funcionalmente activa, comprendiendo el procedimiento - poner en contacto el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas de la célula de acuerdo con la invención con una sustancia; e - identificar la sustancia como un ligando, en función de su capacidad para inducir la apoptosis de la célula En otra aplicación del sistema de apoptosis inducible de la invención nos permite además identificar un ligando para un LBD. Las sustancias que se consideran potenciales agonistas o antagonistas de un LBD pueden ser evaluadas por sustancias que inhiben o inducen la actividad de Caspasa utilizando células de acuerdo con la invención. Las células que expresan la proteína de fusión de la invención pueden ser cultivadas en presencia de una sustancia. Si las sustancias inducían apoptosis, se identifica como un ligando agonista del respectivo LBD de la proteína de fusión.

Se evalúa por un ligando antagonista del LBD, la sustancia es probada en presencia de un ligando agonista para el LBD. Si la sustancia es capaz de inhibir la apoptosis inducida por el ligando agonista (es decir, un ligando capaz de inducir la apoptosis de una célula después de la unión al LBD de una proteína de fusión de la invención), es identificado como ligando antagonista. Los ligandos, en particular, los ligandos agonistas, se pueden elegir de acuerdo con la descripción anterior. La selección de condiciones adecuadas para los procedimientos para identificar un ligando están dentro del conocimiento de la persona con experiencia y/o pueden elegirse de acuerdo con los Ejemplos 2 y 3.

Además, la eficacia in vivo de tales compuestos se puede evaluar en ratones transgénicos de la invención que expresan la proteína de fusión de la invención después de la coadministración de una sustancia de ensayo y opcionalmente un ligando agonista.

Todavía otro objeto de la invención se refiere a un medicamento que comprende una proteína de fusión de acuerdo con la invención, un ácido nucleico de acuerdo con la invención, un vector de acuerdo con la invención y/o una célula de acuerdo con la invención.

El medicamento de la invención puede usarse para el tratamiento de una enfermedad que requiere el aumento de la apoptosis, particularmente para el tratamiento del cáncer o para o después de un trasplante, particularmente, como mecanismo de seguridad.

El sistema de apoptosis inducible de la invención permite adicionalmente células específicamente de extirpación tal como las células cancerosas o las células trasplantadas que contienen una proteína de fusión, ácido nucleico o vector de la invención del cuerpo de un receptor mediante la administración de un ligando que activa la proteína de fusión.

Con esta finalidad, la totalidad o una población seleccionada de células que son transferidas a un receptor con fines terapéuticos (p. ej., trasplante de médula ósea, neuronas o queratinocitos cultivados en cultivos in vitro) puede, por ejemplo, ser transducida con un vector de expresión de proteína de fusión viral u otros procedimientos conocidos en la técnica. En este contexto, la proteína de fusión de la invención puede utilizarse como un mecanismo de seguridad en caso de que las células trasplantadas o su progenie enhebren al receptor mediante, p. ej., tumorigénesis o una reacción de injerto contra anfitrión.

En otra aplicación, el sistema de apoptosis inducible de la invención permite adicionalmente destruir las células tumorales mediante terapia génica suicida, p. ej., después de la transducción o transfección de estas células con un vector de expresión de proteína de fusión y administración de ligando.

El medicamento de la presente invención puede abarcar soportes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los soportes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables útiles en esta invención son convencionales y pueden incluir tampones, estabilizadores, diluyentes, conservantes y solubilizantes. Remington’s Pharmaceutical Sciences, mediante E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA., 15ª edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de los (poli)péptidos descritos en el presente documento. En general, la naturaleza del soporte o excipiente dependerá del modo particular de administración que es empleado. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tal como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehiculo. Para las composiciones sólidas (p. ej., en forma de polvo, píldora, comprimido o cápsulas), los soportes sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los soportes biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes amortiguadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

También son abarcados por la presente invención los procedimientos para tratar o impedir las enfermedades especificadas en el presente documento mediante la administración a un paciente de una cantidad eficaz de una proteína de fusión de la invención, un ácido nucleico codificante de la invención, un vector que comprende el ácido nucleico y/o una célula de la invención.

El medicamento se puede administrar a un sujeto que lo necesite, preferiblemente mamíferos, y aún más preferiblemente seres humanos, de cualquier manera convencional, incluida la vía oral, intranasal, intramuscular, nodo intra-linfático, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, y combinaciones de las mismas, pero lo más preferiblemente a través de la administración local, tal como inyección local.

Las composiciones y procedimientos de distribución del ácido nucleico son conocidas por los expertos en la técnica. El ácido nucleico de la invención se puede emplear en los procedimientos de esta invención o en las composiciones descritas en el presente documento como secuencias de ADN, bien administradas como ADN sin sistema inmune, asociadas con un soporte farmacéuticamente aceptable o comprendidas en un vector. El nucleico se puede administrar terapéuticamente o como un mecanismo de seguridad p. ej., por inyección.

Una "cantidad eficaz" de un medicamento se puede calcular como esa cantidad capaz de exhibir un efecto in vivo, p. ej., impedir o mejorar una señal o síntomas. Tales cantidades pueden ser determinadas por un experto en la técnica. Preferiblemente, una composición de este tipo es administrada directamente al sitio destinado de la acción, p. ej., directamente en un tumor. Sin embargo, también se puede formular para ser administrada por cualquier otra vía adecuada. La selección de la vía de administración y dosificación de tales composiciones terapéuticas están dentro de la experiencia de la técnica.

El tratamiento en el contexto de la presente invención se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es impedir o ralentizar (reducir) el estado o trastorno patológico específico. Los que necesitan el tratamiento incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que el trastorno va a ser evitado.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes Figuras y Ejemplos.

Figuras

La Fig. 1 muestra vectores de expresión de las proteínas de fusión del ER(T2) del dominio de unión a ligando del receptor de Estrógeno mutante con Caspasa-8, -9, -3, Bax, Fas o Cre recombinasa y el vector reportero - galactosidasa (utilizado para transfecciones transitorias y el vector resistente a la higromicina utilizado para transfecciones estables.

A-D: Vectores de expresión de mamíferos para proteínas de fusión ER(T2) que contienen el promotor CAG, la región codificante de la proteína de fusión a ensayar, y una secuencia señal de poliadenilación (pA) bovina.

A: pCAG-Casp8-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 1,74 kb para una fusión N-terminal de dominio de Caspasa-8 de murino con el dominio de unión al ligando ER(T2). El pCAG-myrCasp8-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 1,78 kb para una fusión N-terminal del dominio de Caspasa-8 de murino, fusionada con un motivo de secuencia N-terminal codificante de la miristoilación, con el dominio de unión al ligando ER(T2).

B: pCAG-Casp9full-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 2,32 kb para una fusión N-terminal de la longitud total de la proteína Caspasa-9 de murino con el dominio de unión al ligando ER(T2). El pCAG- Casp9trunc-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 2,04 kb para una fusión N-terminal de proteína Caspasa-9 de murino truncada sin el dominio CARD con el dominio de unión al ligando ER(T2).

C: pCAG-Casp3-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 1,79 kb para una fusión N-terminal de la longitud total de la proteína Caspasa-3 de murino con el dominio de unión al ligando ER(T2). El pCAG-Casp3- ED4ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 1,71 kb para una fusión N-terminal de la longitud total de la proteína Caspasa-3 de murino con el dominio de unión al ligando ER(T2) modificado con el término N acortado.

D: pCAG-Bax-ER(T2)-pA, pCAG-ER(T2)-Bax-pA que contiene la región codificante de 1,53 kb para una fusión N-terminal de la longitud completa de la proteína Bax de murino y la región codificante de 1,45 kb para una fusión C-terminal de Bax con el dominio de unión al ligando ER(T2).

E: pCAG-Cre-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 1,98 kb para una fusión N-terminal de Cre recombinasa con el dominio de unión al ligando ER(T2), utilizado como control negativo.

F: pCAG-HA-Fas-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 1,5 kb para la fusión N-terminal de la transmembrana y el dominio intracelular de Fas de murino con el dominio de unión al ligando ER(T2). Un epítopo de la hemaglutinina (HA) era fusionado de forma N-terminal con Fas. El pCAG-MFas-ER(T2)-pA que contiene la región codificante de 1,53 kb para la fusión N-terminal de la transmembrana y el dominio intracelular de Fas de murino con el dominio de unión al ligando ER(T2). Esta variante de fusión Fas-ER(T2) contiene un péptido señal N-terminal para la localización de la membrana de la célula.

Estos constructos se planificaron para ser utilizados como un control positivo.

G: pCMV-β-gal-pA que contiene el gen reportero β-galactosidasa bajo el control del promotor CMV.

H: pPgk-hygro-pA que contiene el gen resistente a la higromicina bajo el control del promotor PGK.

La Fig. 2 muestra los resultados de transfecciones transitorias de vectores de expresión para proteínas de fusión ER(T2) con Caspasa-8, -9, -3, Bax, Fas o Cre en células MEF5/N9.

Todas las cotransfecciones se realizaron con una cantidad fija de plásmido reportero pCMV-β-gal-pA y 50 ng o 100 ng de los plásmidos de expresión pCAG-Bax-ER(T2) (muestra 4), pCAG-ER(T2)-Bax (muestra 5), pCAG-Casp8- ER(T2) (muestra 6), pCAG-myrCasp8-ER(T2) (muestra 7), pCAG-Casp9full-ER(T2) (muestra 8), pCAG-Casp9trunc- ER(T2) (muestra 9), pCAG-Casp3-ER(T2) (muestra 10), pCAG-Casp3-ED4ER(T2) (muestra 11). Control negativo: transfección con pCAG-Cre-ER(T2) (muestra 1). Controles positivos previstos: transfección con los plásmidos pCAG- HAFas-ER(T2) (muestra 2) o pCAG-MFas-ER(T2) (muestra 3).

Las filas verticales muestran los valores medios y la desviación estándar de "unidades de luz relativas" (RLU) obtenidas a partir de lisados de células con el ensayo de la actividad de -galactosidasa y la actividad de - galactosidasa relativa de células transfectadas con varios constructos de fusión ER(T2) en comparación con el control negativo sin tamoxifeno definido como 1.1.

La Fig. 3 muestra la detección de proteínas de fusión ER(T2) expresadas de forma estable en clones MEF5/N9 por análisis de inmunotransferencia Western. Las células MEF5/N9 se sometieron a electroporación con 8 g de pPgk- hygro linealizado para la selección con higromicina de clones positivos y 32 g de plásmidos de expresión ER(T2) linealizados. Se seleccionaron cuatro clones transfectados de forma estable de cada constructo para su análisis posterior. Aproximadamente 106 células fueron lisadas y 40 g de proteína de cada muestra se sometieron a SDS- PAGE. Las proteínas de fusión ER(T2) se detectaron utilizando un anticuerpo anti-ER. Las proteínas de fusión ER(T2) expresadas están indicadas por las flechas.

A-B: Expresión estable de la proteína Casp8-ER(T2) de 64 kDa en los clones M5N9 3.2 y 3.6 y de la proteína myrCasp8-ER(T2) de 65 kDa en los clones M5N9 7.3 y 7.4.

C-D: Expresión estable de la proteína Casp9full-ER(T2) de 85 kDa y de la proteína Casp9trunc-ER(T2) de 75 kDa en los clones M5N9.

E: Expresión estable de la proteína Casp3-ER(T2) de 65 kDa en los clones M5N9.

F: Expresión estable de la proteína ER(T2)-Bax de 53 kDa en los clones M5N9 previstos para ser control negativo ya que el constructo pCAG-ER(T2)-Bax no mostraba actividad dependiente de tamoxifeno en los ensayos de transfección transitoria.

G: Expresión estable de la proteína Cre-ER(T2) de 74 kDa en los clones M5N9.

H-I: Expresión estable de la proteína HAFas-ER(T2) de 54 kDa y de la proteína MFas-ER(T2) de 56 kDa en los clones M5N9.

La Fig. 4 ilustra los cambios fenotípicos visibles de los clones MEF5/N9 en el tratamiento con tamoxifeno. Las células fueron tratadas durante 24 h con 4-OH-tamoxifeno 10-8 M y se fotografiaron. La figura muestra los resultados representativos obtenidos a partir de dos experimentos realizados de forma independiente. Los paneles superiores muestran el fenotipo de las células no tratadas que crecieron bien en todos los clones. Los paneles inferiores presentan células tratadas con 4-OH-tamoxifeno y la sustancial muerte celular en los clones M5N9 3.2 Casp8ER (A2), M5N9 7.4 myrCasp8ER (B2), M5N9 5.3 Casp9fullER (C2) y M5N9 6.4 Casp9truncER (D2). El efecto es más débil en el clon que expresa Casp9trunc-ER(T2). Los controles negativos M5N9 1.3 CreER (G2) y M5N9 4.6 ERBax (F2), aún más los clones M5N9 2.5 HAFasER (H2), M5N9 9.4 MFasER (I2) y M5N9 8.1 Casp3ER (E2) no se vieron afectados por el tratamiento con 4-OH-tamoxifeno.

La Fig. 5 muestra los resultados derivados del análisis cuantitativo de la viabilidad celular de los clones MEF5/N9 en presencia de 4-OH-tamoxifeno. Después de 48 h con incubación con 4-OH-tamoxifeno 10-8 M, las viabilidades celulares fueron analizadas mediante el ensayo MTT de citotoxicidad. La figura muestra los resultados representativos obtenidos a partir de dos experimentos realizados de forma independiente. En presencia de 4-OH- tamoxifeno, las viabilidades celulares de los clones que expresan Casp8ER- (muestra 5), myrCasp8ER- (muestra 6), Casp9fullER- (muestra 7) y Casp9truncER- (muestra 8) se redujeron un 31 %, 9 %, 6 % y 58 %, respectivamente. En contraste, los clones que expresan CreER- (control negativo, muestra 1), ERBax- (muestra 4), Casp3ER- (muestra 9), HAFasER- (muestra 2) y MFasER- (muestra 3) no fueron afectados por el tratamiento con 4-OH-tamoxifeno.

La Fig. 6 muestra los resultados derivados del análisis TUNEL (marcaje del extremo en la rotura de simple cadena con dUTP mediante deoxinucleotidil transferasa) de clones MEF5/N9 que expresan proteínas de fusión Caspasa-8 o -9 en presencia o ausencia de 4-OH-tamoxifeno. Las células se incubaron con 4-OH-tamoxifeno a una concentración de 10-8 M bien durante 3 horas o bien 7 horas, fijada en PFA 4 % y se permeabilizaron en metanol a -20 ºC. La fragmentación de ADN se detectó mediante fluoresceína incorporada que fue reconocida mediante un anticuerpo anti-fluoresceína, conjugado con peroxidasa de rábano picante (POD). Cuando se hace reaccionar con la peroxidasa, el sustrato DAB produce un precipitado insoluble de color marrón que se visualizaba con un microscopio óptico. Los núcleos se tiñeron adicionalmente con DAPI (A2-E2, A4-F4) y la fluorescencia se documentó con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan 2. Control positivo: las células se incubaron con DNasa I para inducir roturas en la cadena de ADN y se prosiguió de la misma manera como con las otras muestras. Las células positivas TUNEL se tiñeron de color marrón oscuro (F1). Como control negativo sirvió una muestra incubada con fluoresceína y desoxinucleotidil transferasa terminal, pero que no se trató con POD (E1). Cada muestra se realizó por duplicado. Observar los núcleos positivos teñidos de color marrón (flecha). Las células que expresan Casp8-ER (A3), myrCasp8-ER (B3) y Casp9fullER (C3) mostraron típica morfología apoptótica, indicado por una flecha. Los ligeros precipitados parduscos que aparecen en las muestras que no fueron tratadas con 4-OH-tamoxifeno son inespecíficos. Aumento original: 40 veces. Barra de la escala: 50 m.

La Fig. 7 muestra la respuesta a la dosis de 4-OH-tamoxifeno de fibroblastos de murino transfectados estables y especificidad de la especie de la proteína de fusión myrCasp8-ER(T2) de murino. (a) Viabilidad celular en cultivos de clones M5/N9 que expresan myrCasp8-ER(T2) o Cre-ER(T2) en dependencia de la concentración de 4-OH- tamoxifeno, determinada con el ensayo de MTT a las 48 h, en comparación con cultivos que no recibieron 4-OH- tamoxifeno. Los resultados se muestran como valores medios de muestras por triplicado con desviación estándar.

(b) Cotransfección transitoria de un reportero β-galactosidasa con un plásmido de expresión de células Cre-ER(T2), myrCasp8-ER(T2), o Casp9-ER(T2) en M5/N9 de murino (columnas negras), HeLa humana (columnas grises) o Pac2 del pez cebra (columnas vacías). Las células, 12 h después de la transfección, se cultivaron durante 36 h con 4-OH-tamoxifeno a 10-8 M y se determinó la actividad de β-galactosidasa en los lisados celulares. Los valores obtenidos de transfecciones del vector Cre-ER(T2) se definieron como referencia. Los resultados se muestran como valores medios de muestras por triplicado con desviación estándar.

Ejemplos

Ejemplo 1 Las aplicaciones de una herramienta de extirpación celular célula inducible utilizando el sistema quimérico de Caspasa-FKBP y Fas-ER se han demostrado de manera eficiente en varios estudios.

Sin embargo, este sistema no proporciona el empleo universal en cualquier órgano y cualquier tipo de célula del cuerpo de los mamíferos, incluido el cerebro. En el presente documento, los autores de la invención han investigado un sistema de apoptosis inducible alternativo diseñado para su aplicación universal, en células y tejidos de mamíferos, incluido el cerebro. Para probar la actividad de diferentes genes quiméricos, los autores de la invención fusionaron bien una Caspasa-8, -9, -3, o bien un dominio Bax con el dominio de unión al ligando del receptor ER(T2) de estrógenos de mamífero mutante, que es incapaz de unir estrógeno conserva todavía una alta afinidad por un ligando sintético, 4-hidroxi-tamoxifeno (Tm). Después de la administración del ligando que induce la dimerización del dominio ER(T2), la apoptosis debería ser dirigida por el dominio de Caspasa o Bax activado. Para comparar y cuantificar la actividad de los diferentes vectores de expresión Casp/Bax-ER(T2), estos constructos se introdujeron transitoriamente en la línea celular MEF5/N9 de fibroblastos de ratón junto con un vector reportero que codifica β- galactosidasa.

A. Construcciones de plásmidos: Para la construcción de pCAG-Cre-ER(T2)-bpA un fragmento de 2,3 kb codificante de la proteína de fusión Cre- ER(T2) (Feil, et al., Biochem Biophys Res Commun, 237, 752-757 (1997)) se aisló de pSS1 (ID de SEC Nº: 1; R.

Kühn, no publicado) mediante digestión con PacI PvuII y ScaI y se ligó en pCAG-C31int(NLS)-bpA (R. Kühn, no publicado; ID de SEC Nº: 2), se abrió con SphI y PacI. El pCAG-Cre-ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 3; Fig. 1E ) contiene un promotor CAG de 1669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión Cre-ER(T2) (ID de SEC Nº: 4 y 5; Cre: posición 2139-3167; enlazador de 3 AA: posición 3168-3176; ER(T2): posición 3177-4118), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 4181-4445). La secuencia del gen de fusión Cre-ER(T2) se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN.

Los vectores de expresión pCAG-HAFas-ER(T2) y pCAG-MFas-ER(T2) se construyeron de la siguiente manera: inserto de Fas en ratón que codifica los aminoácidos 135 a 305 para la transmembrana y el dominio intracelular del receptor Fas se amplificó mediante PCR (kit de PCR Phusion High-Fidelity, Nueva Inglaterra Biolabs) a partir del plásmido pDNR-LIB-Fas (RZPD GmbH, Berlín, Alemania, ID del clon: IRALp962N1053Q). Para generar el fragmento HAFas de 574 pb, se utilizaron los oligonucleótidos fas1ER-A (ID de SEC Nº: 6), que contienen el epítopo de hemaglutinina del virus de la gripe, YPYDVPDYA (ID de SEC Nº: 81), y FasER-B (ID de SEC Nº: 7). La variante MFas de 602 pb se obtuvo utilizando los oligonucleótidos fas2ER-A (ID de SEC Nº: 8), que contienen una secuencia señal para localización en la membrana celular, y fasER-B. Ambos fragmentos de PCR fueron flanqueados por un sitio 5' PacI y un sitio 3' SaII. Los extremos de los productos PCR se digirieron con las enzimas respectivas y se ligaron en el plásmido pCAG-Cre-ER(T2)-bpA, se abrió con PacI y XhoI, dando lugar a los vectores de expresión pCAG-HAFas-ER(T2) (ID de SEC Nº: 9) y pCAG-MFas-ER(T2) (ID de SEC Nº: 10). El pCAG-HAFas-ER(T2) (Fig. 1F) contiene un promotor CAG de 1669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión HAFas-ER(T2) (ID de SEC Nº: 11 y 12; HA: posición 2120-2152, Fas: posición 2153-2665; enlazador de 3 AA: posición 2666-2674, ER(T2): posición 2675-3616), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 3679-3943) pCAG-MFas-ER(T2) (Fig. 1F) contiene un promotor CAG de 1669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión MFas-ER(T2) (ID de SEC Nº: 13 y 14; secuencia señal: posición 2120-2182, Fas: posición 2183-2695; enlazador de 3 AA: posición 2696-2704, ER(T2): posición 2705-3646), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 3709-3973). Las secuencias de HAFas-ER(T2) y MFas-ER(T2) fueron confirmadas por análisis de la secuencia del ADN.

Construcción de los plásmidos de expresión pCAG-Casp8-ER(T2)-bpA y pCAG-myrCasp8-ER(T2)-bpA: el inserto de Caspasa 8 de ratón se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pCMV-SPORT6-Casp8 (RZPD GmbH, Berlín, Alemania, ID del clon: IRAVp968E1193D). El fragmento de PCR Casp8 de 814 pb se generó mediante el uso de los oligonucleótidos Casp8ER-A (ID de SEC Nº 15) y Casp8ER-B (ID de SEC Nº: 16). La variante myrCasp8 de 853 pb, que contiene un motivo de secuencia de la miristoilación N-terminal, se obtuvo mediante el uso de los oligonucleótidos myrCasp8ER-A (ID de SEC Nº: 17) y Casp8ER-B. Ambos productos de la PCR fueron digeridos con PacI y XhoI y se insertaron en el sitio de clonación PacI/XhoI de pCAG-Cre-ER(T2)-bpA, dando lugar a los vectores de expresión pCAG-Casp8-ER(T2)-bpA y pCAG-myrCasp8-ER(T2)-bpA. El pCAG-Casp8-ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 18; Fig. 1A ) contiene un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión Casp8-ER(T2) (ID de SEC Nº: 19 y 20; Caspasa 8: posición 2119-2907, enlazador de 3 AA: posición 2908-2916, ER(T2): posición 2917- 3858), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 3921-4185). El pCAG-myrCasp8- ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 21; Fig. 1A) consiste en un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión myrCasp8-ER(T2) (ID de SEC Nº: 22 y 23; motivo de miristoilación: posición 2119-2160, Caspasa 8: posición 2161-2946, enlazador de 3 AA: posición 2947-2955, ER(T2): posición 2956-3897), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 3960-4224). Las secuencias de Casp8-ER(T2) y myrCasp8-ER(T2) fueron confirmadas por análisis de la secuencia del ADN.

Los vectores de expresión pCAG-Casp9full-ER(T2)-bpA y pCAG-Casp9trunc-ER(T2)-bpA para la proteína de fusión Caspasa 9 ER(T2) y una forma suprimida del dominio de reclutamiento de activación de Caspasa (CARD), denominada proteína de fusión Caspasa 9 ER(T2) truncada, se construyeron de la siguiente manera: el inserto de Caspasa 9 de ratón se amplificó mediante la PCR a partir del plásmido pXY-Asc-Casp9 (RZPD GmbH, Berlín, Alemania, ID del clon: IRAVp968D06114D) utilizando los oligonucleótidos Casp9fullER-A (ID de SEC Nº 24) y Casp9ER-B (ID de SEC Nº 25) para generar el fragmento Casp9full de 1,3 kb. Para obtener la variante truncada Casp9trunc de 1,1 kb, se utilizaron los oligonucleótidos Casp9truncER-A (ID de SEC Nº: 26) y Casp9ER-B. Los productos de la PCR fueron digeridos con PacI/SalI y se ligaron en el sitio de clonación PacI/XhoI de pCAG-Cre- ER(T2)-bpA, dando lugar a vectores de expresión pCAG-Casp9full-ER(T2)-bpA y pCAG-Casp9trunc-ER(T2)-bpA. El pCAG-Casp9full-ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 27; Fig. 1B ) contiene un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432- 2099), el gen de fusión Casp9full-ER(T2) (ID de SEC Nº: 28 y 29; Caspasa 9: posición 2119-3480, enlazador de 3 AA: posición 3481-3489, ER(T2):. posición de 3490-4439), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 4494-4758). El pCAG-Casp9trunc-ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 30; Fig. 1B ) consiste en un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión Casp9trunc-ER(T2) (ID de SEC Nº: 31 y 32; Caspasa 9 suprimida de CARD: posición 2119-3210, enlazador de 3 AA: posición 3211-3219, ER(T2): 3220-4161), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 4224-4488). Las secuencias de Casp9full-ER(T2) y Casp9trunc-ER(T2) fueron confirmados por análisis de la secuencia de ADN.

La construcción de los plásmidos de expresión pCAG-Casp3-ER(T2)-bpA y pCAG-Casp3-ED4ER(T2)-bpA: inserto Caspasa 3 de ratón se amplificó a partir del plásmido pFLCI-Casp3 (Open Biosystems, Huntsville, EE.UU., ID del clon: EMM1002-7378750). El fragmento de la PCR de 856 pb se obtuvo mediante el uso de los oligonucleótidos Casp3ER-A (ID de SEC Nº: 33) y Casp3ER-B (ID de SEC Nº: 34) y se digirió con PacI/XhoI. Para generar el vector de expresión pCAG-Casp3-ER(T2)-bpA, el producto de la PCR digerido se insertó en pCAG-Cre-ER(T2), se abrió con PacI/XhoI. El pCAG-Casp3-ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 35; Fig. 1C) contiene un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión Casp3-ER(T2) (ID de SEC Nº: 36 y 37; Caspasa 3: posición 2119-2949, enlazador de 3 AA: posición 2950-2958, ER(T2): posición 2959-3900), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 3963-4227). El vector pCAG-Casp3-ED4ER (T2)-bpA (ID de SEC Nº: 38, que codifica una variante Casp3-ER(T2) con un dominio ER(T2) acortado N-terminal, denominado ED4ER(T2), se construyó ligando el producto de la PCR de Caspasa 3 digerido con PacI/XhoI al plásmido pCAG-Cre-ED4ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 39), se abrió con PacI/XhoI. El pCAG-Casp3-ED4ER(T2) (Fig. 1C) consiste en un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión Casp3-ED4ER(T2) (ID de SEC Nº: 40 y 41; Caspasa 3: posición 2119-2955, ED4ER(T2): posición 2956--3828), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 3891-4155).

El plásmido de expresión pCAG-Cre-ED4ER(T2)-bpA fue generado por sustitución del fragmento N-terminal más largo de ER(T2) por la parte ED4 acortada N-terminal. El fragmento ED4 de 298 pb se amplificó mediante la PCR utilizando los oligonucleótidos ED4ER-A (ID de SEC Nº: 42) y ED4ER-B (ID de SEC Nº: 43), digeridos con XhoI/DraIII y ligados en el sitio XhoI/DraIII de pCAG-Cre-ER(T2)-bpA. Las secuencias de Casp3-ER(T2) y Casp3- ED4ER (T2) fueron confirmadas por análisis de la secuencia de ADN.

La generación del plásmido de expresión pCAG-Bax-ER(T2)-bpA se produjo por amplificación de la PCR de Bax de ratón a partir del plásmido pCMV-SPORT6-Bax (RZPD GmbH, Berlín, Alemania, ID del clon: IRAVp968B0795D) con los oligonucleótidos BaxER-A (ID de SEC Nº: 44) y BaxER-B (ID de SEC Nº: 45). El producto de la PCR de 606 pb fue digerido con PacI/XhoI y ligado en el sitio PacI/XhoI de pCAG-Cre-ER(T2)-bpA. El pCAG-Bax-ER(T2)-bpA (ID de SEC Nº: 46; Fig. 1D) contiene un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión Bax-ER(T2) (ID de SEC Nº: 47 y 48; Bax: posición 2119-2697, enlazador de 3 AA: posición 2698-2706, ER(T2): posición 2707-3648), y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 265 pb (posición 3711-3975). Para construir el plásmido pCAG- ER(T2)-Bax-bpA codificante de una fusión de Bax con el N-término del dominio ER(T2), los autores de la invención aplicaron PCR de fusión con cebadores que se solapan. En primer lugar, la parte ER(T2) de 913 pb se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pCAG-Cre-ER(T2) utilizando oligonucleótidos ERbax-1 (ID de SEC Nº: 49) y ERbax-2 (ID de SEC Nº: 50). Simultáneamente, el producto de 590 pb de la PCR codificante del dominio Bax fue generado mediante el uso de los oligonucleótidos ERbax-3 (ID de SEC Nº: 51) y ERBax-4 (ID de SEC Nº: 52) y el plásmido pCMV-SPORT6-bax (RZPD GmbH, Berlín, Alemania, ID del clon: IRAVp968B0795D) como ADN molde. Dado que los cebadores ERbax-2 y ERbax-3 se solapan, ambos fragmentos de la PCR se combinaron con el producto de la PCR de fusión ER(T2)-Bax de 1.503 pb mediante el uso de los oligonucleótidos ERbax-1 y ERbax-4.

El producto final estaba flanqueado por un sitio 5'-PacI y un sitio 3'-SalI, digerido con las enzimas respectivas y ligado en el plásmido pCAG-C31int(NLS)-bpA, se abrió con PacI y SalI, dando lugar al vector de expresión pCAG- ER(T2)-Bax-bpA (ID de SEC Nº: 53; Fig. 1D ) que contiene un promotor CAG de 1.669 pb (posición 432-2099), el gen de fusión ER(T2)-Bax (ID de SEC Nº: 54 y 55; ER(T2): posición 2124-2999, Bax: posición 3000-3575) y una secuencia señal de poliadenilación bovina de 317 pb (posición 3593-3909). Las secuencias de Bax-ER(T2) y ER(T2)-Bax se confirmaron por secuenciación de ADN.

B. Cultivo celular y transfecciones transitorias La línea celular MEF5/N9 de fibroblasto embrionario de ratón transformada (Schwenk et al., Nucleic Acids Research, 26(6) 1427-32 (1998)) se obtuvo de Michel Aguet (Universidad de Zürich, Suiza). Las células se cultivaron en medio DMEM (Life Technologies) suplementada con glutamato 2 mM y 10 % de suero fetal bovino a 37 ºC, 5 % de CO2 en atmósfera húmeda y se pasaron después de la tripsinización. Un día antes de la transfección transitoria, 4·104 células se sembraron en una placa de 24 pocillos (Falcon). Para la transfección transitoria de células MEF5/N9 con plásmidos, cada pocillo recibió en 500 l de medio una cantidad total de 150 ng o 200 ng de ADN plásmido superenrollado complejado antes con el reactivo de transfección FuGene6 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada 150 ng o 200 ng de preparación de ADN (Fig. 2, muestras 1 a 11) contenían 100 ng del vector de expresión pCMV-β-gal-pA (pCMVβ, Clontech, Fig. 1G, ID de SEC Nº: 56) de β-galactosidasa, y 100 ng de los vectores de expresión ER(T2) de fusión a ensayar (Fig. 2, muestras 3-7, 10-11) y los plásmidos de control (Fig. 2, muestras 1-3), excepto para las muestras con los plásmidos pCAG- Casp9full-ER(T2)-bpA (Fig. 2, muestra 8) y pCAG-Casp9trunc-ER(T2)-bpA (Fig. 2, muestra 9), respectivamente, que recibieron 50 ng del vector de ensayo. Para cada muestra a ser ensayada se transfectaron cuatro pocillos individuales. Cinco horas después de la adición de las preparaciones de ADN cada pocillo recibió 500 l adicionales de medio de crecimiento. Al día siguiente, el medio de dos pocillos de cada muestra se sustituyó por medio de nueva aportación. Los otros dos pocillos recibieron medio que contenía 4-hidroxi-tamoxifeno 10-8 M (Sigma). 48 horas después de la inducción con 4-OH-tamoxifeno, las células de cada pocillo se lisaron con 200 l de reactivo de lisado suplementado con inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics GmbH). Los lisados se centrifugaron y se utilizaron 50 l para determinar las actividades de β-galactosidasa utilizando el ensayo del gen reportero de β-galactosidasa (Roche Diagnostics GmbH) de acuerdo con el protocolo del fabricante en un luminómetro de microplacas (Berthold Detection Systems GmbH). El valor medio y la desviación estándar de las muestras se calcularon a partir de los valores RLU de β-galactosidasa obtenidos de los dos pocillos transfectados de cada muestra. La actividad relativa de ß-galactosidasa se obtuvo por comparación con el control negativo (pCAG-Cre-ER(T2)-bpA) sin 4-OH- tamoxifeno.

Resultados: Para evaluar la eficacia de un enfoque novedoso para la muerte celular inducible, los autores de la invención generaron diferentes genes de fusión de Caspasas o Bax y del receptor ER(T2) de estrógenos de mamífero mutante, que dimeriza después de la administración del ligando sintético 4-hidroxi-tamoxifeno. En primer lugar, los autores de la invención construyeron el plásmido pCAG-Cre-ER(T2) (véase la Fig. 1E) diseñado como un control negativo que contiene el gen de fusión Cre-ER(T2) de 1,98 kb, dirigido por el promotor CAG y una secuencia señal de poliadenilación bovina. La proteína Cre se fusionó con el N-término del dominio de unión al ligando de los receptores de estrógenos de mamíferos mutante, conocido como ER(T2) (282-595) (Feil, et al., Biochem Biophys Res Commun, 237, 752-757 (1997)). Ambos dominios están separados por un enlazador que consiste en tres aminoácidos. En todos los demás constructos ensayados, el dominio de Cre recombinasa fue reemplazado por el dominio de Caspasa, Bax o Fas, respectivo, dando como resultado secuencias idénticas de la cadena principal con excepción de los plásmidos pCAG-Casp3-ED4ER(T2) y pCAG-ER(T2)-Bax. Los plásmidos pCAG-Casp8-ER(T2) y pCAG-myrCasp8-ER(T2) contenían un dominio de Caspasa 8 de ratón fusionado al N-término de ER(T2) (véase la Fig. 1A). El myrCasp8-ER(T2) de 1,78 kb difería del gen de fusión Casp8-ER(T2) de 1,74 kb por una secuencia señal de miristoilación adicional que proporciona la unión a la membrana para Casp8-ER(T2) y, por lo tanto, que aumenta eficazmente las concentraciones locales de la proteína de fusión. El pCAG-Casp9full-ER(T2) (véase la Fig. 1B) contenía la secuencia de longitud completa de la proCaspasa 9 de ratón, dando como resultado un gen de fusión de 2,32 kb de tamaño. La variante pCAG-Casp9trunc-ER(T2) (véase la Fig. 1B) consistía en el gen de fusión Casp9trunc-ER(T2) de 2,04 kb que incluye un dominio de Caspasa 9 de ratón sin el dominio de reclutamiento de la activación de Caspasa (CARD). Los plásmidos pCAG-Casp3-ER(T2) y pCAG-Casp3-ED4ER(T2) contienen la secuencia de longitud completa de la proCaspasa 3 de ratón (véase la Fig. 1C). El gen de fusión Casp3-ER(T2) de 1,79 kb incluye el enlazador habitual de tres aminoácidos entre ambos dominios. En contraste, el gen de fusión Casp3-ED4ER(T2) de 1,71 kb resulta de una fusión directa de la proCaspasa 3 con una variante ER(T2) (305-595) acortada N-terminal. Los plásmidos pCAG-Bax-ER(T2) y pCAG-ER(T2)-Bax contienen la secuencia de longitud completa de Bax de ratón (véase la Fig. 1D). Aunque el gen de fusión bax-ER(T2) de 1,53 kb codifica una proteína de fusión N-terminal de Bax y ER(T2), la variante ER(T2)-Bax de 1,45 kb es una fusión C-terminal sin espacio de Bax con ER(T2). La secuencia de la cadena principal de pCAG-ER(T2)-Bax es idéntica al vector pCAG-C31int(NLS).

Los plásmidos pCAG-HAFas-ER(T2) y pCAG-MFas-ER(T2) (véase la Fig. 1F) se planificaron como controles positivos ya que la actividad de la proteína de fusión Fas-ER para inducir la apoptosis dependiente de ligando se ha demostrado en varios estudios (Takebayashi et al, Cancer Research, 56, 4164-4170 (1996); Kawaguchi et al, Cancer Letters, 116, 53-59 (1997); Kodaira et al, Jpn. J. Cancer Res, 89, 741-747 (1998)). HAFas-ER (T2) (1,5 kb) es una fusión entre un epítopo HA del virus de la gripe, seguido por la transmembrana y los dominios citoplasmáticos de Fas de ratón (135-305) y ER(T2). La otra variante MFas-ER(T2) (1,53 kb) es idéntica a HAFas- ER(T2), pero contiene en lugar del epítopo HA un péptido señal para localización en la membrana de la célula.

Para investigar el efecto de muerte celular de los diferentes constructos de fusión ER(T2) cuantitativamente, los autores de la invención han realizado cotransfecciones transitorias de los vectores de expresión de la proteína de fusión ER(T2) junto con una cantidad fija de un plásmido reportero codificante de β-galactosidasa en células de fibroblastos MEF5/N9. Las células transfectadas se trataron 12 horas después de la transfección con 4-OH- tamoxifeno de una concentración de 10-8 M. Después de 48 horas de inducción con 4-OH-tamoxifeno, las células de las diversas muestras se lisaron y la actividad de β-galactosidasa en los lisados se determinó mediante un ensayo de quimioluminiscencia y se expresaron en "Unidades Relativas de Luz" (RLU) (Fig. 2). Como controles positivos para la muerte celular inducible por 4-OH-tamoxifeno, los autores de la invención prepararon muestras transfectadas con los constructos pCAG-HAFas-ER(T2) o pCAG-MFas-ER(T2) junto con el plásmido reportero y el tratamiento con 4-OH tamoxifeno. Como control negativo para este ensayo sirvieron muestras que recibieron el plásmido reportero junto con el vector de expresión pCAG-Cre-ER(T2) y que fueron tratados con 4-OH-tamoxifeno.

Para determinar la actividad relativa de los constructos de fusión ER(T2) ensayados que inducen apoptosis en presencia de 4-OH-tamoxifeno, los valores de RLU de la actividad de β-galactosidasa se dividieron de forma individual para cada muestra por el valor de RLU obtenido a partir de la muestra que recibió el plásmido pCAG-Cre- ER(T2) pero que no era tratada con el 4-OH-tamoxifeno (definido como control negativo). La actividad relativa de las proteínas de fusión Caspasa-ER(T2) o Bax-ER(T2) se comparó a continuación con el control negativo de la muerte celular dependiente de 4-OH-tamoxifeno definido como una actividad de 1.

Fig. 2 muestra los resultados representativos de al menos dos experimentos realizados de forma independiente.

Sólo los resultados de las muestras que recibieron la cantidad de ADN con la menor toxicidad basal se muestran en la Fig. 2. Ni la expresión del control negativo Cre-ER(T2) solo ni el tratamiento combinado con 4-OH-tamoxifeno a la concentración de 10-8 M presentaban efectos secundarios tóxicos (muestras 1.1 y 1.2), lo que indica que la muerte celular observada en combinación con la expresión de los constructos de ensayo es un efecto específico. Ambas variantes Fas-ER(T2) diseñadas como controles positivos exhibían en presencia de 4-OH-tamoxifeno una actividad de β-galactosidasa relativa de solo el 23 % para HAFas-ER(T2) y 26 % para MFas-ER(T2) en comparación con el control negativo. Sin embargo, una toxicidad basal, expresada en las actividades de la β-galactosidasa reducidas en comparación con el control negativo en ausencia de 4-OH-tamoxifeno, podía observarse en ambos constructos.

Considerando una ligera variación experimental entre transfecciones, las toxicidades basales dependientes de 4- OH-tamoxifeno tenían las siguientes clasíficaciones: myrCasp8-ER(T2) (6 %) > Casp8-ER(T2) (17 %) > Casp3- ER(T2), Casp3-ED4ER(T2), HAFas-ER(T2) (52 %) > MFas-ER(T2) (60 %) > Casp9full-ER(T2) (62 %) > Casp9trunc- ER(T2) (70 %) > ER(T2)-Bax (84 %) > Bax-ER(T2) (100 %). La sensibilidad a la activación inducible por 4-OH- tamoxifeno sigue un orden ligeramente diferente a la actividad basal: myrCasp8-ER(T2) (0,1 %) > Casp8-ER(T2) (3 %) > Casp9full-ER(T2) (7 %) > Casp9trunc-ER(T2) (22 %) > HAFas-ER(T2) (23 %) > MFas-ER(T2) (26 %) > Casp3- ER(T2) (28 %). Normalmente, se observó que una disminución de la actividad basal se correlaciona con la reducción de la actividad inducible por 4-OH-tamoxifeno. Ambos constructos de fusión Caspasa 8 ER(T2) demostraron la eficacia más alta para la muerte celular dependiente de 4-OH-tamoxifeno entre todas las proteínas de fusión ER(T2) pero también una actividad basal más fuerte. Incluso cuando la cantidad de plásmido de expresión transfectado se redujo a 5 ng por muestra, un cambio en la actividad basal podía no ser detectado significativamente (no se muestra). Por el contrario, ambos constructos de Caspasa 9 ER(T2) mostraron baja toxicidad basal relativa pero también menor actividad dependiente de 4-OH-tamoxifeno. Sorprendentemente, ni la fusión N-terminal ni la fusión C-terminal de Bax con ER(T2) presentaron ninguna actividad en la línea celular de ensayo elegida.

Inesperadamente, aunque Caspasa 3 desempeña la función de Caspasa ejecutiva aguas abajo en la vía apoptótica, la actividad dependiente de ligando de la variante Casp3-ER(T2) era baja en comparación con las variantes de fusión Caspasa 8 ER(T2) o Caspasa 9 ER(T2). Además, el constructo Casp3-ED4ER(T2) con enlazador suprimido y un N-término ER(T2) acortado revelaba la toxicidad basal, pero no podía regularse en presencia de 4-OH tamoxifeno. Excepto para Bax-ER(T2) todos los constructos, incluyendo el control positivo Fas-ER(T2) mostraban toxicidad basal de ligera a considerable en ausencia de 4-OH-tamoxifeno. Estos resultados podrían explicarse por el elevado número de copias de constructos Caspasa-ER(T2) o fas-ER(T2) transfectados que dan lugar a concentraciones no fisiológicas de proteínas de fusión ER(T2) dentro de las células.

Tomados en conjunto, en el sistema de transfección transitoria mostrado en la Fig. 2 los autores de la invención podían identificar varios constructos de fusión Caspasa-ER(T2) que presentan actividad dependiente de 4-OH- tamoxifeno. Sin embargo, no cada combinación arbitraria de diferentes moléculas de Caspasas o Bax y ER(T2) fue capaz de inducir la muerte celular en presencia de 4-OH-tamoxifeno y pudo ser regulada adicionalmente de una manera dependiente de ligando. En particular, este ensayo proporciona la primera evidencia de tres proteínas de fusión de Caspasa-ER(T2) muy eficientes: myrCasp8-ER(T2), Casp8-ER(T2) y Casp9full-ER(T2). La eficiencia de una fusión alternativa de las Caspasas con ER(T2) en lugar del dominio FKBP se considera como una invención de uso sustancial en biotecnología.

Ejemplo 2 Usando el sistema de transfección transitoria del Ejemplo 1, los autores de la invención identificaron constructos de fusión Caspasa-ER(T2) que exhiben actividad dependiente de 4-OH-tamoxifeno. Sin embargo, el elevado número de copias de plásmidos de expresión siguientes a la transfección transitoria puede conducir a altas concentraciones no fisiológicas de las proteínas de fusión. A continuación, los autores de la invención transfectaron los constructos identificados como activo en el Ejemplo 1 de manera estable en la línea celular de ensayo MEF5/N9, abreviando M5N9.

A. Construcciones de plásmidos Todos los plásmidos y su depuración se describen en el Ejemplo 1, excepto para el plásmido pPgk-hygro-pA ( Fig.

1H; ID de SEC Nº: 57) que se obtuvo de Paul Krimpenfort (National Cancer Institute, Amsterdam).

B. Cultivo celular y transfecciones estables Para generar de forma estable células MEF5/N9 transfectadas, se coelectroporaron 2·106 células con 32 g de ADN del plásmido de fusión ER(T2) linealizado con ScaI y 8 g de ADN del plásmido pPgk-hygro-pA linealizado con XhoI y se sembraron en dos placas de 96 pocillos. Las células fueron cultivadas en medio DMEM (Invitrogen) suplementado con Glutamina 2 mM y 10 % de suero fetal bovino a 37 ºC, 5 % de CO2 en atmósfera húmeda, y se pasaron después de la tripsinización. Dos días después de la transfección el medio fue suplementado con 250 u/ml de higromicina (Calbiochem) para la selección de integrantes estables. Después del crecimiento de colonias resistentes, éstas se expandieron de forma individual en presencia de higromicina.

C. Detección por inmunotransferencia de proteínas de fusión ER(T2) en células MEF5/N9 transfectadas Para demostrar directamente la expresión del vector de la proteína de fusión transfectada, se prepararon lisados de proteínas de clones resistentes a higromicina para el análisis por inmunotransferencia Western.

Un millón de células se lisaron en 500 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl [pH 6,8], ditiotreitol 50 mM, 10 % de glicerol, 2 % de SDS) suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics GmbH). Los lisados celulares se incubaron durante 7 minutos a 100 ºC, y se sometieron a ultrasonidos durante 10 s. Los restos celulares se sedimentaron por centrifugación y una alícuota del sobrenadante se aplicó para el análisis de la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL.). Un 0,01 % de azul de bromofenol,diluido en tampón de lisis se añadió al lisado remanente. Para el análisis de inmunotransferencia Western, se incubaron 40 g de proteína durante 3 min a 100 ºC antes de la separación de las muestras en gel de SDS-poliacrilamida al 10 % (geles Bis-Tris Novex de NuPAGE®; Invitrogen). La electroforesis se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante en tampón de migración MES (MES 50 mM, Tris-HCl 50 mM, AEDT 1mM, 0,1 % de SDS, [pH 7,2]). Después de la posterior transferencia con la membrana de transferencia BioTrace PVDF (Pall Corporation) en tampón de transferencia (25 mM bicina, 25 mM Bis-Tris, 1 mM AEDT, 0,005 mM clorobutano, 10 % de metanol), las membranas se bloquearon en 5 % de leche desnatada (BD Biosciences) durante la noche a 4 ºC. El análisis de inmunotransferencia Western se realizó con el kit ECL (Amersham Biosciences) utilizando cualquier anticuerpo HC-20 anti-ER de conejo (# SC543, Santa Cruz Biotecnology), se diluyó 1:1.000 en 2,5 % leche desnatada/TBST o anticuerpo AC15 anti--actin de ratón (BIOZOL, Eching, Alemania), se diluyó 1:5.000 en 2,5 % leche desnatada/TBST. Entre cada etapa de incubación y antes de la detección de la señal, las membranas se lavaron varias veces con TBST (Tris-HCl 25 mM [pH 7,6], NaCl 137 mM, 0,1 % Tween-20). La extracción de membrana se produjo durante 5 min en tampón de extracción (10 % de ácido acético, 10 % de metanol) en un agitador.

Resultados Para generar clones de células de mamífero con una integración genómica estable de genes de fusión ER(T2) activos, la línea celular MEF5/N9 de fibroblastos de murino se sometió a electroporación con el ADN linealizado de constructos de fusión ER(T2) junto con el plásmido pPgk-hygro (Fig. 1; véase, también, el Ejemplo 1) y se sometieron a la selección en medio de crecimiento que contenía higromicina. Los autores de la invención transfectaron MEF5/N9 con pCAG-Cre-ER(T2) y pCAG-ER(T2)-Bax, respectivamente, diseñados como controles negativos. Los autores de la invención transfectaron adicionalmente las células con las constructos pCAG- myrCasp8-ER(T2), pCAG-Casp8-ER(T2), pCAG-Casp9full-ER(T2), pCAG-Casp9trunc-ER(T2), pCAG-Casp3-ER(T2) y los supuestos controles positivos pCAG-HAFas-ER(T2) y pCAG-MFas-ER(T2). Para cada constructo, se expandieron y escogieron cuatro clones transfectados de manera estable para análisis posterior.

Como se muestra en Fig. 3, la expresión de las proteínas de fusión se determinó mediante análisis de inmunotransferencia Western utilizando un anticuerpo anti-ER. Se aplicaron 40 μg de cada muestra para SDS- PAGE. El anticuerpo anti-ER reconoció específicamente las proetínas de fusión ER(T2) ya que el receptor de estrógenos endógeno no estaba presente en las células no transfectadas (no mostrado). Al menos dos de los cuatro clones de cada constructo presentaba una elevada expresión de las proteínas de fusión ER(T2). Este hallazgo indica, en primer lugar, que los constructos de fusión diseñados podían expresarse de forma correcta, y en segundo lugar, que la expresión estable de las proteínas de fusión que muestran gran toxicidad basal en ensayos de transfección transitoria (Ejemplo 1) no era letal para las células. La Fig. 1G muestra la expresión de Cre-ER(T2) que era detectada como una proteína de 74 kDa en los cuatro clones. Las Fig. 3H y 3I muestran la expresión de las proteínas de fusión HAFas-ER(T2) de 54 kDa y MFas-ER(T2) de 56 kDa. La Casp8-ER(T2) se detectó como una proteína de 64 kDa en los clones M5N9 3.2 y 3.6 (véase la Fig. 1A). La myrCasp8-ER(T2) se detectó como una proteína de 65 kDa en los clones M5N9 7.3 y 7.4 (véase la Fig. 1B). La Casp9full-ER(T2) y la Casp9trunc-ER(T2) se detectaron, respectivamente, como una proteína de 85 kDa y como una proteína de 75 kDa en los cuatro clones de cada constructo (Fig. 1C, D). La Casp3-ER(T2) se expresó en todos los clones como una proteína de 65 kDa (véase la Fig. 1E ). La expresión de la proteína ER(T2)-Bax se muestra en la Fig. 1F como una proteína de 53 kDa.

Ejemplo 3 Los autores de la invención han mostrado en los ensayos de transfección transitoria (ejemplo 1) que las fusiones entre ER(T2) y Caspasa 8, Caspasa 8 miristoilada, proCaspasa 9, Caspasa 9 sin CARD, o proCaspasa 3, la muerte celular inducida bajo control de 4-OH-tamoxifeno. Sin embargo, este sistema de ensayo no proporciona evidencia final de la eficacia de los diversos constructos. Para investigar las diferencias en la eficacia de los diversos plásmidos de expresión, los autores de la invención han generado de forma estable clones MEF5/N9 transfectados que expresan las proteínas de fusión ER(T2) en un bajo número de copias. Los clones MEF5/N9 transfectados se incubaron con 4-OH-tamoxifeno y se examinaron en cuanto a la viabilidad celular.

A. Viabilidad de células MEF5/N9 transfectadas después del tratamiento con 4-OH-tamoxifeno Para examinar la muerte celular dependiente de 4-OH-tamoxifeno, 1·105 células MEF5/N9 que expresan proteínas de fusión ER(T2) se sembraron en cada pocillo de una placa de seis pocillos. Al día siguiente, para cada muestra, el medio en dos de cuatro pocillos individuales se reemplazó con medio suplementado con 4-hidroxi-tamoxifeno 10-8 M. 24 horas después de la inducción con 4-OH-tamoxifeno, las células se fotografiaron mediante un microscopio de fluorescencia Leica DMI6000B con contraste de fase, bien con una ampliación de 10 veces o de 20 veces.

B. Ensayo MTT de citotoxicidad Para cuantificar la muerte celular inducible por 4-OH-tamoxifeno, los autores de la invención aplicaron el ensayo MTT colorimétrico (Mossman, J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983)) que permite la cuantificación de la supervivencia celular. Las células (4·103) se sembraron en placas de 96 pocillos. El ensayo se llevó a cabo en tres réplicas para cada muestra tratadas con y sin 4-OH-tamoxifeno. Después de 12 h, el medio se sustituyó bien con medio de nueva aportación o con medio suplementado con 4-OH-tamoxifeno 10-8 M. Después de 48 h de tratamiento con 4-OH- tamoxifeno, se añadió reactivo MTT filtrado estéril en PBS (Sigma) a la concentración de 0,5 mg/ml. La incubación tuvo lugar durante 4 horas a 37 ºC. Con el tiempo de reacción en curso, aparecieron cristales de formazano de color violeta oscuro en el MTT en el fondo de los pocillos que contenían células vivas. Los cristales se disolvieron en 150 l de HCl 0,04 N/isopropanol para dar una solución homogénea azul adecuada para la medición de la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm en el Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (Biotek).

Resultados Para examinar la apoptosis inducible con 4-OH-tamoxifeno en clones MEF5/N9 transfectados de manera estable, los autores de la invención visualizaron en primer lugar la viabilidad celular después de 24 horas de incubación con 4- OH-tamoxifeno a una concentración de 10-8 M. La Fig. 4 muestra resultados representativos de dos experimentos realizados de forma independiente. Dado que la capacidad de respuesta de los clones, transfectados con el mismo constructo, a 4-OH-tamoxifeno, diferían sólo ligeramente entre sí, sólo los resultados obtenidos de un clon de cada constructo se muestra en la figura.

Los resultados obtenidos de los ensayos de transfección transitoria pudieron confirmarse parcialmente. Curiosamente, solo las proteínas de fusión de ER(T2) y proCaspasa 9, Caspasa 8 miristoilada, Caspasa 8 y Caspasa 9 con CARD suprimido eran capaces de inducir la muerte celular dependiente de 4-OH-tamoxifeno en células MEF5/N9 transfectadas de forma estable. Todos los clones ensayados fueron creciendo normalmente, al igual que la línea celular parental, en ausencia de 4-OH-tamoxifeno (Fig. 4, paneles superiores), mientras que casi todas las células de los clones que expresan Casp8-ER(T2) (Fig. 4 A2), myrCasp8-ER(T2) (Fig. 4 B2) y Casp9full- ER(T2) (Fig. 4 C2) murieron en presencia de 4-OH-tamoxifeno dentro de 24 h. Las células MEF5/N9 que expresan proteína de fusión Casp9trunc-ER(T2) presentaban susceptibilidad más débil a 4-OH-tamoxifeno (Fig. 4 D2) comparado con las células que expresan las muy eficientes proteínas de fusión Casp8-ER(T2), myrCasp8-ER(T2) o Casp9full-ER(T2). En contraste, las células que expresan las proteínas de fusión Cre-ER(T2) o ER(T2)-Bax, que revelaban ser inactivas en ensayos de transfección transitoria, no respondían al 4-OH-tamoxifeno (véase la Fig. 4 G2, F2). Lo más sorprendente, ni las dos variantes Fas-ER(T2) (véase la Fig. 4 H2, I2), ni Casp3-ER(T2) ( Fig. 4 E2) eran capaces de inducir apoptosis en presencia de 4-OH-tamoxifeno. Para estos constructos, la muerte celular dependiente de 4-OH-tamoxifeno podía, posiblemente, observarse solo si los genes de fusión estuvieran disponibles en un elevado número de copias en las células como era el caso en las transfecciones transitorias (Ejemplo 1).

Los autores de la invención cuantificaron adicionalmente las viabilidades celulares mediante el ensayo MTT de citotoxicidad después de 48 h de incubación con 4-OH-tamoxifeno 10-8 M. Los resultados representativos de dos experimentos realizados de forma independiente se muestran en la Fig. 5. Los resultados obtenidos a partir de los exámenes fenotípicos de clones MEF5/N9 transfectados de manera estable se confirmaron en este ensayo. En ausencia de 4-OH-tamoxifeno, no hubo diferencia evidente en velocidades de crecimiento entre clones estables, pero en presencia de 4-OH-tamoxifeno, casi todas las células de los clones M5N9 3.2 Casp8ER (Muestra 5), M5N9 7.4 myrCasp8ER (Muestra 6) y M5N9 5.3 Casp9fullER (Muestra 7) murieron dentro de las 48 h de tratamiento. Los autores de la invención observaron una reducción de la viabilidad celular que desciende a 31 % en el clon M5N9 3.2 Casp8ER, a 9 % en el clon M5N9 myrCasp8ER 7.4 y a 6 % en el clon M5N9 5.3 Casp9fullER en presencia de 4-OH- tamoxifeno. El clon M5N9 6.4 Casp9truncER (Muestra 8) mostraba la susceptibilidad más débil a la muerte celular inducible por 4-OH-tamoxifeno como ya se observaba en los exámenes morfológicos.

Tomados en conjunto, los autores de la invención pudieron identificar tres constructos de fusión ER(T2) de alta eficiencia, a saber, Casp8-ER(T2), myrCASP8-ER(T2) y Casp9full-ER(T2) que inducen apoptosis dependiente de 4- OH-tamoxifeno en la línea de células MEF5/N9 del ensayo en un corto tiempo. Sin embargo, la actividad informada de la proteína de fusión Fas-ER(T2) (Kodaira et al., Jpn. J. Cancer Res., 89, 741-747 (1998)) prevista originalmente como un control positivo no pudo reproducirse en la línea celular MEF5/N9. Este hallazgo demuestra que Fas- ER(T2) muestra posiblemente actividad solo en tipos de células específicos, a saber, en los receptores Fas endógeno que expresan y en los que la apoptosis puede ser inducida de una manera dependiente de Fas. En contraste, los autores de la invención han mostrado por primera vez que los constructos de fusión de ER(T2) y Caspasas proporcionan un sistema altamente eficiente para la extirpación de forma condicional de células de mamífero. Además, dado que Caspasa 8 y Caspasa 9 se expresan de forma ubicua en los tejidos de mamíferos y están ambas involucradas en diferentes vías de la apoptosis, la potencial aplicación universal de fusiones de ER(T2) con Caspasa 8 o 9 para la extirpación de célula inducible es de relevancia comercial en biotecnología.

Ejemplo 4 Los autores de la invención han podido mostrar en el ejemplo 3 que 4-OH-tamoxifeno inducía la muerte celular de clones MEF5 que expresan proteínas de fusión Caspasa. Con el fin de proporcionar una evidencia directa de que la muerte celular tiene lugar a través de apoptosis inducida se utilizó el ensayo TUNEL de fragmentación de ADN. Este procedimiento detecta la fragmentación del ADN, uno de los últimos casos que resultan de las cascadas de señalización apoptótica. Como se muestra en la Fig. 6, el análisis TUNEL reveló que los clones que expresan proteínas de fusión Caspasa-8 o -9 experimentan muerte celular apoptótica en presencia del inductor 4-OH- tamoxifeno.

Ensayo de detección de muerte celular in situ TUNEL, o marcaje del extremo en la rotura de cadena simple con dUTP mediante deoxinucleotidil transferasa terminal, es reconocido como un procedimiento de elección en la detección rápida de la fragmentación del ADN que resulta de las cascadas de señalización apoptótica (Gavrieli et al., J. Cell Biol., 119 (3), 493-501 (1992)). La escisión del ADN genómico durante la apoptosis puede producir fragmentos de bajo peso molecular de ADN de doble cadena, así como roturas de cadena simple ("nicks") en el ADN de elevado peso molecular. Esas roturas de la cadena de ADN se pueden identificar por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que cataliza la polimerización de nucleótidos marcados en los extremos de ADN 3'-OH libres de una manera independiente del molde. Para detectar muerte celular inducida por 4-OH-tamoxifeno en las células MEF5/N9, se aplicó el kit de detección de muerte celular in situ, POD de Roche de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluoresceína incorporada se detectó por el anticuerpo anti-fluoresceína, conjugado con peroxidasa de rábano picante (POD). Después de la reacción del sustrato, las células teñidas pueden ser analizadas bajo un microscopio óptico.

Dos días antes de la tinción TUNEL, los cubreobjetos redondos de cristal (12 mm de Ø) se esterilizaron con 70 % de EtOH, se secaron bajo un flujo laminar y se revistieron con Poli-L-lisina a una concentración de 50 μg/ml durante la noche a 37 ºC, lo que permite una mejor unión de las células en los cubreobjetos. Al día siguiente, los cubreobjetos se enjuagaron 3 veces en PBS y se secaron durante 1 hora bajo flujo laminar. Se sembraron 2,5 105 células sobre los cubreobjetos en una placa de 6 pocillos. En el día de la prueba, el medio se sustituyó bien mediante medio de nueva aportación o bien mediante medio suplementado con 4-OH-tamoxifeno 10-8 M. Las células se fijaron en PFA al 4 % (diluido en PBS, pH 7,4) durante 1 hora a temperatura ambiente después de 2, 3 y 7 horas de incubación. Después de la fijación, las células se enjuagaron tres veces en PBS, se cubrieron con 100 % de metanol y se incubaron durante 10 minutos o durante la noche en un congelador y se enjuagaron en PBS. La actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada sumergiendo los cubreobjetos durante 10 minutos en H2O2 al 3 % en metanol antes de la permeabilización de las células. Las células fueron posteriormente enjuagadas con PBS y se incubaron en solución de permeabilización (Triton X-100 al 0,1 % en citrato de sodio al 0,1 % recién preparado) durante 2 min en hielo. Para generar un control positivo, se indujeron roturas de la cadena del ADN mediante la incubación de células permeabilizadas con 2 u/ml de DNasa I en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM, 1 mg/ml de BSA durante 10 min a temperatura ambiente, antes del procedimiento de marcado. Los cubreobjetos se lavaron dos veces con PBS antes de la incubación de cada muestra con 25 μl de mezcla de reacción TUNEL durante 60 minutos a 37 ºC en una atmósfera humidificada en la oscuridad. Para evitar la pérdida por evaporación, los cubreobjetos se cubrieron con Parafilm. Para un control negativo se añadieron 25 μl de solución de Etiqueta sin solución de enzima. Después del etiquetado, los cubreobjetos se enjuagaron 3 veces con PBS durante 10 minutos cada uno. Para transformar la señal de fluorescencia en una señal cromogénica, se añadieron 25 μl de la solución POD a cada muestra que se cubrió con parafilm y se incubó en una cámara humidificada durante 30 minutos a 37 ºC. Posteriormente, los cubreobjetos se enjuagaron 3 veces con PBS y se incubaron en DAB recién preparado al 0,05 % en Tris-HCl 0,1 M (pH 7,4) suplementado con H2O2 al 0,02 % durante 10-20 minutos a temperatura ambiente. El procedimiento de transformación se controló bajo un microscopio óptico. La reacción se detuvo con PBS hasta que fueron bien visibles precipitados marrones dentro de las células. Para retirar el DAB, los cubreobjetos se enjuagaron varias veces en PBS. Opcionalmente, la tinción nuclear se realizó incubando cubreobjetos durante 15 min en 2,5 μg/ml de DAPI diluido en PBS. Los cubreobjetos se montaron con un medio de montaje no fluorescente soluble en agua (Aqua- Poly/Mount; Polysciences Inc., Eppelheim, Alemania) en portaobjetos SuperFrost (VWR international). Antes del análisis de las muestras bajo un microscopio óptico, el medio de montaje se secó durante 24 horas a temperatura ambiente.

Resultados Para proporcionar una evidencia directa de la apoptosis inducida por 4-OH-tamoxifeno en clones MEF5/N9 que expresan proteínas de fusión Caspasa-8 o -9, se realizó una aplicación in situ del ensayo TUNEL. Este procedimiento detecta la fragmentación del ADN, uno de los casos tardíos que resultan de las cascadas de señalización apoptótica. Las células se sembraron en cubreobjetos y se incubaron con 4-OH-tamoxifeno a una concentración de 10-8 M. Dado que no existen datos generales de la cinética apoptótica hasta el momento, las células se fijaron en diferentes puntos temporales. Así, las células se incubaron con 4-OH-tamoxifeno durante 2, 3, 5 y 7 horas antes de la fijación en PFA al 4 % y se permeabilizaron en Metanol a -20 ºC. El ADN fragmentado se marcó mediante fluoresceína incorporada que fue reconocida mediante un anticuerpo anti-fluoresceína, conjugado con peroxidasa de rábano picante (POD). POD transforma el sustrato DAB en precipitados marrones insolubles que se pueden visualizar bajo un microscopio óptico. Las muestras se realizaron por duplicado y se documentaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioplan 2. Los núcleos se tiñeron adicionalmente con DAPI (A2-E2, A4-F4). Como control positivo sirvieron células MEF5/N9 de tipo silvestre que se incubaron con DNasa I para iniciar las roturas de la cadena de ADN. Estas células se tiñeron típicamente de color marrón oscuro (véase la Fig. 6 F1). Como control negativo sirvió una muestra incubada con fluoresceína y desoxinucleotidil transferasa terminal, pero que no se trató con POD (E1). Las células MEF5/N9 que expresan proteínas de fusión Cre-ER(T2) fueron TUNEL negativas en cualquier punto en el tiempo. Un resultado representativo se muestra en la Fig. 6 D1, D3, después de 7 horas de tratamiento con 4-OH-tamoxifeno. Las células TUNEL positivas, que expresan myrCasp8ER (Fig. 6 B3) y Casp9fullER (Fig. 6 C3), se pudieron detectar tan pronto como 3 horas después de la incubación con 4-OH- tamoxifeno. En contraste, la inducción de la apoptosis fue más lenta en las células que expresan proteínas de fusión Casp8ER. Las células M5N9 positivas TUNEL que expresan Casp8ER no podían ser visualizadas hasta 7 horas de tratamiento con 4-OH-tamoxifeno (Fig. 6 A3). Los tres clones positivos TUNEL exhibían la típica morfología apoptótica de burbujeo de la membrana, indicada por las flechas en Fig. 6 A3, B3, C3. Los precipitados de color ligeramente pardusco que aparecen en las muestras que no fueron tratadas con 4-OH-tamoxifeno son inespecíficos.

Ejemplo 5 Las transfecciones transitorias en células M5/N9 y HeLa se realizaron con reactivo de transfección FuGene (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, los cultivos semiconfluentes en una placa de 24 pocillos se transfectaron por triplicado con 112 ng del vector de expresión β-galactosidasa CMVβ (Invitrogen) y la misma cantidad de ADN de los plásmidos pCAG-Cre-ER(T2), pCAG-Casp8-ER(T2) o pCAG-Casp9-ER(T2). Después de 12 h se añadió 4-OH-tamoxifeno a una concentración de 10-8 M y los cultivos se lisaron a 48 h. La lisis celular y la medición de la actividad de β-galactosidasa por quimioluminiscencia se realizaron con el ensayo del gen reportero de β-galactosidasa (Roche) utilizando un luminómetro de placa Centro LB960 (Berthold).

Los fibroblastos Pac2 de pez cebra se cultivaron con L15 de Leibowitz con medio L-Glutamina suplementado con 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de Penicilina/Estreptomicina y 10 % de suero fetal bovino (todos de Gibco) a 28 ºC. Se transfectaron transitoriamente 3 x 106 células con los plásmidos CMVβ junto con CAG-CreER(T2), CAG- myrCasp8ER(T2) o CAG-Casp9ER(T2) (500 ng de cada uno) utilizando reactivo de transfección nanofectina (PAA).

El medio se sustituyó 24 horas después de la transfección y se acondicionó con 4-OH-tamoxifeno 10-8 M. Antes de la lisis, las células se incubaron durante otras 24 horas a 28 ºC.

Resultados Los autores de la invención examinaron los efectos de varias concentraciones 4-OHT y de 17-β-estradiol (E2), el ligando natural del receptor de estrógenos, en la inducción de muerte celular en células M5/N9 que expresan myrCasp8-ERT2 en comparación con células de control que expresan Cre-ER(T2). La viabilidad celular se determinó después de 48 horas de incubación con el ligando respectivo a concentraciones que varían desde 10-6 M a 10-12 M utilizando el ensayo MTT. 4-OHT a una concentración de 10-9 M redujo la viabilidad de células que expresan myrCasp8-ER(T2) en un 30 % y condujo a la muerte celular completa en 10-8 M o en mayor concentración (Fig. 7a). En contraste, las concentraciones de 10-7 M o superiores de E2 fueron requeridas para inducir la muerte celular en las células que expresan myrCasp8-ER(T2) (datos no mostrados). Este resultado mostró que la sensibilidad del dominio de unión al ligando ER(T2) mutante a 4-OHT, como se describe para la fusión con Cre recombinasa (Feil et al, Biochem Biophys Res Commun 237: 752-757 (1997)), es retenido en la proteína de fusión myrCasp8-ER(T2). Dado que la capacidad de respuesta del dominio ER(T2) a E2 es al menos 1.000 veces reducida en comparación con el receptor de estrógenos de tipo silvestre y el E2 endógeno no excede los niveles de 10-10 M, incluso en ratones hembra durante el embarazo (Bergman et al., Endocrinology 130: 1923-1930 (1992)), el sistema de Caspasa-ER(T2) parece estar correctamente aplicable in vivo.

Para definir si las proteínas de fusión del dominio de las Caspasas de murino y el ER(T2) humano inducen la apoptosis en células de vertebrados distintos de los ratones, los autores de la invención transfectaron transitoriamente vectores de expresión de Caspasa-ER(T2) o Cre-ER(T2) con un plásmido reportero β-galactosidasa en células HeLa humanas y células Pac2 del pez cebra (Chen y otros, J Virol 76: 2192-2198 (2002)). La actividad de β-galactosidasa cotransfectada con Cre-ER(T2) fue tomada como control positivo de la viabilidad celular y su declive como indicación de la muerte de las células cotransfectadas. Los niveles de actividad de β-Galactosidasa en células HeLa y Pac2 se redujeron en un 95-99 % para myrCasp8-ER(T2) y 91-93 % para Casp9-ER(T2) en presencia de 4- OHT y llegaron a los mismos valores obtenidos a partir de fibroblastos M5/N9 de murino (Fig. 7b). Por ello, las proteínas de fusión Caspasa de murino son ampliamente activas y pueden utilizarse para la apoptosis inducible en diversas vertebrados como el ratón, el pez cebra y los seres humanos.

Tomando ventaja de un dominio (ER(T2))de unión al ligando del receptor de estrógenos mutante, los autores de la invención han desarrollado proteínas de fusión Caspasa novedosas para la apoptosis inducible. Los autores de la invención han mostrado que las proteínas de fusión Caspasa-ER(T2) llegan a activarse específicamente por el ligando sintético 4-OH-tamoxifeno y rápidamente inducen la muerte celular apoptótica en células humanas, de murino y de pez cebra. Esta novedosa herramienta para la extirpación de células diana facilita en gran medida la generación de modelos de enfermedad, así como estudios de su desarrollo y regeneración en organismos modelo.

SECUENCIAS

ID de SEC Nº: 1 Descripción de Secuencia Artificial: vector pSS1

ID de SEC Nº: 4 y 5 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 4) codificante de la proteína de fusión

Cre-ER(T2) (ID de SEC Nº: 5)

ID de SEC Nº: 6 Descripción de Secuencia Artificial: cebador fas1ER-A

1 ATCCTTAATT AAATTCCACC ATGGGCTACC CCTACGACGT GCCCGACTAC GCCACCAGCA ATACAAACTG CAGG

ID de SEC Nº: 7 Descripción de Secuencia Artificial: cebador fasER-B

1 GGGTCGACCA GACATTGTCC TTCATTTTC

ID de SEC Nº: 8 Descripción de Secuencia Artificial: cebador fas2ER-A

ID de SEC Nº: 9 Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-HAFas-ER(T2)-bpA

ID de SEC Nº: 11 y 12 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 11) codificante de la proteína de fusión

HAFas-ER(T2) (ID de SEC Nº: 12)

ID de SEC Nº: 13 y 14 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 13) codificante de la proteína de fusión MFas-ER(T2) (ID de SEC Nº: 14)

ID de SEC Nº: 15 Descripción de Secuencia Artificial: cebador Casp8ER-A

1 CCTTAATTAA TTCCACCATG AGTGAGTCAC GGACTTCAG ID de SEC Nº: 16 Descripción de Secuencia Artificial: cebador Casp8ER-B 1 GGCTCGAGGG GAGGGAAGAA GAGCTTC ID de SEC Nº: 17

Descripción de Secuencia Artificial: cebador myrCasp8ER-A

ID de SEC Nº: 18 Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-Casp8-ER(T2)-bpA

ID de SEC Nº: 19 y 20 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 19) codificante de la proteína de fusión

Casp8-ER(T2) (ID de SEC Nº: 20)

ID de SEC Nº: 21Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-myrCasp8-ER(T2)

ID de SEC Nº: 22 y 23 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 22) codificante de la proteína de fusión

myrCasp8-ER(T2) (ID de SEC Nº: 23)

ID de SEC Nº: 24 Descripción de Secuencia Artificial: cebador Casp9fullER-A 1 CCTTAATTAA TTCCACCATG GACGAGGCGG ACCGGCAGC

ID de SEC Nº: 25 Descripción de Secuencia Artificial: cebador Casp9ER-B 1 GGCTCGACTG AAGTTTTAAA AAACAGC ID de SEC Nº: 26 Descripción de Secuencia Artificial: cebador Casp9truncER-A

1 CCTTAATTAA TTCCACCATG GGTCGGCAAG CAGCCAAGCA GG ID de SEC Nº: 27 Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-Casp9full-ER(T2)-bpA

ID de SEC Nº: 28 y 29 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 28) codificante de la proteína de fusión

Casp9full-ER(T2) (ID de SEC Nº: 29)

ID de SEC Nº: 31 y 32 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 31) codificante de la proteína de fusión

Casp9trunc-ER(T2) (ID de SEC Nº: 32)

ID de SEC Nº: 33 Descripción de Secuencia Artificial: cebador Casp3ER-A 1 CCTTAATTAA TTCCACCATG GAGAACAACA AAACCTC ID de SEC Nº: 34

Descripción de Secuencia Artificial: cebador Casp3ER-B 1 GGCTCGAGGT GATAAAAGTA CAGTTCTTTC ID de SEC Nº: 35 Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-Casp3-ER(T2)-bpA

ID de SEC Nº: 36 y 37 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 36) codificante del gen de fusión

Casp3-ER(T2) (ID de SEC Nº: 37)

ID de SEC Nº: 39 Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-Cre-ED4ER(T2)-bpA

ES 2 553 170 T3  

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 40 y 41 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 40) codificante del gen de fusión

Casp3-ED4ER(T2) (ID de SEC Nº: 41)

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 42 Descripción de Secuencia Artificial: cebador ED4ER-A

1 ACCTCGAGAG CCTGGCCTTG TCCCTGACG ID de SEC Nº: 43 Descripción de Secuencia Artificial: cebador ED4ER-B 1 TTCACTGGGT GCTCCATGGA GCG ID de SEC Nº: 44

Descripción de Secuencia Artificial: cebador BaxER-A 1 CCTTAATTAA TTCCACCATG GGCGACGGGT CCGGGGAGCA GCTT ID de SEC Nº: 45 Descripción de Secuencia Artificial: cebador BaxER-B 1 GGCTCGAGGC CCATCTTCTT CCAGATGG

ID de SEC Nº: 46

ES 2 553 170 T3   Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-Bax-ER(T2)-bpA

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 47 y 48 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN (ID de SEC Nº: 47) codificante del gen de fusión Bax-

ER(T2) (ID de SEC Nº: 48)

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 49 Descripción de Secuencia Artificial: cebador ERbax-1

1 CCTTAATTAA GTCTAGACCG ATATGAGCCT GGCCTTGTCC CTGAC ID de SEC Nº: 50 Descripción de Secuencia Artificial: cebador ERbax-2 1 AAGCTGCTCC CCGGACCCGT CAGCTGTGGC AGGGAAACCC T ID de SEC Nº: 51

Descripción de Secuencia Artificial: cebador ERbax-3 1 GACGGGTCCG GGGAGCAGCT T

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 52 Descripción de Secuencia Artificial: cebador ERbax-4 1 CAGTCGACTC TAGATCAGCC CATCTTCTTC CAGA ID de SEC Nº: 53

Descripción de Secuencia Artificial: vector pCAG-ER(T2)-Bax-bpA

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 54 y 55 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de ADN codificante de la proteína de fusión ER(T2)-Bax

ES 2 553 170 T3   ID de SEC Nº: 56Descripción de Secuencia Artificial: vector pCMV-β-gal-pA

ES 2 553 170 T3  

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 58 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 3, apoptosis relacionada con cisteína proteasa [Mus musculus]

ID de SEC Nº: 59 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 3 preproproteína [Homo sapiens]

ID de SEC Nº: 60 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 7 [Mus musculus]

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 61 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 7 isoforma delta [Homo sapiens]

ID de SEC Nº: 62 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 6 [Mus musculus]

ID de SEC Nº: 63 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de preproproteína de isoforma alfa de caspasa 6 [Homo sapiens]

ID de SEC Nº: 64 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 8 [Mus musculus]

ID de SEC Nº: 65

Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de precursor isoforma B de caspasa 8 [Homo sapiens]

ID de SEC Nº: 66

Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de preproproteína isoforma d de caspasa 10 [Homo sapiens]

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 67

Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 9 [Mus musculus]

ID de SEC Nº: 68 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 9 isoforma alfa preproproteína

[Homo sapiens]

ID de SEC Nº: 69 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 2 [Mus musculus]

ID de SEC Nº: 70 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 2 isoforma 1 preproproteína [Homo sapiens]

ID de SEC Nº: 71

ES 2 553 170 T3  

Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de caspasa 12 [Mus musculus]

ID de SEC Nº: 72

Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de receptor de Estrógenos de ratón (ER) (receptor Estradiol) (ER-alpha)1-599

ID de SEC Nº: 73 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de receptor de Estrógeno (ER) humano (receptor Estradiol) (ER-alfa)1-595

ID de SEC Nº: 74 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de forma B de receptor de progesterona - ratón 1-923

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 75 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de forma B de receptor de progesterona humana 1-933

ID de SEC Nº: 76 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de receptor de Glucocorticoides (GR) de ratón

ID de SEC Nº: 77 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de receptor de Glucocorticoides (GR) de humano

ID de SEC Nº: 78 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de receptor de andrógenos - ratón

ES 2 553 170 T3  

ID de SEC Nº: 79 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de receptor de andrógenos - humano

ID de SEC Nº: 80 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de LBD de mutante triple ER(T2) humano, 314

aa

ID de SEC Nº: 81 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de epítopo de hemaglutinina del virus de la

gripe, 9 aa 1 YPYDVPDYA ID de SEC Nº: 82 Descripción de Secuencia Artificial: secuencia de aminoácidos de la secuencia señal de miristoilación, 13 aa 1 GSSKSKPKDPSQR

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REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende (a) un dominio de Caspasa capaz de inducir apoptosis y (b) un dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormonas, en el que el dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormonas es activado después de la unión de un ligando al dominio de unión a ligando del receptor nuclear.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, a) en donde después de la exposición a un ligando del dominio de unión a ligando de un receptor nuclear de hormona, la proteína de fusión es capaz de inducir apoptosis en un célula, preferiblemente una célula eucariota, que expresa la proteína de fusión; y/o b) en donde el dominio de Caspasa es una Caspasa seleccionada del grupo que consiste en Caspasa-2, Caspasa-3, Caspasa-6, Caspasa-7, Caspasa-8, Caspasa-9, Caspasa-10, Caspasa-12, lo más preferiblemente Caspasa-8 o Caspasa-9; y/o c) en donde el receptor nuclear de hormonas se selecciona del grupo que consiste en un receptor de estrógenos, un receptor de progesterona, un receptor de glucocorticoides, un receptor de andrógenos, y/o d) en donde el dominio de unión del ligando del receptor nuclear de hormonas está ligado al N-terminal o C- terminal del dominio de Caspasa, preferiblemente en donde el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas está ligado al C-terminal del dominio de Caspasa; y/o e) en donde el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas está ligado al dominio de Caspasa directamente.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, a) en donde Caspasa es una Caspasa de mamífero, murino o humano, seleccionada del grupo que consiste en Caspasa-2, Caspasa-3, Caspasa-6, Caspasa-7, Caspasa-8, Caspasa-9, Caspasa-10, Caspasa-12, lo más preferiblemente Caspasa-8 o Caspasa-9; y/o b) en donde el dominio de Caspasa comprende o consiste en secuencia de aminoácido de ID de SEC nº 64, ID de SEC nº 65, ID de SEC nº 67 o ID de SEC nº 68.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 2, a) en donde el receptor nuclear de hormonas es un receptor de estrógenos, y/o b) en donde el receptor es un receptor nuclear de hormonas de mamífero o de humano seleccionado del grupo que consiste en un receptor de estrógenos, un receptor de progesterona, un receptor de glucocorticoides, un receptor de andrógenos y un receptor de estrógenos ER(T2) mutante como se define en la ID de SEC Nº 80.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o 4, en donde el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas está ligado al dominio de Caspasa mediante un enlazador, preferiblemente a) en donde el enlazador consiste en 1 a 100 restos de aminoácidos, especialmente, que consisten esencialmente en aminoácidos neutros; y/o b) en donde el enlazador comprende una parte de secuencias de dominio D y F del receptor nuclear de hormonas que flanquea al dominio de unión al ligando.

6. La proteína de fusión de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en ID de SEC nº 20, ID de SEC nº 23, ID de SEC nº 29, ID de SEC nº 32 o ID de SEC nº 37.

7. Un ácido nucleico codificante de la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Una célula que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 y/o el vector de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Un procedimiento para producir la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende - cultivar la célula de acuerdo con la reivindicación 9 en condiciones propicias para la producción de la proteína de fusión.

11. Un organismo transgénico no humano, preferiblemente un mamífero transgénico no humano o un pez cebra, que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 o el vector de acuerdo con la reivindicación 8.

12. Uso de la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la inducción mediante ligando de apoptosis de una célula, preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero o una célula de pez cebra, especialmente una célula humana, en donde el uso no implica un

ES 2 553 170 T3   procedimiento terapéutico y/o diagnóstico.

13. Uso de la reivindicación 12 para estudiar la función de una célula, tejido y/u órgano, particularmente para estudiar la función de una célula en varias etapas de su desarrollo o como un modelo de enfermedad.

14. Un procedimiento in vitro para inducir apoptosis de una célula que expresa una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el procedimiento - poner en contacto el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas de la célula con un ligando capaz de inducir apoptosis de la célula.

15. Un procedimiento in vitro para identificar un ligando para un dominio de unión al ligando de un receptor nuclear de hormonas o una variante funcionalmente activa del mismo, comprendiendo el procedimiento - poner en contacto el dominio de unión al ligando del receptor nuclear de hormonas de la célula de acuerdo con la reivindicación 9 con una sustancia; y - identificar la sustancia como un ligando, dependiendo de su capacidad para inducir la apoptosis de la célula.

16. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, el vector de acuerdo con la reivindicación 8 y/o una célula de acuerdo con la reivindicación 9 para uso como un medicamento.

17. La proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, el vector de acuerdo con la reivindicación 8 y/o una célula de acuerdo con la reivindicación 9 para uso el tratamiento de una enfermedad que requiere el aumento de la apoptosis, particularmente para el tratamiento del cáncer o durante o después de un trasplante, particularmente como un mecanismo de seguridad.

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