Método para producir una proteína de fusión de glucoproteína vi-Fc.

Un método para obtener una proteína de fusión soluble Fc-GPVI-nt que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7

, el método comprende expresar la proteína de fusión Fc-GPVI-n que consiste en una secuencia de aminoácidos de la Figura 7 en células HELA usando un sistema de expresión adenoviral.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06023943.

Solicitante: advanceCor GmbH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Fraunhoferstrasse 17 82152 Martinsried ALEMANIA.

Inventor/es: MASSBERG, STEFFEN, GAWAZ, MEINRAD, UNGERER, MARTIN, PELUSO, MARIO, BÜLTMANN,ANDREAS, MÜNCH,GÖTZ.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/62 (Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/28 (contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K19/00 (Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas   solamente de inmoglobulinas C07K 16/46))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por los... > A61K47/48 (estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/55 (que tienen ciclos con siete eslabones, p. ej. azelastina, pentilentetrazol)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Medicamentos para el tratamiento de trastornos de... > A61P7/02 (Agentes antitrombóticos; Anticoagulantes; Inhibidores de la agregación plaquetaria)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares... > Compuestos heterocíclicos que contienen ciclos de... > C07D223/16 (Benzacepinas; Benzacepinas hidrogenadas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/745 (Factores de coagulación sanguínea o de fibrinolisis)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/4035 (Isoindoles, p. ej. ftalimida)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/86 (en los que interviene el tiempo de coagulación de la sangre)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares... > Compuestos heterocíclicos que contienen isoquinoleína... > C07D217/02 (con sólo átomos de hidrógeno o radicales que contienen solamente átomos de carbono o hidrógeno unidos directamente a los átomos de carbono de los ciclos que contienen nitrógeno; Alquileno-disoquinoleínas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen ingredientes... > A61K31/4704 (2-Quinolonas, p. ej. carboestirilo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares... > Compuestos heterocíclicos que contienen ciclos de... > C07D209/44 (Isoindoles; Isoindoles hidrogenados)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Medicamentos para el tratamiento de trastornos del... > A61P25/36 (de los opiáceos)

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Fragmento de la descripción:

Método para producir una proteína de fusión de glucoproteína vi-Fc

La presente invención se refiere a un método para obtener una proteína de fusión de Fc-GPVI-nt soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de la Fig. 7.

Los síndromes coronarios o carotídeos agudos son una de las principales causas de muerte en las sociedades occidentales. Incluso en caso de supervivencia a dicho suceso cardiovascular, muchos pacientes padecen complicaciones que amenazan la vida, tales como trombosis intravascular, que conducen a posteriores infartos de miocardio o ictus.

La trombosis intravascular es el resultado de la agregación plaquetaria en un vaso por lo que el flujo sanguíneo en el vaso puede verse seriamente reducido o incluso inhibirse por completo. Específicamente, la rotura de una placa aterosclerótica inicia una cascada de sucesos que culminan en trombosis arterial e isquemia del tejido aguas abajo, precipitando enfermedades tales como el infarto de miocardio o el accidente cerebrovascular isquémico. La primera respuesta al daño vascular es la adhesión de plaquetas circulantes a las proteínas expuestas de la matriz subendotelial, lo que desencadena posteriormente la agregación plaquetaria. Entre los componentes macromoleculares de la capa subendotelial, el colágeno fibrilar está considerado el constituyente más trombogénico, ya que actúa como un fuerte activador de las plaquetas y mantiene la adhesión de las plaquetas tanto in vitro como in vivo (1-3).

La proteínas de la membrana de las plaquetas, que se ha comunicado que son receptores de colágeno putativos, pueden dividirse en las que interactúan indirectamente con colágeno a través de factor de von Willebrand unido a colágeno (vWf), que incluye GPIba y la integrina anbp3, y las que interactúan directamente con colágeno que incluyen GPVI, la integrina a2Pi, y CD36 (revisado en (2)). Solo recientemente, se ha identificado a la glucoproteína de plaquetas VI (GPVI) como el principal receptor de colágeno en plaquetas (4). GPVI es una glucoproteína transmembrana de tipo I de 60-65 kDa, que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (5;6). En plaquetas humanas y de ratón, GPVI forma un complejo con la cadena y de FcR en la superficie celular (7;8). La unión del ligando a GPVI desencadena la fosforilación de tirosina del motivo ITAM de la cadena g del receptor Fe iniciando la señalización aguas abajo por medio de las cinasas Syk, LAT, SLP-76, y fosfolipasa C (9-13). Las plaquetas deficientes en GPVI muestran una pérdida de adhesión y agregación inducida por colágeno in vitro (4; 14). Del mismo modo, los anticuerpos monoclonales anti-GPVI que bloquean la función atenúan la agregación plaquetaria ex vivo en respuesta al colágeno y al péptido relacionado con colágeno CRP, que imita a la triple hélice del colágeno (15; 16).

Se sabe que el problema de las complicaciones debidas a la agregación de las plaquetas puede abordarse administrando inhibidores de la agregación plaquetaria. Para el tratamiento de los síndromes coronarios agudos, los inhibidores de GP llb/llla tales como el ReoPro mejoran significativamente el desenlace de los pacientes. Sin embargo, un metaanálisis reciente de ensayos clínicos reveló un riesgo remanente significativo de muerte o infarto de miocardio a pesar de una intervención antitrombótica óptima (Boersma E, Harrington RA, Moliterno DJ, White H, Theroux P, Van de Werf F, de Torbal A, Armstrong PW, Wallentin LC, Wilcox RG, Simes J, Califf RM, Topol EJ, Simoons ML. Platelet glycoprotein llb/llla inhibitors in acute coronary syndromes: a meta-analysis of all major randomised clinical triáis. Lancet 2002; 359:189-98): Los efectos secundarios de este régimen terapéutico son complicaciones de sangrado. Estas ocurrieron en el 2,4 % de los pacientes ocurriendo la forma más grave de sangrado intracraneal en aproximadamente el 0,1 % de los pacientes tratados. Se ha puesto de manifiesto que varias deficiencias mecánicas del bloqueo de los receptores GP llb / Illa explican la efectividad y los efectos secundarios subóptimos (Dickfeld T, Ruf A, Pogatsa-Murray G, Mullerl, Engel-mann B, Taubitz W, Fischer J, Meier O, Gawaz M. Differential antiplatelet effeets of various glycoprotein llb-llla antagonists. Thromb Res. 2001;101:53-64. Gawaz M, Neumann FJ, Schomig A. Evaluation of platelet membrane glycoproteins in coronary artery disease: consequences for diagnosis and therapy. Circulation. 1999;99:E1-E11).

La inhibición de la agregación plaquetaria conduce a un deterioro general de las plaquetas respecto de su capacidad para agregarse. Por consiguiente, no solo se influencia la formación de trombosis no deseada, sino también la capacidad general de las plaquetas para frenar el sangrado. Por lo tanto, la administración de inhibidores de la agregación plaquetaria conduce inherentemente a graves efectos secundarios, tales como sangrados, que pueden causar complicaciones potencialmente mortales adicionales. Por supuesto, estos efectos secundarios son más problemáticos en pacientes que padecen diabetes.

La diabetes es uno de los principales factores de riesgo para la ateroesclerosis. La diabetes constituye además un riesgo aumentado de complicaciones potencialmente mortales y un exceso de morbilidad en pacientes que presentan síndromes vasculares y especialmente coronarios agudos. Los pacientes diabéticos con angina inestable presentan una mayor incidencia de ulceración de la placa y de trombosis intracoronaria en comparación con pacientes no diabéticos. (Biondo-Zoccai GGL; Abbate A; Liuzzo G, Biasucci L: Atherothrombosis, ¡nflammation, and diabetes. J Am Coll Cardiol 41; 1071-1077; 2003).

Cada vez se reconoce más que las plaquetas son un activador principal para la progresión de la aterosclerosis. La relación entre el aumento de la ateroprogreslón y la respuesta aumentada de las plaquetas y la diabetes es hasta ahora un problema sin resolver. Los pacientes diabéticos padecen complicaciones vasculares agudas independientes del grado de aterosclerosis, lo que es Indicativo de diferentes mecanismos actualmente desconocidos de activación de plaquetas en el desarrollo de complicaciones vasculares agudas diabéticas y complicaciones vasculares agudas aterosclerótlcas.

Por lo tanto, el problema de la invención es proporcionar un método para obtener un medicamento que sea útil para evitar complicaciones potenclalmente mortales posteriores a un síndrome coronario o carotfdeo agudo a la vez que se mantiene la potencia homeostática de la sangre.

Es un problema adicional de la presente Invención proporcionar un método para obtener un medicamento para el tratamiento o prevención de la ateroprogreslón.

También es un problema de la invención proporcionar un método para obtener un medicamento para el tratamiento de la diabetes, en particular para las complicaciones asociadas con diabetes.

Descripción general de la invención

Los problemas anteriores se resuelven de acuerdo con las reivindicaciones. La presente invención proporciona la primera prueba in vivo directa que indica que GPVI es de hecho estrictamente necesaria en el proceso de reclutamiento de plaquetas sometidas a estrés de corte después de una lesión vascular. En distintos modelos murinos de denudación endotelial tanto la inhibición como la ausencia de GPVI anuló virtualmente las interacciones entre plaquetas-pared del vaso y la agregación plaquetaria, lo que identifica a GPVI como el determinante principal de la formación trombos arteriales. Esto indica que la inhibición de las interacciones GPVI-ligando impiden la trombosis arterial en el establecimiento de la ateroesclerosis. La presente invención usa el potencial antitrombótico de una forma específica soluble de GPVI. Específicamente, se proporciona un proceso para obtener... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para obtener una proteína de fusión soluble Fc-GPVI-nt que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 7, el método comprende expresar la proteína de fusión Fc-GPVI-n que consiste en una secuencia de aminoácidos de la Figura 7 en células FIELA usando un sistema de expresión adenoviral.

2. El método de reivindicación 1, donde la proteína de fusión se obtiene como una proteína dimérica.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el adenovirus comprende una secuencia de ácidos nuclélcos de la Figura 8.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende las siguientes etapas:

(a) recoger 2 días después de la infección los sobrenadantes de cultivo de células FIELA infectadas con adenovirus para Fc-GPVI-nt que codifica una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la figura 7;

(b) centrifugar (3800 g, 30 mln, 4 °C) el sobrenadante de la etapa (a);

(c) filtrar (0,45 urn) el sobrenadante de la etapa (b);

(d) precipitar la inmunoadhesina por adición de 1 vol. de sulfato de amonio (761 g/l) y agitar durante toda la noche a 4 °C;

(e) precipitando las proteínas por centrifugación (3000 g, 30 min, 4°C);

(f) disolviendo las proteínas precipitadas de la etapa (e) en 0,1 Vol de PBS y dializando en PBS durante toda la

noche a 4°C;

(g) aclarar la solución de proteína por centrifugación (3000 g, 30 min, 4°C);

(h) cargar la solución de la etapa (g) en una columna de proteína A (HiTrap proteína A HP, Amersham

Pharmacia Biotech AB, Upsala, Suecia);

(i) lavar la columna con tampón de unión (tampón de fosfato de sodio 20 mM a pH 7,0, NaN3 al 0,02 %) hasta

DO280 <0,01 ¡

(k) eluir las fracciones con tampón de elución (glicina 100 mM a pH 2,7);

(l) neutralizando las fracciones eluidas con tampón de neutralización (Tris/HC11 M a pH 9,0, NaN3 al 0,02 %);

(m) agrupar las fracciones;

(n) dializar las fracciones agrupadas en PBS durante toda la noche a 4°C;

(o) preparar alícuotas del producto dializado y congelando a -20 °C.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende obtener la proteína de fusión y dispersar el polvo liofilizado que contiene la proteína de fusión en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable.

6. El método de la reivindicación 5 que comprende formular la proteína de fusión en una composición farmacéutica para la administración parenteral.