Métodos y composiciones para producir hidrocarburos.

Método de producción de un aldehído graso o alcohol graso, comprendiendo el método

(i) producir en una célula huésped un polipéptido que comprende

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

66, 70, 74, 76, 78, 80 u 82, en el que el polipéptido tiene actividad reductasa, o

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70% de identidad con SEQ ID NO: 66, 70, 74, 76, 78, 80 u 82, en el que el polipéptido tiene actividad reductasa, o

(c) la secuencia de aminoácidos definida en (b) con una o más sustituciones de aminoácidos conservativas, y

(ii) aislar el aldehído graso o alcohol graso de la célula huésped,

en el que la célula huésped se modifica genéticamente para expresar el polipéptido.

Métodos y composiciones para producir hidrocarburos

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/53.955, presentada el 16 de mayo de 28.

Antecedentes de la invención

El petróleo es un recurso natural limitado que se encuentra en la Tierra en formas líquida, gaseosa o sólida. El petróleo está compuesto principalmente por hidrocarburos, que están compuestos principalmente de carbono e hidrógeno. También contiene cantidades significativas de otros elementos, tales como nitrógeno, oxígeno o azufre, en diferentes formas.

El petróleo es un recurso valioso, aunque los productos del petróleo se desarrollan a considerables costes, tanto financieros como medioambientales. En primer lugar, deben descubrirse fuentes de petróleo. La exploración de petróleo es una empresa cara y arriesgada. El coste de exploración de pozos de aguas profundas puede exceder los 1 millones de dólares. Además, no hay ninguna garantía de que estos pozos contengan petróleo. Se estima que sólo el 4% de los pozos perforados conducen a pozos productores que generan hidrocarburos comerciales. Además del coste económico, la exploración de petróleo conlleva un alto coste medioambiental. Por ejemplo, la exploración mar adentro altera los entornos marinos circundantes.

Tras descubrirse un pozo productor, el petróleo debe extraerse de la tierra con gran coste. Durante la recuperación primaria, la presión natural subterránea es suficiente para extraer aproximadamente el 2% del petróleo en el pozo. A medida que esta presión natural desciende, se emplean métodos de recuperación secundarios, si son económicos. Generalmente, la recuperación secundaria implica aumentarla presión del pozo mediante, por ejemplo, inyección de agua, inyección de gas natural o levantamiento porgas. Usando métodos de recuperación secundarios, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Una vez que se agotan los métodos de recuperación secundarios, pueden usarse métodos de recuperación terciarios, si son económicos. Los métodos terciarios implican reducir la viscosidad del petróleo para hacer que sea más fácil de extraer. Usando métodos de recuperación terciarios, se recupera de un 5% a un 15% adicional de petróleo. Por tanto, incluso en las mejoras circunstancias, sólo puede extraerse el 5% del petróleo en un pozo. La extracción de petróleo también conlleva un coste medioambiental. Por ejemplo, la extracción de petróleo puede dar como resultado grandes fugas de petróleo que emerge a la superficie. Además, la perforación mar adentro implica dragar el lecho marino, lo que altera o destruye el entorno marino circundante.

Puesto que los depósitos de petróleo no se encuentran uniformemente por toda la Tierra, el petróleo debe transportarse a lo largo de grandes distancias desde regiones productoras de petróleo hasta regiones consumidoras de petróleo. Además de los costes de transporte, hay también el riesgo medioambiental de derrames de petróleo devastadores.

En su forma natural, el petróleo crudo extraído de la Tierra tiene pocos usos comerciales. Es una mezcla de hidrocarburos (por ejemplo, parafinas (o aléanos), olefinas (o alquenos), alquinos, ñafíenos (o cicloalcanos), compuestos alifáticos, compuestos aromáticos, etc.) de longitud y complejidad variables. Además, el petróleo crudo contiene otros compuestos orgánicos (por ejemplo, compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.)e impurezas (por ejemplo, azufre, sal, ácido, metales, etc.).

Por tanto, el petróleo crudo debe refinarse y purificarse antes de que pueda usarse comercialmente. Debido a su alta densidad de energía y su fácil transportabilidad, la mayoría del petróleo se refina en combustibles, tales como combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diésel, combustible de aviación, etc.), gasóleo de calefacción, gas licuado de petróleo, etc.

El petróleo crudo es también una fuente primaria de materiales de partida para producir productos petroquímicos. Las dos clases principales de materiales de partida derivados del petróleo son olefinas de cadena corta (por ejemplo, etileno y propileno) y compuesto aromáticos (por ejemplo, isómeros de xileno y benceno). Estos materiales de partida se derivan de hidrocarburos de cadena más larga en petróleo crudo sometiéndolo a craqueo con un gasto considerable usando una variedad de métodos, tales como craqueo catalítico, craqueo con vapor o reformación catalítica. Estos materiales de partida se usan para producir productos petroquímicos, que no pueden refinarse directamente del petróleo crudo, tales como monómeros, disolventes, detergentes o adhesivos.

Un ejemplo de un material de partida derivado de petróleo crudo es etileno. Se usa etileno para producir productos petroquímicos, tales como polietileno, etanol, óxido de etileno, etilenglicol, poliéster, glicol éter, etoxilato, acetato de vinilo, 1,2-dicloroetano, tricloroetileno, tetracloroetileno, cloruro de vinilo y poli(cloruro de vinilo). Un ejemplo adicional de un material de partida es propileno, que se usa para producir alcohol isopropílico, acrilonitrilo, polipropileno, óxido de propileno, propilenglicol, glicol éteres, butileno, isobutileno, 1,3-butadieno, elastómeros sintéticos, poliolefinas, alfa-olefinas, alcoholes grasos, ácido acrílico, polímeros acrílicos, cloruro de alilo, epiclorohidrina y resinas epoxídicas.

Estos productos petroquímicos pueden usarse entonces para producir productos químicos especializados, tales como plásticos, resinas, fibras, elastómeros, productos farmacéuticos, lubricantes o geles. Productos químicos especializados particulares que pueden producirse a partir de materiales de partida petroquímicos son: ácidos grasos, hidrocarburos (por ejemplo, de cadena larga, de cadena ramificada, saturados, insaturados, etc.), alcoholes grasos, ásteres, aldehidos grasos, cetonas, lubricantes, etc.

Los productos químicos especializados tienen muchos usos comerciales. Los ácidos grasos se usan comercialmente como tensioactivos, por ejemplo, en detergentes y jabones. También pueden usarse como aditivos en combustibles, aceites lubricantes, pinturas, lacas, velas, aceite para ensaladas, mantequilla, cosméticos y emulsionantes. Además, los ácidos grasos se usan como activadores aceleradores en productos de caucho. Los ácidos grasos también pueden usarse como materia prima para producir ásteres metílicos, amidas, aminas, cloruros de ácido, anhídridos, dímeros de ceteno, y peroxiácidos y ásteres.

Los hidrocarburos tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, se usan aléanos de cadena más corta como combustibles. El metano y el etano son los principales constituyentes del gas natural. Se usan aléanos de cadena más larga (por ejemplo, de desde cinco hasta dieciséis carbonos) como combustibles de transporte (por ejemplo, gasolina, diésel o combustible de aviación). Los aléanos que tienen más de dieciséis átomos de carbono son componentes importantes de gasóleos y aceites lubricantes. Pueden usarse aléanos incluso más largos, que son sólidos a temperatura ambiente, por ejemplo, como cera de parafina. Los aléanos que contienen aproximadamente treinta y cinco carbonos se encuentran en alquitrán, que se usa para la pavimentación de carreteras. Además, pueden someterse a craqueo aléanos de cadena más larga para producir hidrocarburos de cadena más corta útiles comercialmente.

Como los aléanos de cadena corta, los alquenos de cadena corta se usan en combustibles de transporte. Se usan alquenos de cadena más larga en plásticos, lubricantes y lubricantes sintéticos. Además, se usan alquenos como materia prima para producir alcoholes, ásteres, plastificantes, tensioactivos, aminas terciarias, agentes de recuperación de petróleo potenciada, ácidos grasos, tioles, anhídridos alquenilsuccínicos, epóxidos, aléanos clorados, alquenos clorados, ceras, aditivos para combustibles y reductores del flujo por arrastre.

Los alcoholes grasos tienen muchos usos comerciales. Los alcoholes grasos de cadena más corta se usan en las industrias alimentaria y cosmética como emulsionantes, emolientes y espesantes. Debido a su naturaleza anfífila, los alcoholes grasos se comportan como tensioactivos no iónicos, que son útiles como detergentes. Además, los alcoholes grasos se usan en ceras, gomas, resinas, lociones y bálsamos farmacéuticos, aditivos para aceites lubricantes, agentes de acabado y antiestéticos textiles, plastificantes, cosméticos, disolventes industriales y disolventes para grasas.

Los ásteres tienen muchos usos comerciales. Por ejemplo, el biodiésel, un combustible alternativo, está compuesto de ásteres (por ejemplo, áster metílico de ácidos grasos,... [Seguir leyendo]

Método de producción de un aldehido graso o alcohol graso, comprendiendo el método

(i) producir en una célula huésped un polipéptido que comprende

(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 7, 74, 76, 78, 8 u 82, en el que el polipéptido tiene actividad reductasa, o

(b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 7% de identidad con SEQ ID NO: 66, 7, 74, 76, 78, 8 u 82, en el que el polipéptido tiene actividad reductasa, o

(c) la secuencia de aminoácidos definida en (b) con una o más sustituciones de aminoácidos conservativas, y

(ii) aislar el aldehido graso o alcohol graso de la célula huésped,

en el que la célula huésped se modifica genéticamente para expresar el polipéptido.

Método de producción de un aldehido graso o alcohol graso, comprendiendo el método (I) expresar en una célula huésped un polinucleótido que comprende

(a) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 7% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, en el que la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa, o

(b) un polinucleótido que hibrida con un complemento de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID. NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, o con un fragmento del mismo, en el que el polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa, y

(¡I) aislar el aldehido graso o alcohol graso de la célula huésped,

en el que la célula huésped se modifica genéticamente para expresar el polinucleótido.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el polipéptido o el polinucleótido es de una cianobacteria.

Método de producción de un aldehido graso o alcohol graso, comprendiendo el método transformar una célula huésped con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 7% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, y aislar el aldehido graso o alcohol graso de la célula huésped, preferiblemente el vector recombinante comprende además un promotor operativamente unido a la secuencia de nucleótidos, en el que la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula de mamífero, célula de planta, célula de insecto, célula de levadura, célula de hongo, célula de hongos filamentosos y célula bacteriana.

Método según la reivindicación 5, en el que la célula huésped es una célula de E. coli, preferiblemente la célula de E. coli es una célula de E. coli de cepa B, una de cepa C, una de cepa K o una de cepa W.

Método según la reivindicación 4, en el que la célula huésped produce un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos del vector recombinante.

Método según la reivindicación 5, en el que el aldehido graso o alcohol graso se secreta por la célula huésped.

Método según la reivindicación 8, en el que el aldehido graso (a) comprende un aldehido C13-C21, o (b) se selecciona del grupo que consiste en tetradecanal, hexadecanal, hexadecenal, octadecanal, octadecenal, metiltetradecanal, metiltetradecenal, metilhexadecanal, metilhexadecenal, metiloctadecanal y metiloctadecenal.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además cultivar la célula huésped en presencia de al menos un sustrato biológico para el polipéptido o para un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos.

Método según la reivindicación 1, en el que el sustrato es un derivado de ácido graso, preferiblemente un derivado de ácido graso Ci4-C22-

13.

14.

16.

17.

18.

19. 25

21.

22.

23.

Método según la reivindicación 1, en el que el derivado de ácido graso se selecciona del grupo que consiste en tetradecanoil-ACP, hexadecanoil-ACP, hexadecenoil-ACP, octadecenoil-ACP, y sus derivados.

Microorganismo modificado genéticamente que comprende una secuencia de control exógena incorporada de manera estable en el ADN genómico del microorganismo en el sentido de 5 de un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 7% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, en el que el microorganismo produce un nivel aumentado de un aldehido graso o alcohol graso en relación con un microorganismo silvestre.

Microorganismo según la reivindicación 13, en el que el microorganismo es una cianobacteria.

Método de producción de un aldehido graso o alcohol graso, comprendiendo el método cultivar el microorganismo según la reivindicación 13 en condiciones adecuadas para la expresión génica.

Cultivo de célula huésped que comprende un aldehido graso o alcohol graso producido mediante uno cualquiera de los métodos según las reivindicaciones 1-12 y 15, en el que el aldehido o alcohol tiene una 813C de -15,4 o más y/o una ím14C de al menos 1,3, en el que la célula huésped es un microorganismo modificado genéticamente según la reivindicación 13 ó 14.

Método de preparación de un aldehido graso o alcohol graso, que comprende poner en contacto un sustrato con (i) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de ID NO: 66, 7, 74, 76, 78, 8 u 82, en el que el polipéptido tiene actividad reductasa, o (ii) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 7% de identidad con SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, en el que el polipéptido tiene actividad reductasa.

Método según la reivindicación 17, en el que el aldehido graso comprende (a) un aldehido C13-C21, o (b) se selecciona del grupo que consiste en tetradecanal, hexadecanal, hexadecenal, octadecanal, octadecenal, metiltetradecanal, metiltetradecenal, metilhexadecanal, metilhexadecenal, metiloctadecanal y metiloctadecenal.

Método según la reivindicación 18(b), en el que el sustrato se selecciona del grupo que consiste en tetradecanoil-ACP, hexadecanoil-ACP, hexadecenoil-ACP, octadecenoil-ACP, y sus derivados.

Método de producción de un alcohol graso, comprendiendo el método

(¡1) producir en una célula huésped un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 7, 74, 76, 78, 8 u 82, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 7% de identidad con SEQ ID NO: 66, 7, 74, 76, 78, 8 u 82, en el que la célula huésped se modifica genéticamente para expresar dicho polipéptido y en el que el polipéptido tiene actividad reductasa

o

(¡2) expresar en una célula huésped un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 7% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, en el que la célula huésped se modifica genéticamente para expresar dicho polinucleótido y en el que el polinucleótido codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa,

o

(¡3) transformar una célula huésped con un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 7% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, en el que la secuencia de nucleótidos codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa, y

(ii) aislar el alcohol graso de la célula huésped.

Método según la reivindicación 2, que comprende además expresar un gen que codifica para una alcohol deshidrogenasa recombinante en la célula huésped.

Método según la reivindicación 21, en el que el alcohol graso se secreta por la célula huésped.

Método según la reivindicación 21, en el que el alcohol graso

(a) comprende un alcohol graso C6-C26,

(b) es 1-decanol, 1-dodecanol, alcohol 1-miristílico, 1-hexadecanol, octadecenol, tetradecenol o hexadecenol,

(c) comprende un alcohol graso de cadena lineal,

(d) comprende un alcohol graso de cadena ramificada,

(e) comprende un resto cíclico,

(f) es un alcohol graso ¡nsaturado,

(g) es un alcohol graso monoinsaturado, o

(h) es un alcohol graso saturado.

24. Célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico aislado que consiste en

(a) no más de 5 nucleótidos de SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81, o

(b) no más del 9% de los nucleótidos de SEQ ID NO: 65, 69, 73, 75, 77, 79 u 81,

en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido que cataliza la conversión de sustrato en producto de acil ACP en un aldehido graso y se produce un aldehido graso o un alcohol graso 1 por dicha célula huésped recombinante.

25. Célula huésped recombinante según la reivindicación 24, en la que dicha secuencia de ácido nucleico aislada codifica para un polipéptido que consiste en

(a) no más de 2 aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 7, 74, 76, 78, 8 u 82, o

(b) no más del 9% de los aminoácidos de SEQ ID NO: 66, 7, 74, 76, 78, 8 u 82.

26. Célula huésped recombinante según las reivindicaciones 24 ó 25, en la que la secuencia de ácido nucleico

codifica para un polipéptido que tiene actividad reductasa o en la que el polipéptido tiene actividad reductasa, respectivamente.