Composiciones y métodos para producir enterocinasa en la levadura.

Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2011/061334.

Solicitante: ALLERGAN, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2525 DUPONT DRIVE IRVINE, CA 92612 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: FOTHERINGHAM, IAN, SHEFFIELD,PETER J.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/06 (preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/64 (que provienen de tejido animal, p. ej. renina)
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Composiciones y métodos para producir enterocinasa en la levadura.

Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para producir enterocinasa en la levadura Esta solicitud reivindica la prioridad en conformidad con 35 U.S.C. § 119(e) para la solicitud de patente provisional de los EE. UU. nº 61/416.622, registrada el 23 de noviembre de 2010.

La enterocinasa (EK, también denominada enteropeptidasa [EP]; EC 3.4.21.9) es una glucoproteína heterodimérica producida por las células del duodeno. Forma parte de la familia de serina proteasas de la quimotripsina, la secretan las glándulas intestinales (las criptas de Lieberkühn) tras la entrada de la comida ingerida una vez que sale del estómago, y está presente en el duodeno y en la mucosa del yeyuno. La EK está implicada en la digestión de las proteínas de la dieta y cataliza la escisión de un fragmento peptídico ácido del extremo amino del tripsinógeno, lo que convierte este zimógeno en su forma activa, la tripsina. La activación de la tripsina inicia una cascada de reacciones proteolíticas que conducen a la activación de muchos zimógenos pancreáticos, entre ellos el quimotripsinógeno, la proelastasa, las procarboxipeptidasas y algunas prolipasas.

La enterocinasa se ha clonado de varios mamíferos, entre ellos, p. ej., humanos, ganado vacuno, ratas y ratones. Desde el punto de vista estructural, la EK es una serina proteasa que comprende una cadena pesada de aproximadamente 82-140 kDa que ancla la enterocinasa en la membrana de las microvellosidades intestinales y una cadena ligera de aproximadamente 35-62 kDa que contiene la subunidad catalítica. La cadena ligera se une a la cadena pesada a través de un único puente disulfuro. Además de este único puente disulfuro entre dominios, la cadena ligera contiene ocho restos más de cisteína que se ha visto que forman enlaces disulfuro específicos intradominio. La cadena ligera de la enterocinasa contiene la actividad catalítica y es suficiente para la escisión. La EK y los fragmentos catalíticamente activos de la misma son muy específicos para la secuencia pentapeptídica Asp- Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID nº 1), que escinde el enlace escindible localizado después del resto de lisina (DDDDK↓).

Debido a su gran especificidad, se ha utilizado la EK como un reactivo adecuado en aplicaciones bioquímicas y biotecnológicas. Por ejemplo, una proteína de fusión que contiene una etiqueta para purificación en el extremo carboxilo (tal como poli-His) unida por esta secuencia mediante el sitio de escisión de la EK puede ser escindida por la EK para retirar la etiqueta para purificación y así obtener la proteína deseada después de la purificación de la proteína. Como alternativa, la prosecuencia del extremo amino de las proteasas que se tiene que escindir antes de la activación se puede mutar para permitir la activación con la enterocinasa.

La enterocinasa recombinante (rEK) se ha producido con éxito tanto en las bacterias de tipo Escherichia coli como en las levaduras de tipo Pichia pastoris utilizando un gen que produce una proteína de 28 kDa que abarca solo el dominio catalítico de la cadena ligera. Sin embargo, siguen existiendo dificultades con respecto a la expresión de esta enzima recombinante con un rendimiento suficiente para las aplicaciones comerciales. La presente memoria descriptiva mejoró la construcción de expresión útil para producir la enterocinasa recombinante de una manera rentable y en cantidades útiles para las aplicaciones comerciales.

COMPENDIO

Los aspectos de la presente especificación describen moléculas de polinucleótidos que codifican la enterocinasa. Las moléculas de polinucleótidos descritas que codifican la enterocinasa incluyen, sin limitación, la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de las mismas, una variante truncada de las mismas y/o un complemento de las mismas. Un polinucleótido descrito en la presente memoria puede además comprender un vector de expresión para levaduras. Otros aspectos describen una construcción de expresión para levaduras que comprende un vector de expresión para levaduras y una molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa.

Otros aspectos de la presente especificación describen células de levadura que comprenden una construcción de expresión para levaduras que incluye una molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa. Las construcciones de expresión para levaduras descritas podrían estar contenidas transitoriamente en una célula de levadura o podrían estar contenidas establemente en la célula de levadura. Una célula de levadura incluye, sin limitación, una célula de una cepa de Pichia pastoris, una célula de una cepa de Pichia methanolica, una célula de una cepa de Pichia angusta, una célula de una cepa de Schizosaccharomyces pombe, una célula de una cepa de Saccharomyces cerevisiae o una célula de una cepa de Yarrowia lipolytica.

Aún otros aspectos de la presente especificación describen métodos para producir una enterocinasa que utilizan una construcción de expresión para levaduras. Los métodos descritos comprenden la etapa de expresar en una célula de levadura una construcción de expresión para levaduras descrita en la presente memoria. Otro aspecto da a conocer métodos para producir una enterocinasa que comprenden las etapas de introducir una construcción de expresión para levaduras descrita en la presente memoria en una célula de levadura y expresar la construcción de expresión en la célula de levadura.

Otros aspectos ma de la presente especificación describen métodos para escindir un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la enterocinasa mediante el uso de una enterocinasa. Los métodos descritos comprenden la etapa de poner en contacto el polipéptido que incluye un sitio de escisión para la enterocinasa con una enterocinasa, en donde poner en contacto el polipéptido con la enterocinasa da lugar a una escisión específica por el sitio de escisión de la enterocinasa. La enterocinasa utilizada puede ser una codificada por una molécula polinucleotídica descrita en la presente memoria, producida mediante el uso de una construcción de expresión para levaduras descrita en la presente memoria y/o producida mediante la expresión en una célula de levadura descrita en la presente memoria.

Otros aspectos de la presente especificación describen métodos para preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la enterocinasa mediante el uso de una enterocinasa. Los métodos descritos comprenden la etapa de poner en contacto el polipéptido que incluye un sitio de escisión para la enterocinasa con una enterocinasa, en donde poner en contacto el polipéptido con la enterocinasa da lugar a una escisión específica por el sitio de escisión de la enterocinasa. La enterocinasa utilizada puede ser una codificada por una molécula polinucleotídica descrita en la presente memoria, producida mediante el uso de una construcción de expresión para levaduras descrita en la presente memoria y/o producida mediante la expresión en una célula de levadura descrita en la presente memoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un gráfico de la actividad enzimática media de la enterocinasa producida en seis líneas celulares de levadura diferentes que comprenden un casete de EK integrado según se describe en la presente memoria.

DESCRIPCIÓN

Los sistemas de expresión para levaduras ofrecen varias ventajas como sistemas de producción para un polipéptido heterólogo. Primero, las células de levadura pueden crecer hasta alcanzar una biomasa elevada (>300 g/l de peso celular húmedo) en los fermentadores, lo que proporciona cultivos densos para producir grandes cantidades del polipéptido deseado. Segundo, a diferencia de los sistemas de expresión procariotas, los sistemas de expresión para levaduras pueden controlar correctamente el plegamiento postraduccional y otras modificaciones específicas de un polipéptido eucariota, lo que garantiza que se retendrá la actividad biológica, la función y la estabilidad del polipéptido heterólogo. Tercero, los sistemas de expresión para levaduras son versátiles y flexibles, lo que ofrece 1) expresión desde el genoma o extracromosómica; 2) control de la expresión constitutivo o inducible, y 3) la capacidad para dirigir el polipéptido heterológo expresado a compartimentos celulares o extracelulares específicos para facilitar su aislamiento y su purificación.

La presente especificación describe la mejora de la construcción de expresión útil para producir la enterocinasa recombinante de una manera rentable y en cantidades suficientemente grandes para ser útiles para las aplicaciones comerciales. Estos resultados se pueden conseguir con el uso de cualquiera de las moléculas polinucleotídicas modificadas genéticamente que se describen y que codifican la enterocinasa. Una vez clonadas en un vector de expresión para levaduras e introducidas en una célula de levadura, ya es entonces posible que estas moléculas modificadas genéticamente sean capaces de producir una cantidad significativamente más elevada de enterocinasa.

Así pues, los aspectos de la presente especificación dan a conocer, en parte, una molécula de polinucleótido. Una molécula de polinucleótido descrita en la presente memoria puede ser ADN monocatenario o bicatenario aislado del genoma de un organismo, un ADNc producido mediante la tecnología recombinante, o una molécula de ADN sintetizada químicamente. Además, una molécula polinucleotídica «aislada» está típicamente en su mayor parte libre de otros materiales celulares cuando se aísla de una fuente genómica o se produce mediante técnicas recombinantes, o está en su mayor parte libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente.

Los aspectos de la presente especificación dan a conocer, en parte, una molécula de polinucleótido que codifica la enterocinasa. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «enterocinasa» es sinónimo de «EK» y hace referencia a cualquier polipéptido que se puede reconocer selectivamente y que es capaz de escindir por la secuencia pentapeptídica Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID nº 1) en el enlace escindible localizado después del resto de lisina (DDDDK↓). Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «reconocer selectivamente y escindir», cuando se realiza en referencia a una enterocinasa, hace referencia a la interacción discriminatoria de una enterocinasa con una molécula que comprende la SEQ ID nº 1 y la escisión del enlace escindible localizado después del resto lisina de la SEQ ID nº 1, aunque no interaccione sustancialmente con otra secuencia pentapeptídica localizada en la molécula ni escinda cualquier otra secuencia pentapeptídica localizada en la molécula. Propiamente dicho, enterocinasa hace referencia a la glucoproteína heterodimérica nativa que comprende una cadena pesada de aproximadamente 82-140 kDa y una cadena ligera de aproximadamente 35-62 unidas mediante un único puente disulfuro, así como cualquier fragmento de cadena ligera catalíticamente activo. En los ejemplos 1, 2, y 4-6 se describen ejemplos de fabricación de una molécula polinucleotídica que codifica una enterocinasa.

Una molécula polinucleotídica que codifica una enterocinasa puede ser la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas. Tal y como se usa en la presente memoria, el término «complemento» hace referencia a una molécula polinucleotídica que es la molécula antisentido de la molécula sentido que codifica la enterocinasa. Una molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede incluir regiones polinucleotídicas que codifican otros tipos de moléculas polipeptídicas, tales como, p. ej., etiquetas de purificación, señales de secreción celular y/o señales de localización subcelular. Una molécula polinucleotídica de ejemplo de tal clase es la SEQ ID nº 6. Una molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa también puede incluir regiones polinucleotídicas reguladoras o de control que dirigen o facilitan, p. ej., aspectos de la transcripción, de la traducción y/o del procesamiento postraduccional.

En otro aspecto descrito en la presente memoria, una molécula polinucleotídica que codifica una enterocinasa puede ser una variante nucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6 o un complemento de las mismas, siempre y cuando el cambio de nucleótido en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas, no altere la secuencia aminoacídica de la enterocinasa codificada por la variante polinucleotídica. Propiamiente dicho, una variante polinucleotídica de SEQ ID nº 4 descrita en la presente memoria codifica la enterocinasa de la SEQ ID nº 5 y una variante polinucleotídica de SEQ ID nº 6 descrita en la presente memoria codifica la enterocinasa de la SEQ ID nº 7.

Tal molécula variante polinucleotídica descrita que codifica la enterocinasa puede ser, p. ej., idéntica al menos al 70%, al menos al 75%, al menos al 80%, al menos al 85%, al menos al 90%, al menos al 91%, al menos al 92%, al menos al 93%, al menos al 94%, al menos al 95%, al menos al 96%, al menos al 97%, al menos al 98%, o al menos al 99%, a la secuencia polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas.

Otra molécula variante polinucleotídica descrita que codifica la enterocinasa puede tener, p. ej. de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos no contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas. Aún en otros aspectos de esta realización, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede tener, p. ej. de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

Cualquiera de una serie de métodos de alineamiento de secuencias se puede utilizar para determinar el porcentaje de identidad de un polinucleótido o polipéptido descrito en la presente memoria que incluye, sin limitación, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, p. ej., métodos con estrategia de segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son métodos convencionales dentro del alcance de un experto en la técnica y a partir de las enseñanzas de esta memoria.

Los métodos globales alinean secuencias desde el comienzo hasta el final de la molécula y determinan el mejor alineamiento mediante la adición de las puntuaciones de cada pareja de restos y la imposición de penalizaciones por los huecos. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., CLUSTAL W, véase, p. ej., Julie D. Thompson et al., «CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice», 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y el refinamiento iterativo, véase, p. ej., Osamu Gotoh, «Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments», 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996).

Los métodos locales alinean secuencias mediante la identificación de uno o varios motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., Match-box, véase, p. ej., Eric Deplereux y Ernest Feytmans, «Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences», 8(5) CABIOS 501-509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, p. ej., C. E. Lawrence et al., «Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment», 262(5131) Science 208- 214 (1993); Align-M, véase, p. ej., Ivo Van Walle et al., «Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences», 20(9) Bioinformatics, 1428-1435 (2004).

Los métodos híbridos combinan aspectos funcionales de los métodos de alineamiento globales y locales. Los métodos no limitantes incluyen, p. ej., la comparación segmento a segmento, véase, p. ej., Burkhard Morgenstern et al., «Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-Segment Comparison», 93(22) Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996); T-Coffee, véase, p. ej., Cédric Notredame et al., «T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment», 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000); MUSCLE, véase, p. ej., RobertC. Edgar, «MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput», 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004); y DIALIGN-T, véase, p. ej., Amarendran R Subramanian et al., «DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment», 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005).

En otros aspectos más de esta descripción, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede ser una variante polinucleotídica que se hibrida a una molécula polinucleotídica que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas, en condiciones rigurosas. Tales condiciones de hibridación rigurosas las conocen los expertos en la técnica y se pueden encontrar en, p. ej., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, incorporado en su totalidad por referencia. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación rigurosas (p. ej., rigor elevado) son la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 6x a aproximadamente 45 ºC seguido por uno o varios lavados en SSC a 0,2x, SDS al 0,1% a 50- 65 ºC.

Aún en otros aspectos de esta descripción, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede ser una variante polinucleotídica descrita en la tabla 1. Esta tabla incluye la secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la enterocinasa, los codones que comprenden el marco abierto de lectura de la región polinucleotídica de la SEQ ID nº 4 y de la SEQ ID nº 6 que codifica este fragmento de cadena ligera, y las variantes codónicas que pueden sustituir a los codones de la SEQ ID nº 4 y de la SEQ ID nº 6. En aspectos de esta descripción, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 codones variantes de la tabla 1 sustituyendo a los correspondientes codones presentes en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6. En otros aspectos de esta descripción, una molécula de la variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 1 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8, como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19 o como mucho 20 codones variantes de la tabla 1 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S D S R E G A W Codón ATA GTT GGC GGC TCT GAC TCC AGA GAA GGT GCC TGG Variante ATT - GGT GGT - GAT TCT - - GGA GCT - ATC GGA GGA Aminoácido P W V V A L Y F D D Q Q Codón CCA TGG GTC GTT GCC TTA TAC TTT GAT GAT CAA CAG Variante CCT - GTT - GCT TTG TAT - - - - CAA Aminoácido V C G A S L V S R D W L Codón GTC TGT GGT GCT TCA CTT GTT TCT AGA GAT TGG TTG Variante GTT - GGA - TCT TTG - - - - - - Aminoácido V S A A H C V Y G R N M Codón GTG TCC GCA GCA CAT TGT GTG TAT GGT AGG AAT ATG Variante GTT TCT GCT GCT - - GTT TAC GGA AGA CAA -

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S D S R E G A W Aminoácido E P S K W K A V L G L H Codón GAG CCT TCA AAG TGG AAA GCT GTA TTG GGG TTG CAT Variante GAA CCA TCT - - AAG - GTT - GGT - - GGA Aminoácido M A S N L T S P Q I E T Codón ATG GCC TCT AAC CTT ACA AGT CCA CAA ATT GAA ACT Variante - GCT - - TTG ACT TCT CCT - ATC - - Aminoácido R L I D Q I V I N P H Y Codón AGA CTA ATT GAT CAA ATT GTT ATC AAT CCT CAT TAC Variante - TTG ATC - - ATC - ATT AAC CCA - - Aminoácido N K R R K N N D I A M M Codón AAT AAG CGT AGG AAA AAC AAT GAC ATA GCA ATG ATG ATT Variante AAC - AGA AGA AAG - AAC GAT ATC GCT - - Aminoácido H L E M K V N Y T D Y I Codón CAC TTG GAG ATG AAA GTT AAC TAC ACA GAC TAC ATC Variante CAT - GAA - AAG - - - ACT GAT - ATT Aminoácido Q P I C L P E E N Q V F Codón CAA CCA ATA TGT TTG CCT GAG GAA AAT CAG GTG TTC ATT Variante - CCT - - CCA GAA - AAC CAA GTT TTT ATC

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S D S R E G A W Aminoácido P P G R I C S I A G W G Codón CCA CCT GGT CGT ATT TGT AGT ATT GCT GGA TGG GGA Variante CCT CCA GGA AGA ATC - TCT ATC - GGT - GGT Aminoácido A L I Y Q G S T A D V L Codón GCC CTG ATC TAC CAA GGA TCT ACC GCT GAC GTA TTA Variante GCT TTG ATT - - GGT - ACT - GAT GTT TTG Aminoácido Q E A D V P L L S N E K Codón CAA GAG GCA GAT GTT CCT CTG CTG TCC AAC GAG AAA Variante - GAA GCT - - CCA TTG TTG TCT - GAA AAG Aminoácido C Q Q Q M P E Y N I T E Codón TGC CAG CAA CAA ATG CCA GAA TAC AAC ATC ACT GAA Variante - CAA - - - CCT - - - ATT - - Aminoácido N M V C A G Y E A G G V Codón AAC ATG GTT TGT GCT GGT TAT GAA GCT GGA GGT GTA Variante - - - - - GGA TAC - - GGT GGA GTT Aminoácido D S C Q G D S G G P L M Codón GAT TCA TGC CAG GGA GAT TCA GGC GGT CCT CTA ATG GGT Variante - TCT - CAA GGT - TCT GGA GGA CCA TTG - Aminoácido C Q E N N R W L L A G V

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S D S R E G A W Codón TGC CAG GAG AAT AAC CGA TGG TTG CTT GCT GGT GTA Variante - CAA GAA AAC - AGA - - TTG - GGA GTT Aminoácido T S F G Y Q C A L P N R Codón ACG AGT TTT GGA TAT CAA TGC GCT TTA CCT AAC CGT Variante ACT TCT - GGT TAC - - - TTG CCA - AGA Aminoácido P G V Y A R V P R F T E Codón CCA GGG GTC TAT GCA AGA GTC CCA AGA TTC ACC GAG GGT Variante CCT GTT TAC GCT - GTT CCT - TTT ACT GAA GGA Aminoácido W I Q S F L H * Codón TGG ATT CAA TCT TTT CTG CAC TGA Variante - ATC - - - TTG CAT TAA En otros aspectos, una molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede ser una variante de polinucleótido descrita en la tabla 2. Esta tabla incluye la secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la enterocinasa, los codones comprenden el marco abierto de lectura de la región polinucleotídica de SEQ ID nº 4 y SEQ ID nº 6 que codifica este fragmento de cadena ligera, y las variantes codónicas que pueden sustituir a los codones de SEQ ID nº 4 y SEQ ID nº 6. En aspectos, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo a los correspondientes codones presentes en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6. En otros aspectos, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6. En otros aspectos, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8, como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19 o como mucho 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

Tabla 2. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S D S R E G A W Codón ATA GTT GGC GGC TCT GAC TCC AGA GAA GGT GCC TGG Variante ATT - GGT GGT - GAT TCT - - - GCT - Aminoácido P W V V A L Y F D D Q Q Codón CCA TGG GTC GTT GCC TTA TAC TTT GAT GAT CAA CAG Variante - - GTT - GCT TTG TAT - - - - CAA Aminoácido V C G A S L V S R D W L Codón GTC TGT GGT GCT TCA CTT GTT TCT AGA GAT TGG TTG Variante GTT - - - TCT TTG - - - - - - Aminoácido V S A A H C V Y G R N M Codón GTG TCC GCA GCA CAT TGT GTG TAT GGT AGG AAT ATG Variante GTT TCT GCT GCT - - GTT TAC - AGA CAA - Aminoácido E P S K W K A V L G L H Codón GAG CCT TCA AAG TGG AAA GCT GTA TTG GGG TTG CAT Variante GAA CCA TCT - - AAG - GTT - GGT - - Aminoácido M A S N L T S P Q I E T Codón ATG GCC TCT AAC CTT ACA AGT CCA CAA ATT GAA ACT Variante - GCT - - TTG ACT TCT - - - - - Aminoácido R L I D Q I V I N P H Y

Tabla 2. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Codón AGA CTA ATT GAT CAA ATT GTT ATC AAT CCT CAT TAC Variante - TTG - - - - - ATT AAC CCA - - Aminoácido N K R R K N N D I A M M Codón AAT AAG CGT AGG AAA AAC AAT GAC ATA GCA ATG ATG Variante AAC - AGA AGA AAG - AAC GAT ATT GCT - - Aminoácido H L E M K V N Y T D Y I Codón CAC TTG GAG ATG AAA GTT AAC TAC ACA GAC TAC ATC Variante CAT - GAA - AAG - - - ACT GAT - ATT Aminoácido Q P I C L P E E N Q V F Codón CAA CCA ATA TGT TTG CCT GAG GAA AAT CAG GTG TTC Variante - - ATT - - CCA GAA - AAC CAA GTT TTT Aminoácido P P G R I C S I A G W G Codón CCA CCT GGT CGT ATT TGT AGT ATT GCT GGA TGG GGA Variante - CCA - AGA - - TCT - - GGT - GGT Aminoácido A L I Y Q G S T A D V L Codón GCC CTG ATC TAC CAA GGA TCT ACC GCT GAC GTA TTA Variante GCT TTG ATT - - GGT - ACT - GAT GTT TTG Aminoácido Q E A D V P L L S N E K Codón CAA GAG GCA GAT GTT CCT CTG CTG TCC AAC GAG AAA Variante - GAA GCT - - CCA TTG TTG TCT - GAA AAG

Tabla 2. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido C Q Q Q M P E Y N I T E Codón TGC CAG CAA CAA ATG CCA GAA TAC AAC ATC ACT GAA Variante - CAA - - - - - - - ATT - - Aminoácido N M V C A G Y E A G G V Codón AAC ATG GTT TGT GCT GGT TAT GAA GCT GGA GGT GTA Variante - - - - - - TAC - - GGT - GTT Aminoácido D S C Q G D S G G P L M Codón GAT TCA TGC CAG GGA GAT TCA GGC GGT CCT CTA ATG Variante - TCT - CAA GGT - TCT GGT - CCA TTG - Aminoácido C Q E N N R W L L A G V Codón TGC CAG GAG AAT AAC CGA TGG TTG CTT GCT GGT GTA Variante - CAA GAA AAC - AGA - - TTG - - GTT Aminoácido T S F G Y Q C A L P N R Codón ACG AGT TTT GGA TAT CAA TGC GCT TTA CCT AAC CGT Variante ACT TCT - GGT TAC - - - TTG CCA - AGA Aminoácido P G V Y A R V P R F T E Codón CCA GGG GTC TAT GCA AGA GTC CCA AGA TTC ACC GAG Variante - GGT GTT TAC GCT - GTT - - TTT ACT GAA Aminoácido W I Q S F L H *

Tabla 2. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Codón TGG ATT CAA TCT TTT CTG CAC TGA Variante - - - - - TTG CAT TAA Aún en otro aspecto, la molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede ser un fragmento truncado de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o una variante nucleotídica de las mismas. Tal y como se emplea en esta memoria, la terminología «fragmento truncado» de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o cualquier variante nucleotídica de las mismas, hace referencia a la retirada de nucleótidos de la secuencia de 710 nucleótidos representada por la SEQ ID nº 4, o una variante nucleotídica de la misma, o la secuencia de 953 nucleótidos representada por la SEQ ID nº 6, o una variante nucleotídica de la misma. Los nucleótidos del extremo 5', del extremo 3' o bien tanto del extremo 5' como del extremo 3' de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, se pueden retirar.

En algunos aspectos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 3' y desde el extremo 5', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. En otros aspectos de esta realización, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, o al menos 50 nucleótidos se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. Aún en otros aspectos de esta realización, como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8, como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19,como mucho 20, como mucho 25, como mucho 30, como mucho 35, como mucho 40, como mucho 45 o como mucho 50 nucleótidos se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas.

En otros aspectos,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 codones se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. En otros aspectos de esta realización, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. Aún en otros aspectos de esta realización, como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8, como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19 o como mucho 20 codones se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, una molécula polinucleotídica que comprende un vector de expresión para levaduras. Se puede emplear un amplia gama de vectores de expresión para levaduras para expresar una molécula polinucleotídica que codifica la EK, entre ellas, sin limitación, un vector de expresión para Pichia pastoris, un vector de expresión para Pichia methanolica, un vector de expresión para Pichia angusta, un vector de expresión para Schizosaccharomyces pombe, un vector de expresión para Saccharomyces cerevisiae y un vector de expresión para Yarrowia lipolytica. Ejemplos no limitantes de los vectores de expresión para levaduras incluyen un vector de expresión pGal-MF (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), un vector de expresión pMET (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un vector de expresión PICHIAPINK (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un vector de expresión pPICZ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un vector de expresión pPpT4Alpha (Ingenza, Ltd., Midlothian, GB), un vector de expresión pTEF-MF (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), un vector de expresión pYES (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA).

Un vector de expresión para levaduras incluye típicamente regiones polinucleotídicas de control o reguladoras que dirigen o facilitan, p. ej., aspectos de la replicación, de la integración, de la transcripción, de la traducción y/o del procesamiento postraduccional. Por ejemplo, un vector de expresión para levaduras puede incluir un promotor constitutivo y elementos potenciadores y/o un promotor inducible y elementos potenciadores utilizados para dirigir la expresión de la EK. Un ejemplo no limitante de un vector de expresión constitutivo es uno que emplea un promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) para dirigir la producción de la EK. Un ejemplo no limitante de un vector de expresión inducible es uno que utiliza un promotor de la aldehído oxidasa 1 (AOX1), con metanol como inductor. En cualquier caso, se pueden conseguir niveles altos de la expresión, de hasta varios gramos por litro, del producto obtenido. Por ejemplo, en las células de levadura inducidas con metanol, la AOX1 puede representar el 30% de la proteína soluble total. Las cepas que carecen del gen AOX1 (también denominadas cepas MutS) se pueden seguir induciendo con metanol, ya que expresan el gen de la alcohol oxidasa 2 (AOX2), pero crecen más despacio que las cepas de tipo silvestre cuando se utiliza metanol como única fuente de carbono. Sin embargo, en vez de utilizar la energía y los recursos principalmente para la producción de la proteína AOX1, en las cepas MutS la fuerza del promotor de AOX1 se puede dirigir principalmente hacia la producción de la proteína recombinante. Además, se puede aplicar una concentración de metanol más baja.

Un vector de expresión para levaduras puede incluir regiones polinucleotídicas que codifican otros tipos de moléculas polipeptídicas, tales como, p. ej., etiquetas de purificación, señales de secreción celular y/o señales de localización subcelular. Tales regiones polinucleotídicas están normalmente operativamente unidas a la EK en forma de un polipéptido de fusión. Los ejemplos no limitantes de etiquetas de purificación incluyen una etiqueta de histidinas, una etiqueta myc, una etiqueta V5. Los ejemplos no limitantes de secuencias señal incluyen las que dirigen la EK al citoplasma celular, un orgánulo celular, tal como el peroxisoma, o al medio de cultivo extracelular. Por ejemplo, la inclusión de la señal peptídica del factor α permite la secreción de la EK en el medio de cultivo.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, una molécula polinucleotídica que comprende una construcción de expresión para levaduras. Una construcción de expresión para levaduras comprende una molécula polinucleotídica que codifica la EK como se describe en la presente memoria operativamente unida a un vector de expresión para levaduras según se describe en la presente memoria. Los ejemplos de una construcción de expresión para levaduras se describen en los ejemplos 2 y 4 a 6.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, introducir en una célula de levadura una molécula polinucleotídica descrita en la presente memoria. Una molécula polinucleotídica introducida en una célula se puede mantener transitoriamente o de forma estable en esa célula. Las moléculas polinucleotídicas mantenidas establemente pueden ser extracromosómicas y se pueden replicar de forma autónoma, o pueden integrarse en el material cromosómico de la célula y replicarse de forma no autónoma.

Se contempla la posible utilización de todos y cada uno de los métodos para introducir una molécula polinucleotídica descrita en la presente memoria en una célula. Los métodos útiles para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula incluyen, sin limitación, la transfección mediada por un compuesto químico tal como, por ejemplo, mediada por fosfato de calcio, mediada por dietilaminoetil (DEAE) dextrano, mediada por lípido, mediada por polietilenimina (PEI), mediada por polilisina y mediada por polibreno; transfección por medios físicos, tal como, p. ej., introducción biolística de partículas, microinyección, fusión de protoplastos y electroporación; y transfección mediada por virus, tal como, p. ej., transfección mediada por retrovirus. El experto en la técnica sabe que la selección de un método específico para introducir una construcción de expresión en una célula dependerá, en parte, de si la célula contendrá de forma transitoria una construcción de expresión o de si la célula contendrá de forma estable una construcción de expresión. Estos protocolos son métodos corrientes dentro del alcance del experto en la técnica y de las enseñanzas de la presente memoria, véase, p. ej., «Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells», págs. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, vol. 3, 3.ª ed. 2001). Los ejemplos para introducir una construcción de expresión para levaduras descrita en la presente memoria en una célula de levadura se describen en los ejemplos 2 y 4 a 6.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, una célula de levadura que comprende una construcción de expresión para levaduras que incluye una molécula polinucleotídica que codifica la EK tal y como se describe en la presente memoria. En un aspecto de esta realización, una célula de levadura contiene transitoriamente una construcción de expresión para levaduras que incluye una molécula polinucleotídica que codifica la EK como se describe en la presente memoria. En otro aspecto de esta realización, una célula de levadura contiene establemente una construcción de expresión que incluye una molécula polinucleotídica que codifica la EK tal y como se describe en la presente memoria. En aspectos de esta realización, una célula de levadura es una cepa de la células de levadura procedente de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae o Yarrowia lipolytica. En otros aspectos de esta realización, una construcción de expresión para levaduras es un vector de expresión para Pichia pastoris, un vector de expresión para Pichia methanolica, un vector de expresión para Pichia angusta, un vector de expresión para Schizosaccharomyces pombe, un vector de expresión para Saccharomyces cerevisiae o un vector de expresión para Yarrowia lipolytica. Aún en otros aspectos de esta realización, la molécula polinucleotídica que codifica la EK es la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, o cualquier variante nucleotídica de las mismas, o un complemento de las mismas.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, la expresión de una EK desde una molécula polinucleotídica descrita en la presente memoria mediante el uso de un sistema de expresión para levaduras. La expresión de una molécula polinucleotídica mediante un sistema de expresión para levaduras puede incluir cualquiera de una serie de características que incluyen, sin limitación, expresión inducible, expresión no inducible, expresión constitutiva, expresión mediada por virus, expresión por integración estable y expresión transitoria. Estos protocolos son métodos corrientes perfectamente dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas de esta memoria. Los ejemplos no limitantes de los sistemas de expresión para levaduras incluyen un kit de expresión para Pichia EASYSELECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un kit de expresión para Pichia EASYSELEC™ ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un sistema de expresión para Pichia methanolica (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un kit de proteínas secretadas PICHIAPINK™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un kit de vector de expresión YES-ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y un sistema de expresión para S. pombe

SPECTRA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Los ejemplos para expresar una EK desde una molécula polinucleotídica descrita en la presente memoria mediante un sistema de expresión para levaduras se describen en los ejemplos 2 a 6.

En una realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, está incrementada en comparación con la cantidad de la EK expresada desde la SEQ ID nº 2.

En aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de la misma, está incrementada en torno a, p. ej., al menos 0,5 veces, al menos 1 vez, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces o al menos 40 veces, en comparación con la cantidad de la EK expresada desde la SEQ ID nº 2. En otros aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de la misma, está incrementada en torno a, p. ej., de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 15 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 20 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, en comparación con la cantidad de EK expresada desde la SEQ ID nº 2.

En otros aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, es de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 30 g/l. En aspectos de esta realización, la cantidad de la EK expresada desde una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, puede ser, p. ej., al menos 100 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1 g/l, al menos 1,5 g/l, al menos 2,5 g/l, al menos 5 g/l, al menos 7,5 g/l, al menos 10 g/l, al menos 12,5 g/l, al menos 15 g/l, al menos 20 g/l, al menos 25 g/ o al menos 30 g/l. En otros aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, puede ser, p. ej., de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 500 mg/l a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 500 mg/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 500 mg/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 20 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 20 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 25 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 30 g/l.

Una EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras descrita en la presente memoria se puede purificar de la célula de levadura o del medio de cultivo mediante cualquiera de una sierie de métodos. Los ejemplos de los métodos de purificación incluyen, sin limitación, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de lectina, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacciones hidrófobas, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de adsorción, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía líquida de resolución rápida (FLPC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los restos de fijación del péptido diana de interés se pueden unir a cualquiera de una serie de sustancias que incluyen, sin limitación, resinas, agarosa y perlas magnéticas. Además, se puede utilizar cualquiera de una serie de técnicas de procesamiento, entre ellas, sin limitación, el procesamiento por lotes, y columnas de alimentación por gravedad. Las etapas de replegamiento de las proteínas también pueden ser necesarias para asegurar la recuperación de una BoNT/A funcionalmente activa codificada por las moléculas de ácido nucleico descritas en la especificación. Ejemplos no limitantes de protocolos específicos para purificar y recuperar las proteínas se describen en, p. ej., John Abelson et al., «GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION», (Academic Press, 1990), «PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE», (Robert K. Scopes et al. eds., Springer Verlag, 3.ª ed. 1994), «PROTEIN PURIFICATION TECHNIQUES: A PRACTICAL APPROACH», (Simon Roe ed., Oxford University Press, 2.ª ed. 2001),«MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL», véase más arriba, (2001), Iran M. Rosenberg, «PROTEIN ANALYSIS & PURIFICATION: BENCHTOP TECHNIQUES», (Springer Verlag, 2002). Estos protocolos son métodos corrientes dentro del alcance de un experto en la técnica y a partir de las enseñanzas de esta memoria.

Las cantidades de EK se pueden medir durante la expresión de la EK, después de completar la expresión de la EK y/o después de la purificación de la EK utilizando cualquiera de una serie de métodos. Los ejemplos de los métodos de medición de proteínas incluyen, sin limitación, la electroforesis en gel y la tinción de proteínas, análisis de inmunotransferencia, ELISA, marcación con proteínas, absorbancia UV, el análisis de Lowry, el análisis de Biuret, el análisis de cobre/bicinconínico de Smith (BCA) y el análisis del colorante de Bradford, véase, p. ej., Christine V. Sapan et al., «Colorimetric Protein Assay Techniques», 29(2) BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM. 99-108, (1999).

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, métodos para escindir un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK mediante el uso de una EK. En una realización, un método para escindir un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK incluye la etapa de poner en contacto el polipéptido que incluye un sitio de escisión para la EK, la EK producida mediante la expresión de una construcción de expresión para levaduras que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, cualquier variante polinucleotídica de las mismas, o cualquier variante truncada de las mismas, en la célula de levadura, en donde poner en contacto el polipéptido recombinante con la enterocinasa da lugar a una escisión específica por el sitio de escisión para la EK. En un aspecto de esta realización, el sitio de escisión para la EK es la SEQ ID nº 1. El polipéptido puede ser uno que tiene de forma natural un sitio de escisión de la EK o puede ser un polipéptido recombinante que está modificado genéticamente para contener un sitio de escisión de la EK.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, métodos para preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK mediante el uso de una EK. En una realización, un método para preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK incluye la etapa de poner en contacto el polipéptido que incluye un sitio de escisión para la EK, la EK producida por la expresión de una construcción de expresión para levaduras que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, cualquier variante polinucleotídica de las mismas, o cualquier variante truncada de las mismas, en la célula de levadura, en donde poner en contacto el polipéptido recombinante con la enterocinasa da lugar a una escisión específica por el sitio de escisión para la EK. En un aspecto de esta realización, el sitio de escisión para la EK es la SEQ ID nº 1. El polipéptido puede ser uno que tiene de forma natural un sitio de escisión para la EK o puede ser un polipéptido recombinante que está modificado genéticamente para contener un sitio de escisión de la EK.

Los métodos para utilizar la EK para escindir o preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión de la EK se pueden realizar mediante un análisis estándar de escisión proteolítica in vitro. Por ejemplo, un polipéptido que comprende un sitio de escisión de EK se puede añadir a una mezcla de reacción que comprende Tris-HCl a 20 mM (pH 7,4), NaCl a 50 mM, CaCl2 a 20 mM y una EK producida tal y como se describe en la presente memoria, y se puede incubar de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 ºC durante de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 16 horas. Así pues, el grado de escisión o de preparación del polipéptido producido se puede valorar mediante métodos estándares, tales como, p. ej., análisis de SDS-PAGE, un inmunoensayo como el análisis de inmunotransferencia o ELISA, o un ensayo de actividad para el polipéptido. El polipéptido preparado o escindido también se puede purificar mediante métodos estándares. Los ensayos útiles para escindir o preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión de EK se describen en, p. ej., Ogiwara et al., Modified Enteropeptidase Protein, patente de los EE. UU. US 8.013.137; La Vallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, patente de los EE. UU. US 6.746.859, cada uno incorporado en su totalidad mediante referencia.

Los aspectos de la presente especificación también se pueden describir como sigue: 1. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, una variante polinucleotídica de las mismas, o una variante truncada de las mismas, y cualquier complemento de las mismas.

2. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica es idéntica al menos al 70%, al menos al 75%, al menos al 80%, al menos al 85%, al menos al 90%, al menos al 91%, al menos al 92%, al menos al 93%, al menos al 94%, al menos al 95%, al menos al 96%, al menos al 97%, al menos al 98% o al menos al 99% a la secuencia polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas.

3. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos no contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

4. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos contiguos respecto a la SEQ ID nº4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

5. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica se hibrida a una molécula polinucleotídica que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas, en una condición rigurosa.

6. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 1 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

7. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

8. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante truncada tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, o al menos 50 nucleótidos retirados desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de cualquier complemento de las mismas.

9. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante truncada tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones retirados desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas.

10. La molécula polinucleotídica aislada de las realizaciones 1 a 9, en donde la molécula polinucleotídica aislada es un vector de expresión para levaduras.

11. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 10, en donde el vector de expresión para levaduras es un vector de expresión para Pichia pastoris, un vector de expresión para Pichia methanolica, un vector de expresión para Pichia angusta, un vector de expresión para Schizosaccharomyces pombe, un vector de expresión para Saccharomyces cerevisiae y un vector de expresión para Yarrowia lipolytica.

12. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 10 u 11, en donde el vector de expresión para levaduras incluye un promotor constitutivo, un potenciador constitutivo, un promotor inducible, un potenciador inducible o cualquier combinación de los mismos, que dirige la expresión de la molécula polinucleotídica de las realizaciones 1 a 9.

13. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 12, en donde el promotor inducible es un promotor de la aldehído oxidasa 1 (AOX1).

14. La molécula polinucleotídica aislada de las realizaciones 10 a 14, en donde el vector de expresión para levaduras incluye una región polinucleotídica que codifica una secuencia señal que dirige la EK codificada por la molécula polinucleotídica de las realizaciones 1 a 9 a un compartimento celular o extracelular específico.

15. La molécula polinucleotídica aislada de las realizaciones 10 a 14, en donde el vector de expresión para levaduras incluye una región polinucleotídica que codifica una secuencia señal que dirige la EK codificada por la molécula polinucleotídica de las realizaciones 1 a 9 al citoplasma celular, a un orgánulo celular, o a un medio de cultivo extracelular.

16. La molécula polinucleotídica aislada de la realización 14 o 15, en donde la secuencia señal es un péptido del factor α.

17. La molécula polinucleotídica aislada de las realizaciones 1 a 9, en donde la molécula polinucleotídica aislada es una construcción de expresión para levaduras.

18. Una construcción de expresión para levaduras que comprende un vector de expresión para levaduras y una molécula polinucleotídica que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, una variante polinucleotídica de las mismas, o una variante truncada de las mismas, y cualquier complemento de las mismas.

19. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica es idéntica al menos al 70%, al menos al 75%, al menos al 80%, al menos al 85%, al menos al 90%, al menos al 91%, al menos al 92%, al menos al 93%, al menos al 94%, al menos al 95%, al menos al 96%, al menos al 97%, al menos al 98% o al menos al 99% a la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de un complemento de las mismas.

20. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos no contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

21. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

22. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica se hibrida a una molécula polinucleotídica que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas, en una condición rigurosa.

23. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 1 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o en la SEQ ID nº 6.

24. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

25. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante truncada tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, o al menos 50 nucleótidos retirados desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de cualquier complemento de las mismas.

26. La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante truncada tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones retirados desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas.

27. La construcción de expresión para levaduras de las realizaciones 18 a 26, en donde el vector de expresión para levaduras es un vector de expresión para Pichia pastoris, un vector de expresión para Pichia methanolica, un vector de expresión para Pichia angusta, un vector de expresión para Schizosaccharomyces pombe, un vector de expresión para Saccharomyces cerevisiae y un vector de expresión para Yarrowia lipolytica.

28. La construcción de expresión para levaduras de la realización 27, en donde el vector de expresión para levaduras incluye un promotor constitutivo, un potenciador constitutivo, un promotor inducible, un potenciador inducible o cualquier combinación de los mismos que dirige la expresión de la molécula polinucleotídica de las realizaciones 1 a 9.

29. La construcción de expresión para levaduras de la realización 28, en donde el promotor inducible es un promotor de la aldehído oxidasa 1 (AOX1).

30. La construcción de expresión para levaduras de las realizaciones 27 a 29, en donde el vector de expresión para levaduras incluye una región polinucleotídica que codifica una secuencia señal que dirige la EK codificada por la molécula polinucleotídica de las realizaciones 1 a 9 a un compartimento celular o extracelular específico.

31. La construcción de expresión para levaduras de las realizaciones 27 a 29, en donde el vector de expresión para levaduras incluye una región polinucleotídica que codifica una secuencia señal que dirige la EK codificada por la molécula polinucleotídica de las realizaciones 1 a 9 al citoplasma celular, a un orgánulo celular o a un medio de cultivo extracelular.

32. La construcción de expresión para levaduras de la realización 30 o 31, en donde la secuencia señal es un péptido del factor α.

33. Una célula de levadura que comprende un polinucleótido de las realizaciones 1 a 17.

34. La célula de levadura de la realización 33, en donde la construcción de expresión está contenida transitoriamente en la célula de levadura.

35. La célula de levadura de la realización 33, en donde la construcción de expresión está contenida establemente en la célula de levadura.

37. La célula de levadura de las realizaciones 33 a 35, en donde la célula de levadura comprende una célula de una cepa de Pichia pastoris, una célula de una cepa de Pichia methanolica, una célula de una cepa de Pichia angusta, una célula de una cepa de Schizosaccharomyces pombe, una célula de una cepa de Saccharomyces cerevisiae o una célula de una cepa de Yarrowia lipolytica.

38. La célula de levadura de las realizaciones 33 a 35, en donde la célula de levadura es una célula de una cepa de Pichia pastoris.

39. Una célula de levadura que comprende una construcción de expresión para levaduras de las realizaciones 18 a 32.

40. La célula de levadura de la realización 39, en donde la construcción de expresión está contenida transitoriamente en la célula de levadura.

41. La célula de levadura de la realización 39, en donde la construcción de expresión está contenida de forma estable en la célula de levadura.

42. La célula de levadura de las realizaciones 39 a 41, en donde la célula de levadura comprende una célula de una cepa de Pichia pastoris, una célula de una cepa de Pichia methanolica, una célula de una cepa de Pichia angusta, una célula de una cepa de Schizosaccharomyces pombe, una célula de una cepa de Saccharomyces cerevisiae o una célula de una cepa de Yarrowia lipolytica.

43. La célula de levadura de las realizaciones 39 a 41, en donde la célula de levadura es una célula de una cepa de Pichia pastoris.

44. Un método para producir una enterocinasa, en donde el método comprende la etapa de expresar una enterocinasa en una célula de levadura de las realizaciones 33 a 43.

45. El método de la realización 44, en donde el método además comprende purificar la enterocinasa.

46. Un método para escindir un polipéptido recombinante, en donde el método comprende la etapa de poner en contacto un polipéptido recombinante que incluye un sitio de escisión de la SEQ ID nº 1 con una enterocinasa, en donde la enterocinasa se produce por un método de la realización 44 o 45, en donde poner en contacto el polipéptido recombinante con la enterocinasa da lugar a una escisión específica de la SEQ ID nº 1.

47. Un método para preparar un polipéptido recombinante, en donde el método comprende la etapa de poner en contacto un polipéptido recombinante que incluye un sitio de escisión de la SEQ ID nº 1 con una enterocinasa, en donde la enterocinasa se produce por un método de la realización 44 o 45, en donde poner en contacto el polipéptido recombinante con la enterocinasa da lugar a una escisión específica de la SEQ ID nº 1.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos no limitantes se dan a conocer con fines ilustrativos solo para facilitar un conocimiento más completo de las realizaciones representativas ahora contempladas. Estos ejemplos no se deben considerar que limitan ninguna de las realizaciones descritas en la presente especificación, incluidas las que pertenecen a los métodos de expresión de la EK mediante un sistema de expresión para levaduras como se describe en la presente memoria.

Ejemplo 1

Síntesis de una molécula polinucleotídica que codifica la EK

Una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4 se sintetiza mediante los métodos químicos estándares (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA). Por ejemplo, se sintetizan oligonucleótidos de 20 a 50 bases de longitud por síntesis estándar con fosforamiditas. Estos oligonucleótidos se hibridan en cadenas bicatenarias que se ligan juntos para ensamblar la molécula polinucleotídica de longitud completa. Esta molécula de polinucleótido se clona con los métodos estándares de biología molecular en un vector pUCBHB1 en el sitio SmaI para generar el pUCBHB1/EK. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica por secuenciación con química BIG DYE TERMINATOR™ 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se utiliza una estrategia de síntesis similar para hacer una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 6, variantes nucleotídicas de la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6, y variantes truncadas de la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

Si se desea, se sintetiza una molécula polinucleotídica optimizada de expresión basada en la SEQ ID nº 2, en la SEQ ID nº 4 o en la SEQ ID nº 6 para mejorar la expresión en las células de levadura. La molécula polinucleotídica que codifica la EK se modifica para 1) contener los codones sinónimos típicamente presentes en las moléculas polinucleotídicas nativas de una cepa de levadura de elección; 2) contener un contenido de G+C que se acerca lo más posible al contenido de G+C medio de las moléculas polinucleotídicas nativas encontradas en una cepa de levadura de elección; 3) reducir las regiones polimononucleotídicas encontradas dentro de la molécula polinucleotídica; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados dentro de la molécula polinucleotídica, véase, p. ej., Lance E. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E,

solicitud de publicación de patente internacional WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, solicitud de publicación de patente internacional WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006), cada una incorporada totalmente por referencia. Una vez que la optimización de secuencias está completa, los oligonucleótidos de 20 a 50 bases de longitud se sintetizan con la síntesis estándar de fosforamiditas. Estos oligonucleótidos se hibridan en cadenas bicatenarias que se ligan juntas para ensamblar la molécula polinucleotídica de longitud completa. Esta molécula de polinucleótido se clona con los métodos estándares de biología molecular en un vector pUCBHB1 en el sitio SmaI para generar el pUCBHB1/EK. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica por secuenciación con química BIG DYE TERMINATOR™ 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Una estrategia de síntesis similar se utiliza para fabricar una molécula polinucleotídica que es variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o variantes truncadas de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Ejemplo 2

Construcción y expresión de pPpT4Alpha/EK

Para construir una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica que codifica la EK según se describe en la presente memoria, una construcción pJ201/rEK que contiene la SEQ ID nº 4 se digirió con XhoI y NotI para cortar el inserto de la SEQ ID nº 4. El fragmento de restricción resultante se purificó mediante el kit de extracción de gel QIAQUICK® (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) y el fragmento de la SEQ ID nº 4 se subclonó en el vector pPpT4Alpha_S (Ingenza, Ltd., Midlothian, UK) que se había digerido con las endonucleasas de restricción XhoI y NotI. El vector pPpT4Alpha_S incluye una secuencia señal de secreción del factor α, una porción de un promotor de AOX1, las secuencias de terminación de la transcripción de AOD y AOX1, y un marco abierto de lectura para ZEOCIN™. El fragmento y el vector se ligan mediante el protocolo de la ADN ligasa de T4 para producir el pPpT4Alpha/rEK y una alícuota de esta mezcla de ligación se transformó mediante un protocolo estándar de electroporación en las células electrocompetentes NEB10 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA). Las células transformadas se sembraron en placas de agar Lennox de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 25 µg/ml de ZEOCIN™ y se colocaron en un incubador a 37 °C para que crezcan durante una noche. Las construcciones de expresión candidatas se seleccionaron como colonias resistentes a ZEOCIN™. Posteriormente, las colonias resistentes se hicieron crecer, se recogieron y se les aisló el ADN plasmídico con métodos estándares, y las construcciones de expresión candidatas se cribaron mediante digestión de restricción con XhoI y NotI, XbaI, o NdeI para determinar la presencia y la orientación correctas del fragmento insertado. Los cultivos que contienen la construcción de expresión deseada pPpT4Alpha/rEK se hicieron crecer, se recogieron y el ADN plasmídico se aisló con los métodos estándares, y las construcciones de expresión candidatas se secuenciaron para verificar que se hubiese hecho la construcción de expresión correcta. Esta estrategia de clonación produjo una construcción de expresión para levaduras que comprende la SEQ ID nº 4. Se utiliza una estrategia similar para hacer una construcción de expresión pPpT4Alpha/EK que incluye la SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6. Como alternativa, una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 4, una variante nucleotídica de SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6 o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6 se sintetiza como se describe en el ejemplo 1.

Para construir una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa codificada por la SEQ ID nº 4, el ADN de la construcción de expresión pPpT4Alpha/rEK se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un cebador directo de AOX de SEQ ID nº 8 y un cebador inverso de PUC de SEQ ID nº 9 para producir un casete de integración lineal. Las cinco primeras pares de bases del cebador directo de AOX contienen un sitio BglII que no es idéntico a la secuencia de ADN de pPpT4Alpha/EK. El cebador directo de AOX se fija después a la región que es parte del promotor de AOX1. Aunque el gen de AOX1 de longitud completa no está presente en el casete de integración lineal, todo el gen de AOX1 de longitud completa se reconstituye tras la integración en el cromosoma de P. pastoris. La construcción de expresión linealizada resultante se transformó en una cepa apropiada MutS de P.

pastoris CBS7435 mediante un método de electroporación. La mezcla de transformación se siembra en placas de agar al 1,5% (pH 7,5) con extracto de levadura, peptona, dextrosa y sorbitol (YPDS) que contienen 100 µg/ml, 250 µg/ml o 500 µg/ml de ZEOCIN™, y se colocan en un incubador a 28-30 °C durante 1 a 3 días. La selección de los transformantes que integran en fragmento de pPpT4Alpha/EK en 5' del locus de AOX1 se determina mediante la resistencia de las colonias a ZEOCIN™. Se seleccionaron 62 colonias recombinantes de las diferentes placas de YPDS que contenían las diferentes concentraciones de ZEOCIN™ y se inocularon en un caldo con extracto de levadura, peptona y dextrosa (YPD) que contiene ZEOCIN™ a 100 µg/ml. Las líneas celulares de levadura aisladas crecieron como se esperaba en el caldo de YPD que contiene ZEOCIN™, lo que indica que las cepas eran resistentes a Zeocin™ y contenían el casete de pPpT4Alpha/EK integrado. Las alícuotas de los cultivos de YPD que contienen las líneas celulares de levadura aisladas se colocaron en viales que tienen 1 ml del caldo YPD que contiene glicerol al 10% (v/v) para crear las líneas celulares de levadura establecidas, y los viales se conservaron a – 80 ºC. Se utilizó una estrategia similar para fabricar una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa de SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Para verificar adicionalmente la presencia del casete integrado de pPpT4Alpha/EK y determinar el número de copias relativo del gen de EK en cada línea celular de levadura aislada, se realizó un análisis por PCR en las 62 líneas celulares aisladas. Se retiró 1 ml de los cultivos de YPD explicados más arriba, se lisó y se aisló el ADN genómico con los métodos estándares. El ADN genómico aislado se amplificó por PCR durante 29 ciclos con un cebador directo de EK de SEQ ID nº 10 y un cebador inverso de EK de SEQ ID nº 11 para producir un producto de 250 pb del gen de la EK. Después de completar la amplificación, la mezcla de reacción se resolvió en un gel de agarosa al 0,8% que contiene una tinción para polinucleótidos y también una escalera de ADN de 2 unidades logarítmicas desde un tamaño de 0,1 kb a 10 kb. Estos experimentos confirmaron que en las 61 líneas celulares analizadas se generó el fragmento esperado de EK de 250 pb. Se repitió la amplificación por PCR con las mismas preparaciones de ADN genómico, pero con solo 18 ciclos para estimar el número relativo de copias entre las cepas. Aunque se observó un nivel relativamente bajo de variación, cuatro líneas celulares mostraron un número de copias génicas más elevado respecto a las otras.

Ejemplo 3

Ensayos para la actividad enterocinasa

Para analizar la presencia, calidad y cantidad de la enterocinasa expresada, se analizaron las líneas celulares que llevan integrado un casete de pPpT4Alpha/EK con una prueba colorimétrica líquida para la enterocinasa (EK), SDS- PAGE, análisis de inmunotransferencia y ELISA. Para inducir la expresión de la enterocinasa desde el casete integrado de pPpT4Alpha/EK, se utilizó una alícuota de cada línea celular de levadura establecida para inocular matraces de 100 ml con deflectores para agitación que contienen 10 ml de un medio de crecimiento definido que incluye bases nitrogenadas de levadura (YNB) al 1,34% (p/v), tampón de fosfato a 200 mM, biotina al 4 x 10-5% (p/v) y glicerol al 1% (v/v). Lo inoculado se hizo crecer a aproximadamente 28-30 ºC en un incubador con agitación (250 rpm) durante aproximadamente 60 a 65 horas. Las células se recogieron por centrifugación (3000x g a 22 °C durante 5 minutos). Para inducir la expresión de la enterocinasa, el sedimento celular se resuspendió en 1 ml de medio de inducción primario que incluye bases nitrogenadas de levadura (YNB) al 1,34% (p/v), tampón de fosfato a 200 mM, biotina al 4 x 10-5% (p/v) y metanol al 5% (v/v). Las células se cultivaron a aproximadamente 28-30 ºC en un incubador con agitación (250 rpm) durante aproximadamente 8 a 10 horas. Los cultivos se cargaron con 100 µl de metanol, se cultivaron durante aproximadamente 16 a 18 horas y al medio se le añadieron 100 µl más de metanol cada 24 horas, y la última carga se añadió aproximadamente a las 72-74 horas de la inducción. Para comparar los datos obtenidos de muestras de matraces en agitación, además de las cepas integradas, se montó por duplicado en matraces con agitación la cepa de comparación B18 (una P. pastoris MutS CBS7435 con la construcción de expresión pPpT4Alpha/EK-HIS que produce una enterocinasa etiquetada con His).

Para determinar la actividad enzimática de la enterocinasa expresada, se tomaron muestras durante el transcurso de la inducción del cultivo y se les analizó la actividad enterocinasa con un ensayo colorimétrico líquido para la actividad enterocinasa. Se tomó una alícuota problema del medio de los cultivos de levadura descritos más arriba a las 0 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas después de la inducción. Se añadieron las alícuotas problema a un tubo y se centrifugaron dos veces a 14.000 rpm para garantizar la eliminación de las células. A continuación, se añadió una alícuota de la muestra del medio preparado a una mezcla de reacción que contenía a 1 mM el sustrato peptídico colorimétrico, el éster de N-carbobenciloxi-Lys-tiobencilo (Z-Lys-SBZL; Bachem, AG, Bubendorf, CH) en presencia del ácido 5,5'ditio-bis(2-nitrobenzoico) (DTNB). La reacción de escisión inició un cambio de color de incoloro a amarillo y se midió la velocidad inicial en el lector de placas en el modo cinético a una absorbancia de 405 nm. La concentración de la enzima se ajustó para garantizar que las diluciones de las muestras estuvieran dentro del margen lineal del ensayo (0-100 mOD/min). Las muestras se analizaron por triplicado junto a los controles positivos y negativos.

Después de los resultados de la actividad enterocinasa en todas las cepas, el ensayo colorimétrico líquido para la actividad enterocinasa se repitió con cuatro líneas celulares de levadura que tenían la actividad enterocinasa más alta, denominadas YCL-48, YCL-49, YCL-98 e YCL-99, y las dos líneas celulares que tenían la actividad enterocinasa más baja, denominadas YCL-40 e YCL-88. Todas las muestras se analizaron por triplicado con un solo lote de sustratos. La figura X muestra la actividad enterocinasa media para cada línea celular de levadura frente al tiempo tras la inducción. Las barras de error indican el intervalo de confianza del 95% entre los valores por triplicado de los matraces en agitación. A partir de los datos, YCL-49 tenía la actividad enterocinasa más elevada e YCL-88 tenía la actividad más baja.

Para determinar la identidad y la calidad de la enterocinasa expresada, se tomaron muestras de YCL-40, YCL-48, YCL-49, YCL-88, YCL-98 e YCL-99 en el punto de tiempo de 96 a 98 horas tras la inducción, y se analizaron por SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia. Se añadieron las muestras a un tampón de muestra de SDS 2X y se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida en MOPS con geles de bis-tris poliacrilamida prefundida al 10- 20% (Expedeon, Inc, San Diego, CA) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Para el análisis por SDS-PAGE, los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie para revelar los patrones de bandas de las proteínas. Para el análisis de inmunotransferencia, los polipéptidos separados se transfirieron a nitrocelulosa y se tiñeron con un anticuerpo policlonal contra la enterocinasa. El polipéptido de enterocinasa era claramente visible en SDS-PAGE y en los análisis de inmunotransferencia como una única banda de aproximadamente 38 kDa. La migración electroforética indica que la enterocinasa había sufrido modificaciones postraduccionales. Además, la ausencia de cualquier otra banda espúrea detectable indicaba la alta calidad de la enterocinasa expresada por las líneas celulares de levadura con el casete de pPpT4Alpha/EK integrado.

Para determinar la concentración de la enterocinasa expresada, se tomaron muestras de YCL-49, YCL-88 e YCL-98 en el punto de tiempo de 96 a 98 horas tras la inducción, y analizaron con un inmunoensayo enzimático (ELISA) de tipo sandwich. Se prepararon una serie de diluciones a partir de las muestras problema y se analizaron por triplicado junto a concentraciones definidas de un estándar de enterocinasa recombinante disponible en el mercado (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI). La curva estándar producida de la serie de diluciones del estándar comercial permitió la cuantificación de las muestras de YCL-49 e YCL-88. Los resultados de ELISA se utilizaron para calcular la cantidad de material de EK presente en el sobrenadante de las muestras de caldo completas que se obtuvieron después del crecimiento en los matraces en agitación y la expresión de las cepas integradas (tabla 3).

Tabla 3. Ensayo ELISA

Muestra Concentración de enterocinasa

B18 1,0 µg/ml YCL-49 2,6 µg/ml YCL-88 2,9 µg/ml YCL-98 2,2 µg/ml Los análisis descritos más arriba indicaban que varias líneas celulares de levadura establecidas expresaban una enterocinasa enzimáticamente activa de gran calidad a partir del casete integrado de pPpT4Alpha/EK.

Ejemplo 4

Construcción y expresión de pPICZ A/EK-myc-His

Para construir una construcción de expresión para levaduras que comprende la molécula polinucleotídica que codifica la EK tal y como se describe en la presente memoria, los sitios de endonucleasa de restricción adecuados para clonar una molécula de ácido nucleico operativamente unida en un vector pPIC A (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) se incorporan en los extremos en 5' y 3' de la SEQ ID nº 4 mediante métodos estándares de síntesis de ADN. Esta construcción se digiere con las enzimas de restricción que 1) cortan la SEQ ID nº 4 que codifica una enterocinasa; y 2) permiten que este inserto se una operativamente a un vector pPIC A. Este inserto se subclona mediante el uso de un método con la ADN ligasa de T4 en un vector pPIC A que está digerido con las endonucleasas de restricción adecuadas para dar el pPIC A/BoNT/E-myc-His. La mezcla de ligación se transforma en las células DH5α de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) mediante un método de choque térmico, se siembra en placas de agar al 1,5% (pH 7,5) de Luria-Bertani con poca sal que contiene 25 µg/ml de ZEOCIN™, y se coloca en un incubador a 37 °C para que crezca durante una noche. Las bacterias que contienen las construcciones de expresión se identifican como colonias resistentes a ZEOCINTM. Las construcciones candidatas se aíslan con un método de minipreparación de plásmidos por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo por digestión de endonucleasa de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produce una construcción de expresión para levaduras que codifica una enterocinasa operativamente unida a los péptidos del extremo carboxilo de c-myc y de fijación de polihistidina. Se utiliza una estrategia similar para hacer una construcción de expresión de pPIC A/EK que incluye la SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Para construir una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa, el pPICZ A/EK-myc-His se digirió con una endonucleasa de restricción adecuada (a saber, SacI, PmeI o BstXI) y la construcción de expresión lineal resultante se introduce por transformación en una cepa adecuada MutS de P. pastoris KM71H mediante un método de electroporación. La mezcla de transformación se sembró en placas de agar YPDS al 1,5% (pH 7,5) que contienen 100 µg/ml de ZEOCIN™ y se colocaron en un incubador a 28-30 °C durante 1 a 3 días de crecimiento. La selección de los transformantes que integran la pPICZ A/EK-myc-His en 5' del locus de AOX1 se determina mediante la resistencia de las colonias a ZEOCIN™. A continuación, las líneas celulares que integran una construcción pPICZ A/EK-myc-His se analizan para detectar la expresión de la enterocinasa. Las colonias aisladas de las líneas celulares problema que tienen integrado el pPICZ A/EK-myc-His se utilizan para inocular matraces de 1,0 l con deflectores que contienen 100 ml de medio MGYH y se hacen crecer a aproximadamente 28-30 ºC en un incubador con agitación (250 rpm) hasta que el cultivo alcanza una DO600 = 2-6 (aproximadamente de 16 a 18 horas). Las células se recogen por centrifugación (3.000x g a 22 °C durante 5 minutos). Para inducir la expresión, el sedimento celular se resuspende en 15 ml del medio MMH y se añade metanol al 100% para dar una concentración final del 0,5%. Los cultivos se hacen crecer a aproximadamente 28-30 °C en un incubador con agitación (250 rpm) durante seis días. Se añade metanol al 100% al cultivo cada 24 horas para dar una concentración final del 0,5%. Se toma una alícuota de 1,0 ml del cultivo problema cada 24 horas comenzando a tiempo cero y finalizando a las 144 horas. Se recogen las células de las alícuotas mediante microcentrifugación para sedimentar las células y se lisan con tres rondas de congelación y descongelación que consisten en mantener a –80 ºC durante 5 minutos y luego a 37 ºC durante 5 minutos. Se añaden muestras de lisis al tampón de muestra con SDS a 2x (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y la expresión de las líneas celulares establecidas se mide mediante SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia (como se describe en el ejemplo 3). La línea celular KM71H de P. pastoris MutS que muestra el nivel de expresión más elevado de enterocinasa se selecciona para la expresión a gran escala con los métodos de fermentación comerciales. Los métodos para la expresión a gran escala son como se describe más arriba, salvo que el volumen de cultivo es de aproximadamente 2,5 l del medio MGYH crecido en un fermentador BioFlo 3000 de 5 l y las concentraciones de todos los reactivos se incrementarán proporcionalmente para este volumen. Para más detalles de todos los métodos descritos en este ejemplo, véase el kit de expresión para Pichia EasySelect™, versión G, «A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris», 122701, 25-0172 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Se utilizó una estrategia similar para fabricar una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa de SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Ejemplo 5

Construcción y expresión de pMET/EK-V5-His

Para construir una construcción de expresión para levaduras que comprende la molécula polinucleotídica que codifica la EK tal y como se describe en la presente memoria, los sitios de endonucleasa de restricción adecuados para clonar una molécula de ácido nucleico operativamente unida en un vector pMET (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) se incorporan en los extremos en 5' y 3' de la SEQ ID nº 4 mediante los métodos estándares de síntesis de ADN. Esta construcción se digiere con las enzimas de restricción que 1) cortan la SEQ ID nº 4 que codifica una enterocinasa; y 2) permiten que este inserto esté unido operativamente a un vector pMET. Este inserto se subclona mediante el uso de un método con la ADN ligasa de T4 en un vector pMET que está digerido con las endonucleasas de restricción adecuadas para dar el pMET/BoNT/E-V5-His (figura 9). La mezcla de ligación se transforma en las células DH5α de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) mediante un método de choque térmico, se siembra en placas de agar al 1,5% (pH 7,5) de Luria-Bertani con poca sal que contienen 100 µg/ml de ampicilina, y se coloca en un incubador a 37 °C para que crezca durante una noche. Las bacterias que contienen las construcciones de expresión se identificaron como colonias resistentes a la ampicilina. Las construcciones candidatas se aíslan con un método de minipreparación de plásmidos por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo por digestión con endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produce una construcción de expresión para levaduras que codifica una enterocinasa operativamente unida a péptidos del extremo carboxilo de V5 y de fijación de polihistidina. Se utiliza una estrategia similar para hacer una construcción de expresión pMET/EK que incluye la SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Para construir una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa, el pMET/BoNT/E-V5-His se digiere con una endonucleasa de restricción adecuada (a saber, ApaI, AscI, FseI, PacI, KpnI o PstI) y la construcción de expresión linealizada resultante se introduce por transformación en una cepa PMAD16 de P. methanolica MutS mediante un método de electroporación. La mezcla de transformación se siembra en placas MD de agar al 1,5% (pH 7,5) que carece de adenina y se deja crecer en un incubador a 28-30 °C durante 3 o 4 días. La selección de los transformantes que integran el pMET/EK-V5-His se determina mediante el crecimiento de las colonias en un medio sin adenina. A las líneas celulares Ade+ que integran una construcción pMET/EK-V5-His se les analiza la expresión de la enterocinasa mediante una prueba de expresión a pequeña escala. Las colonias aisladas Ade+ de las líneas celulares problema que tienen integrado el pMET/EK-V5-His se utilizan para inocular 15 ml del medio BMDY y las células se hacen crecer a aproximadamente 28-30 ºC en un incubador con agitación (250 rpm) hasta que el cultivo alcanza una DO600 = 2-10 (aproximadamente de 16 a 18 horas). Las células se recogen por centrifugación (1,500x g a 22 °C durante 5 minutos). Para inducir la expresión, los sedimentos celulares se resuspenden en 5 ml del medio BMMY y los cultivos se dejan crecer a aproximadamente 28-30 °C en un incubador con agitación (250 rpm). Después de 24 horas, se retira una alícuota de 500 µl, se añade metanol para dar una concentración final del 0,5% y los cultivos se hacen crecer a aproximadamente 28-30 °C en un incubador con agitación (250 rpm). Se retira una alícuota de 500 µl y se añade más metanol para dar una concentración final del 0,5% al cultivo cada 24 horas durante 3 a 5 días. Las células recogidas se centrifugan (1,500x g a 4 °C durante 5 minutos), se lavan una vez en agua y los sedimentos celulares se almacenan a –80 °C hasta que se necesiten. Para detectar la expresión de la enterocinasa inducida, los sedimentos celulares de cada punto de tiempo se lisan con un método con perlas de vidrio lavadas en ácido. Se añaden muestras de lisis al tampón de muestra con SDS a 2x (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y la expresión de las líneas celulares establecidas se mide mediante SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia (como se describe en el ejemplo 3). La línea celular PMDAD16 de P. methanolica MutS que muestra el nivel de expresión más elevado de enterocinasa se selecciona para la expresión a gran escala con los métodos de fermentación comerciales. Los métodos para la expresión a gran escala son como se describen más arriba, salvo que el volumen de cultivo es de aproximadamente 2,5 l del medio BMDY/BMMY crecido en un fermentador BioFlo 3000 de 5 l y las concentraciones de todos los reactivos se incrementarán proporcionalmente para este volumen. Para más detalles de todos los métodos descritos en este ejemplo, véase el kit de expresión de P. methanolica, versión C, «A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia methanolica», 062101, 25-0288 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Se utilizó una estrategia similar para fabricar una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa de SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Ejemplo 6

Construcción y expresión de pYES2/EK-V5-His

Para construir una construcción de expresión para levaduras que comprende la molécula polinucleotídica que codifica la EK tal y como se describe en la presente memoria, los sitios de endonucleasas de restricción adecuados para clonar una molécula de ácido nucleico operativamente unida en un vector pYES2 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) se incorporan en los extremos en 5' y 3' de la SEQ ID nº 4 mediante métodos estándares de síntesis de ADN. Esta construcción se digiere con las enzimas de restricción que 1) cortan la SEQ ID nº 4 que codifica una enterocinasa; y 2) permiten que este inserto esté unido operativamente a un vector pYES2. Este inserto se subclona mediante el uso de un método con la ADN ligasa de T4 en un vector pYES2 que está digerido con las endonucleasas de restricción adecuadas para dar el pYES2/EK-V5-His (figura 10). La mezcla de ligación se transforma en las células DH5α de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) mediante un método de choque térmico, se siembra en placas de agar al 1,5% (pH 7,5) de Luria-Bertani con poca sal que contiene 100 µg/ml de ampicilina, y se coloca en un incubador a 37 °C para que crezca durante una noche. Las bacterias que contienen las construcciones de expresión se identificaron como colonias resistentes a la ampicilina.

Las construcciones candidatas se aíslan con un método de minipreparación de plásmidos por lisis alcalina y se analizan mediante mapeo por digestión de endonucleasas de restricción para determinar la presencia y la orientación del inserto. Esta estrategia de clonación produce una construcción de expresión para levaduras que codifica una enterocinasa operativamente unida al extremo carboxilo de V5 y péptidos de fijación de polihistidina. Se utiliza una estrategia similar para hacer una construcción de expresión pYES2/EK que incluye la SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Para construir una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa, el pYES2/EK-V5-His se transforma en la cepa de S. cerevisiae competente INVSc1 con un método de transformación basado en litio. La mezcla de transformación se siembra en placas de agar al 2% con medio mínimo SC (pH 7,5) que contiene glucosa al 2%, que tiene uracilo al 0,01% o bien carecen de uracilo, y se coloca en un incubador a 28-30 °C durante 1 a 3 días de crecimiento. La selección de los transformantes que contienen el pYES2/EK-V5-His se determina mediante el crecimiento de las colonias únicamente en las placas que contienen uracilo. A las células que contienen una construcción pYES2/EK-V5-His se les analiza la expresión de la enterocinasa mediante una prueba de expresión a pequeña escala. Las colonias aisladas de células problema que contienen el pYES2/EK-V5-His se utilizan para inocular tubos de 50 ml que contienen 15 ml de medio SC que contiene glucosa al 2% y uracilo al 0,1%, y se dejan crecer durante una noche a aproximadamente 28-30 °C en un incubador con agitación (250 rpm). Se determina la DO600 de los cultivos de una noche y se distribuyen en alícuotas para obtener una concentración de células de DO600 = 0,4 en un volumen de 50 ml. Estas alícuotas se centrifugan (1,500x g a 22 °C durante 5 minutos) y el sedimento celular resultante se resuspende en medio SC que contiene galactosa al 20% y rafinosa al 10%. Las células se dejan crecer a aproximadamente 28-30 °C en un incubador con agitación (250 rpm) y se toman alícuotas de 5 ml a las 0 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas y 24 horas, y se determinan las concentraciones de la DO600 para cada muestra. Las células recogidas se centrifugan (1,500x g a 4 °C durante 5 minutos), se lavan una vez en agua y los sedimentos celulares se almacenan a –80 °C hasta que se necesiten. Para detectar la expresión del BoNT/E-V5- His inducido, los sedimentos celulares de cada punto de tiempo se lisan con un método de perlas de vidrio lavadas en ácido. Se añaden muestras de lisis al tampón de muestra con SDS a 2x (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) y la expresión de las líneas celulares establecidas se mide mediante SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia (como se describe en el ejemplo 3). Las condiciones de inducción que dan lugar al nivel de expresión más elevado de enterocinasa se seleccionan para la expresión a gran escala utilizando los métodos de fermentación comerciales.

Los métodos para la expresión a gran escala son como se describe más arriba, salvo que el volumen de cultivo es de aproximadamente 2,5 l de medio SC crecido en un fermentador BioFlo 3000 de 5 l y las concentraciones de todos los reactivos se incrementarán proporcionalmente para este volumen. Para más detalles sobre todos los métodos descritos en este ejemplo, véanse los vectores de expresión para levaduras pYES2/CT, pYES3/CT, y pYC2/CT con etiquetas en el extremo carboxilo y marcadores de selección auxótrofos, versión E, 25-0304, 27 de enero de 2003 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA). Se utilizó una estrategia similar para fabricar una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa de SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Para finalizar, se debe entender que aunque los aspectos de la presente especificación están resaltados para hacer referencia a realizaciones específicas, el experto en la técnica fácilmente apreciará que estas realizaciones descritas son sólo ilustrativas de los principios del tema objeto descrito en la presente memoria. Así pues, se debe saber que el tema objeto descrito no se limita de ningún modo a una metodología, protocolo y/o reactivo, etc., particulares que se describan en la presente memoria. Propiamente dicho, se pueden hacer diferentes modificaciones o cambios, o configuraciones alternativas del tema objeto descrito, de acuerdo con las enseñanzas de la presente memoria.

Finalmente, la terminología utilizada en la presente memoria tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, lo que queda definido únicamente por las reivindicaciones. De acuerdo con esto, la presente invención no se limita precisamente a lo que se demuestra y se describe.

Algunas realizaciones de la presente invención se describen en la presente memoria, incluido el mejor modo conocido por los inventores para realizar la invención. Por supuesto, las variaciones de estas realizaciones descritas serán evidentes para los expertos en la técnica después de leer la descripción anterior. El inventor espera que los expertos en la técnica empleen tales variaciones como les resulte más apropiado, y los inventores pretenden que la presente invención se ponga en práctica de una manera diferente a la descrita específicamente en la presente memoria. De acuerdo con esto, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes del tema objeto descrito en las reivindicaciones adjuntas a esta memoria como se permite por la legislación aplicable. Además, cualquier combinación de las realizaciones descritas anteriormente en todas las variaciones posibles de las mismas queda englobada por la invención a menos que se indique otra cosa en la presente memoria o por lo demás se contradiga claramente por el contexto.

Los agrupamientos de las realizaciones, elementos o etapas alternativos de la presente invención no se deben interpretar como limitaciones. Cada miembro de grupo se puede citar y reivindicar individualmente o en cualquier combinación con otros miembros de grupo descritos en la presente memoria. Se anticipa que uno o varios miembros de un grupo podrían quedar incluidos, o eliminados, de un grupo por razones de comodidad y/o patentabilidad. Cuando se produce tal inclusión o eliminación, la especificación se estima que contiene el grupo que se modifica, de modo que satisface la descripción escrita de todos los grupos de Markush utilizados en las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se indique otra cosa, se debe saber que todos los números que expresen un elemento, cantidad, parámetro, propiedad, término, etc., característico usado en la presente especificación y en las reivindicaciones están modificados en todos los casos por el término «aproximadamente». Tal y como se emplea en esta memoria, la terminología «aproximadamente» significa que el elemento, cantidad, parámetro, propiedad o término característico así calificado engloba un margen de más o menos el 10% por encima y por debajo del valor del elemento, cantidad, parámetro, propiedad o término característico. De acuerdo con esto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos presentados en la especificación y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar. Al menos, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada indicación numérica se debe considerar al menos a la luz del número de dígitos significativos descritos y aplicando las técnicas de redondeo habituales. A pesar de que los intervalos y valores numéricos que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los márgenes y valores numéricos indicados en los ejemplos específicos se presentan tan precisamente como es posible. Sin embargo, cualquier margen o valor numérico inherentemente contiene determinados errores que necesariamente son resultado de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de análisis. La descripción de los márgenes numéricos de los valores en la presente memoria simplemente pretende servir como un método abreviado para hacer referencia a cada uno de los valores numéricos independientes que caen dentro del margen. A menos que se indique otra cosa en la presente memoria, cada valor individual de un margen numérico se incorpora en la presente especificación como si estuviera descrito individualmente en la presente memoria.

La terminología «un», «una», «el» y determinantes similares utilizados en el contexto de describir la presente invención (específicamente en el contexto de las reivindicaciones que vienen a continuación) se deben considerar que cubren el singular y el plural, a menos que se indique otra cosa en la presente memoria o que claramente quede contradicho por el contexto. Todos los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar en cualquier orden idóneo, a menos que se indique otra cosa en la presente memoria o por lo demás quede contradicho claramente por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, «tal como») dado a conocer en la presente memoria pretende simplemente iluminar mejor la presente invención y no poner una limitación al alcance de la invención que se reivindica. Ningún lenguaje en la presente especificación se debe considerar que indica ningún elemento no reivindicado esencial para la puesta en práctica de la invención.

Las realizaciones específicas descritas en la presente memoria se pueden limitar adicionalmente en las reivindicaciones que utilizan, que consisten, o que consisten esencialmente, en el lenguaje. Cuando se utiliza en las reivindicaciones, tanto si así se registró o se añadió como enmienda, la terminología de transición «que consiste en» excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en las reivindicaciones. La terminología de transición «que consiste esencialmente en» limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y los que materialmente no afectan a las características básicas o nuevas. Las realizaciones de la presente invención así reivindicadas están inherente o expresamente descritas y se permiten en la presente memoria.

Todas las patentes, publicaciones de patente y otras publicaciones citadas e identificadas en la presente especificación se mencionan, entre otras cosas, para el propósito de describir y dar a conocer, por ejemplo, las composiciones y metodologías descritas en tales publicaciones que se podrían utilizar junto con la presente invención. Estas publicaciones se dan a conocer solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Todas las afirmaciones en cuanto a la fecha o representación así como a los contenidos de estos documentos están basadas en la información disponible a los solicitantes y no constituye ninguna admisión relacionada con la corrección de las fechas o contenido de estos documentos.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Fotheringham, Ian Sheffield, Peter J.

<120> Composiciones y métodos para producir enterocinasa en levadura <130> 18850 (BOT) <150> Patente de EE.UU. US 61/416622 <151> 23-11-2010 <160> 11 <170> PatentIn versión 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sitio de escisión de la enterocinasa <400> 1 <210> 2 <211> <708> <212> ADN <213> Bos taurus <400> 2 <210> 3 <211> 235 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 3 <210> 4 <211> 710 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Molécula polinucleotídica que codifica una cadena ligera de enterocinasa <400> 4 <210> 5 <211> 235 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Cadena ligera 1 de la enterocinasa <400> 5 <210> 6 <211> 953 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Molécula polinucleotídica que codifica el factor α y la cadena ligera de la enterocinasa <400> 6 <210> 7 <211> 316 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Enterocinasa con la secuencia señal del factor α <400> 7 <210> 8 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 8 agatctaaca tccaaagacg aaagg <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 9 gcagagcgag gtatgtaggc <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido para PCR <400> 10 cagatgttcc tctgctgtcc <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador oligonucleotídico para PCR <400> 11 atccactcgg tgaatcttgg

REIVINDICACIONES

1. Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

2. La molécula polinucleotídica aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico comprende además una construcción de expresión para levadura.

3. Una construcción de expresión para levaduras que comprende un vector de expresión para levaduras operativamente unido a un polinucleótido que comprende la SEQ ID nº 4.

4. La construcción de expresión para levaduras de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la construcción de expresión para levaduras comprende además una secuencia polinucleotídica que codifica un factor α operativamente unido a un polinucleótido que comprende la SEQ ID nº 4.

5. La construcción de expresión para levaduras de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la secuencia polinucleotídica que codifica un factor α operativamente unido a un polinucleótido que comprende la SEQ ID nº 4 es la SEQ ID nº 6.

6. Una célula de levadura que comprende la molécula polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 2.

7. La célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la construcción de expresión está contenida transitoriamente en la célula de levadura.

8. La célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la construcción de expresión está contenida establemente en la célula de levadura.

9. La célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula de levadura comprende una célula de una cepa de Pichia pastoris, una célula de una cepa de Pichia methanolica, una célula de una cepa de Pichia

angusta, una célula de una cepa de Schizosaccharomyces pombe, una célula de una cepa de Saccharomyces cerevisiae o una célula de una cepa de Yarrowia lipolytica.

10. La célula de levadura de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la célula de levadura es una célula de una cepa de Pichia pastoris.

11. Un método para producir una enterocinasa, en donde el método comprende la etapa de expresar en una célula de levadura la molécula polinucleotídica de acuerdo con la reivindicación 2.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula de levadura comprende una célula de una cepa de Pichia pastoris, una célula de una cepa de Pichia methanolica, una célula de una cepa de Pichia angusta, una célula de una cepa de Schizosaccharomyces pombe, una célula de una cepa de Saccharomyces cerevisiae o una célula de una cepa de Yarrowia lipolytica.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula de levadura es una célula de una cepa de Pichia pastoris.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el método comprende además la purificación de la enterocinasa codificada por la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

15. Un método para escindir un polipéptido recombinante, en donde el método comprende la etapa de expresión de la reivindicación 11 y la etapa de poner en contacto un polipéptido que incluye un sitio de escisión de SEQ ID nº 1 con la enterocinasa, la enterocinasa producida por dicha etapa de expresión, en donde poner en contacto el polipéptido con la enterocinasa da lugar a una escisión específica de la SEQ ID nº 1.