PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA DE UNIÓN A IL-18 RECOMBINANTE.

Producción de una proteína de unión a IL-18 recombinante Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la producción de proteínas. De modo más específico, se refiere a un proceso para la producción de una proteína de unión a IL-18 recombinante (IL-18BP). La descripción se refiere además a una composición de IL-18BP que se caracteriza por un perfil de glicosilación específico. Antecedentes de la invención Las proteínas se han vuelto importantes desde el punto de vista comercial como fármacos que también se denominan en general biológicos. Uno de los mayores retos es el desarrollo de procesos eficaces y rentables para la producción de proteínas recombinantes a escala comercial. La industria de la biotecnología utiliza con profusión células de mamífero para la fabricación de glicoproteínas recombinantes para la terapia humana. En la actualidad, los cultivos semicontinuos y de perfusión son los dos modos dominantes de funcionamiento industrial para los procesos de cultivo de células de mamífero que requieren grandes cantidades de proteínas (Hu y Aunins, 1997). Cualquiera que sea la elección de la tecnología de producción, los intentos de desarrollo se dirigen a la obtención de procesos de producción que garanticen una alta productividad volumétrica, una coherencia entre los lotes, y una calidad homogénea del producto a bajo coste. La decisión entre el modo de producción semicontinuo o de perfusión viene dictada principalmente por la biología del clon y por la propiedad del producto, y se realiza basándose en cada caso durante el transcurso del desarrollo de un nuevo producto de fármaco (Kadouri y Spier, 1997). Cuando se selecciona el proceso de perfusión, uno de los sistemas de cultivo que puede elegirse es un biorreactor de lecho cargado estacionario, en el que las células se inmovilizan sobre vehículos sólidos. Este sistema es fácil de manejar y puede lograrse una densidad celular muy alta (aproximadamente 10 7 -10 8 células.ml 1 ) con los vehículos y las condiciones de cultivo apropiadas. Una consecuencia de esta alta densidad celular es la necesidad de una velocidad de perfusión del medio intensiva (alimentación y recolección), que debe utilizarse para mantener a las células viables y productivas. Parece que la velocidad de perfusión es uno de los parámetros fundamentales para dicho proceso: conduce la productividad de proteínas volumétrica, la calidad del producto de proteínas, y tiene un impacto muy fuerte sobre el coste económico global del proceso. Por tanto, a escala industrial, el proceso del biorreactor de lecho cargado estacionario óptimo debería funcionar con una velocidad de perfusión lo más baja posible sin comprometer la cantidad y la calidad del producto. En el transcurso de la reducción de la velocidad de perfusión se han realizado varios estudios en los que se empleó la concentración de la glucosa (Wang et al., 2002) (Dowd et al., 2001) como indicador del nivel de otros nutrientes en el medio de alimentación para hacer funcionar el biorreactor a una velocidad de perfusión baja sin acumular en el cultivo altos niveles de subproductos tóxicos, tales como lactato y amoniaco (Sugiura y Kakuzaki, 1998) (Racher et al., 1993). La modificación de los parámetros del cultivo, tales como pH y temperatura (Chuppa et al., 1997) también es una estrategia habitual para optimizar las condiciones del cultivo y reducir las necesidades de perfusión del medio. Para lograr una velocidad de perfusión óptima pueden considerarse tres estrategias: a) Fijar la velocidad de perfusión a un valor constante durante la totalidad de la ejecución de la producción. Esta estrategia normalmente se prefiere en procesos de producción industrial, puesto que es más sencillo su funcionamiento de una manera robusta y constante. También tiene la ventaja de definir un coste medio del proceso porque no hay variación en la velocidad de perfusión de una ejecución a otra. b) Ajustar la velocidad de perfusión en respuesta al número de células y/o al consumo de nutrientes, tales como glucosa (Oh et al., 1994) (Dowd et al., 2001) (Gorenflo et al., 2003), glutamina (Gorenflo et al., 2002) u oxígeno (Kyung et al., 1994). Aunque esta estrategia proporciona un fundamento más científico para ajustar la velocidad de perfusión, puede conducir un sobrecrecimiento del cultivo y a un aumento fuera de control de la velocidad de perfusión. Cuando las células se cultivan en el modo de suspensión se realiza un sangrado del cultivo para evitar el sobrecrecimiento del cultivo, pero esto no es posible cuando las células están inmovilizadas sobre un vehículo. Por tanto, en general esta estrategia no se prefiere para operaciones de fabricación, porque es difícil de ejecutar de una manera robusta y constante, y la velocidad de perfusión del medio debe reajustarse a diario. c) Combinar ambas estrategias a) y b) con una fase de propagación celular inicial (o fase de crecimiento), en la 2 E06763472 25-10-2011   que la velocidad de perfusión aumenta de modo progresivo según las necesidades de crecimiento de las células durante la fase de crecimiento, seguido de un desplazamiento de las condiciones de cultivo, tales como la temperatura y/o el pH, para estabilizar y mantener el metabolismo celular a un nivel relativamente bajo y constante. En esta etapa, la velocidad de perfusión puede reducirse hasta un valor fijo, que se corresponde con las menores necesidades de las células a lo largo de la fase de producción. Se sabe que la modificación de la velocidad de perfusión durante un proceso de perfusión, así como la modificación de otros factores del bioproceso, puede influir en la calidad de la proteína recombinante y, en particular, en su patrón de glicosilación (Jenkins et al., 1996) (Andersen et al., 2000). La glicosilación habitualmente se reconoce como una función importante para la solubilidad, la inmunogenicidad, y las propiedades farmacocinéticas de las glicoproteínas humanas, y éstas son parámetros clave en la seguridad y la eficacia clínica de un producto (Goochee et al., 1991). En particular, la glicosilación afecta al plegamiento y a la secreción de muchas glicoproteínas, así como a su semivida plasmática, teniendo por tanto un impacto importante en la biología y la actividad in vivo de las proteínas glicosiladas. En general, el término glicosilación de una proteína se refiere a la formación de un enlace azúcar-aminoácido. La glicosilación es un acontecimiento crucial en la biosíntesis de las unidades carbohidrato de las glicoproteínas (segregadas). Pone en marcha una serie compleja de etapas enzimáticas postraduccionales que conducen a la formación de una multitud de oligosacáridos unidos a proteínas con diversas funciones biológicas. Las glicoproteínas de mamífero normalmente contienen tres tipos de glicanos constituyentes: los glicanos Nenlazados, que se unen a la asparagina a través de un resto N-acetilglucosamina (GlcNAc) en un motivo Asn-Xxx- (Ser, Thr), en el que Xxx puede ser cualquier aminoácido excepto prolina; los que están unidos a serina o treonina, denominados glicanos O-enlazados; y los componentes de carbohidrato del glicosilfosfatidilinositol. Aunque son posibles muchas variaciones, las antenas de los glicanos maduros consisten habitualmente en una o más unidades de N-acetil-lactosamina, terminando las cadenas en ácido siálico o en galactosa -enlazada. Con frecuencia se encuentra a la fucosa unida al resto GlcNAc unido a asparagina, y a menudo también en las antenas. Otras modificaciones habituales en la estructura básica incluyen un resto GlcNAc unido en la posición 4 del resto manosa ramificado de la parte central, denominado resto GlcNAc bisecante, y grupos sulfato que pueden estar en una diversidad de localizaciones, en la parte central y en las antenas. La biosíntesis de estos compuestos implica la unión de la asparagina a un glicano que contenga la parte central de trimanosilquitobiosa, junto con seis restos manosa y tres restos glucosa adicionales, seguido de la eliminación de la glucosa y de los cuatro restos manosa. Entonces diversas otras glicosil transferasas y glicosidasas procesan la estructura de (GlcNAc)2(Man)5 para producir el glicano maduro. Este proceso produce tres tipos generales de glicanos N-enlazados dependiendo del grado de procesamiento: glicanos con alto contenido en manosa, en los que sólo hay restos manosa en las dos antenas; glicanos híbridos, en los que una antena se procesa; y glicanos complejos, en que se modifican ambas antenas. Los glicanos O-enlazados, por otra parte, son mucho más diversos, y varían de monosacáricos a grandes polisacáridos sulfatados sin una estructura central ni secuencia consenso de aminoácidos comunes en el sitio de unión (Harvey, 2001). Una de estas proteínas glicosiladas de interés terapéutico es la proteína... [Seguir leyendo]

1.- Un proceso de perfusión para producir una proteína de unión a interleuquina-18 (IL-18BP) recombinante en células de mamífero en un biorreactor en condiciones de cultivo sin suero que comprende: a) una fase de propagación celular a aproximadamente 37,5 ºC con una velocidad de perfusión dada (100%); b) una fase de producción I a 33-34 ºC con una velocidad de perfusión que varía de aproximadamente 85% a aproximadamente 65% de la velocidad de perfusión de la etapa a); c) una fase de producción II a 32-33 ºC con una velocidad de perfusión que varía de aproximadamente 85% a aproximadamente 65% de la velocidad de perfusión de la etapa a). 2.- El proceso de perfusión según la reivindicación 1, en el que la velocidad de perfusión de la etapa b) o la etapa c) varía de aproximadamente 80% a aproximadamente 70% de la velocidad de perfusión de la etapa a). 3.- El proceso de perfusión según la reivindicación 1, en el que la velocidad de perfusión de la etapa b) o la etapa c) es aproximadamente 75% de la velocidad de perfusión de la etapa a). 4.- El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la velocidad de perfusión de la etapa a) tiene una velocidad de dilución en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 3, calculada como litros de medio por libro del volumen de trabajo del sistema total por día (vvd), preferiblemente de aproximadamente 2,5 vvd. 5.- El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células se asocian a vehículos, y la fase de producción I de la etapa b) comienza a una velocidad de consumo de glucosa de aproximadamente 250 a 350 g de glucosa por kilogramo de vehículo. 6.- El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células de mamífero son células de ovario de hámster chino (CHO). 7.- El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de recolectar el sobrenadante del cultivo celular. 8.- El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de purificar la IL-18BP. 9.- El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa de formular la IL-18BP en una composición farmacéutica. E06763472 25-10-2011   26 E06763472 25-10-2011   27 E06763472 25-10-2011   28 E06763472 25-10-2011   29 E06763472 25-10-2011   E06763472 25-10-2011   31 E06763472 25-10-2011   32 E06763472 25-10-2011   33 E06763472 25-10-2011   34 E06763472 25-10-2011   E06763472 25-10-2011   36 E06763472 25-10-2011   37 E06763472 25-10-2011   38 E06763472 25-10-2011   39 E06763472 25-10-2011