Un organismo transgénico productor de PHA seleccionado de bacterias o plantas,

organismo que expresa una PHA-sintasa y expresa adicionalmente un transgén que codifica una enzima que tiene la actividad catalítica de 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, en el cual el organismo comprende adicionalmente uno o más transgenes que codifican enzimas que tienen la actividad catalítica de acil-CoA-sintetasa o acil-CoA-transferasa de tal modo que PHA que comprende (D)-3-hidroxiácidos de longitud de cadena media se acumula por el camino de la biosíntesis de los ácidos grasos

Producción de polihidroxialcanoatos de longitud media de cadena por caminos de biosíntesis de ácidos grasos.

Antecedentes de la invención

Numerosos microorganismos tienen la capacidad de acumular reservas intracelulares de poli[(R)-3-hidroxialcanoatos] (PHAs). Los PHAs son materiales termoplásticos biodegradables y biocompatibles, producidos a partir de fuentes renovables, con una extensa gama de aplicaciones industriales y biomédicas (Williams y Peoples, 1996, CHEMTECH 26, 38-44). Los biopolímeros PHA abarcan una amplia clase de poliésteres con diferentes composiciones de monómeros y una extensa gama de propiedades físicas. Hasta la fecha se han incorporado aproximadamente 100 monómeros diferentes en los polímeros PHA (Steinbüchel y Valentin, 1995, FEMS Microbiol. Lett. 128; 219-228). Los PHAs pueden dividirse en dos grupos de acuerdo con la longitud de sus cadenas laterales. Aquéllos que tienen cadenas laterales cortas, tales como polihidroxibutirato (PHB), un homopolímero de unidades de ácido R-3-hidroxibutírico, son termoplásticos cristalinos, mientras que los PHAs con cadenas laterales de longitud media, tales como ácido polihidroxioctanoico o polihidroxidecanoico, son más elastómeros.

En las bacterias, cada grupo PHA se produce por un camino específico. En el caso de los PHAs con grupos colgantes cortos, están implicadas tres enzimas, una ß-cetotiolasa, una acetoacetil-CoA-reductasa, y una PHA-sintasa. Por ejemplo, en la biosíntesis de PHB, dos moléculas de acetil-coenzima A son fusionadas por una ß-cetotiolasa para producir acetoacetil-coenzima A. La última se reduce luego al compuesto intermedio quiral R-3-hidroxibutiril-coenzima A por la reductasa, y es polimerizada subsiguientemente por la enzima PHA-sintasa. Las PHA-sintasas de longitud de cadena corta permiten típicamente la polimerización de monómeros de hidroxiácidos C3-C5 que incluyen a la vez unidades de 4-hidroxiácidos y 5-hidroxiácidos. Este camino de biosíntesis se encuentra en numerosas bacterias tales como Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Zoogloea ramigera, etc (Madison, L.L. & Huisman, G.W. Microbiology and Molecular Biology Reviews 1999, 63, 21-53).

Las PHAs con grupos colgantes de longitud de cadena media son producidas por muchas bacterias Pseudomonas diferentes. Las unidades monómeras de hidroxiacetil-coenzima A pueden originarse por caminos de ß-oxidación de ácidos grasos y biosíntesis de ácidos grasos. Las unidades monómeras se convierten luego en polímero por las PHA-sintasas que tienen especificidades de sustrato que favorecen las unidades monómeras mayores C6-C14 (Madison, L. L. & Huisman, G. W. Microbiology and Molecular Biology Reviews 1999, 63, 21-53). Se ha encontrado que, en los organismos Pseudomonas, las PHA-sintasas responsables de la producción de los PHAs de grupos colgantes largos están codificadas en el locus pha, específicamente por los genes phaA y phaC (U.S.5.245.023; U.S. 5.250.430; Huisman et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:2191-2198).

Copolímeros constituidos por grupos colgantes de longitud de cadena corta y media pueden producirse también en bacterias que poseen una PHA-sintasa con una especificidad de sustrato amplia. Por ejemplo, Pseudomonas sp. A33 (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995, 42, 901-909), Pseudomonas sp. 61-3 (Kato, M., Bao, H. J., Kang, C.-K, Fukui, T., Doi, Y. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 45, 363-370), y Thiocapsa pfennigii (U.S. 6.011.144) poseen todas ellas PHA-sintasas que, según se ha informado, producen copolímeros de unidades monómeras de longitud de cadena corta y media.

Una enzima codificada por phaG fue identificada recientemente a la vez en Pseudomonas putida y Pseudomonas aeruginosa y se ha informado que es el enlace entre la biosíntesis de los ácidos grasos y la formación de PHA de longitud de cadena media (véase Camino A en la Figura 1) en estos organismos (Rehm, B. H. A., Kruger, N., Steinbuchel, A. J. Biol. Chem. 1998, 273, 24044-24051; WO 98/06854; U. S. 5.750.848; Hoffmann, N., Steinbuchel, A., Rehm, B. H. A. FEMS Microbiology Letters, 2000, 184, 253-259). En estos estudios, PhaG se identificó como una proteína-coenzima A-transferasa portadora de 3-hidroxiacil-acilo basándose en la capacidad de las preparaciones parcialmente purificadas de la enzima para convertir 3-hidroxidecanoil-CoA en presencia de ACP en 3-hidroxidecanoil-ACP (Rehm, B. H. A., Kruger, N., Steinbuchel, A. J. Biol. Chem. 1998, 273, 24044-24051). La expresión de PhaG y PhaC en Pseudomonas fragi, un organismo que no produce naturalmente PHAs como material de almacenamiento, permitía la producción de PHAs a partir de gluconato (Fiedler, S., Steinbuchel, A., Rehm, B. H. A. Applied and Environmental Microbiology 2000, 66, 2117-2124). Sin embargo, no se observó polímero alguno después de la expresión de una sintasa de longitud de cadena media y PhaG en E. coli (Rehm, B. H. A., Kruger, N., Steinbuchel, A. J. Biol. Chem. 1998, 273, 24044-24051). Si bien E. coli es capaz de producir pequeñas cantidades de formas no granulares de PHB de peso molecular bajo (Reusch, R.N. Can. J. Microbiol. 1995, 41 (supl. 1), 50-54), como P. fragi, el mismo es incapaz de producir gránulos de polímero de almacenamiento.

La patente U.S. No. 5.750.848 consignó que el gen phaG de Pseudomonas putida codifica una actividad de 3-hidroxiacil-ACP-CoA-transferasa útil para producir precursores de (D)-3-hidroxiacil-CoA para la biosíntesis de biopolímeros de polihidroxialcanoato (PHA) que comprenden unidades C8 y C10. Esta actividad no ha sido confirmada, sin embargo.

WO 00/55328 describe la creación de caminos metabólicos para la producción de PHA a partir del compuesto intermedio en la biosíntesis de ácidos grasos acil-ACP, utilizando 5 transgenes diferentes para producir un camino que inicialmente producirá ácidos grasos (C8) libres por el camino de síntesis de ácidos grasos a través de la acción de tioesterasas, que añadirán entonces un resto CoA al ácido graso libre por la acción de una acil-CoA-sintetasa, que producirá 3-cetoacil-CoAs a partir de la acil-CoA por la acción de una tiolasa, que producirá R-(-)-OH-acil-CoAs a partir de las 3-cetoácido-CoAs por la acción de una isoforma de deshidrogenasa de levaduras. Estas R-(-)-3-OH-acil-CoAs se utilizarán finalmente como sustrato para la reacción de la PHA-sintasa.

Es por consiguiente un objeto de la presente invención expresar PhaG en asociación con una acil-CoA-sintetasa y una PHA-sintasa en un organismo para la producción de PHAs.

Por tanto, es un objeto adicional de la presente invención expresar PhaG en asociación con una acil-CoA-sintetasa y una PHA-sintasa en un organismo para la producción de PHAs de longitud de cadena media.

Sumario de la invención

Se ha descubierto que un sistema recombinante de E. coli que expresa el gen phaG y el gen de PHA-sintasa 1 de Pseudomonas oleovorans no acumula PHAs de longitud de cadena media. No obstante, se encontró que el medio contenía niveles significativos de 3-hidroxiácidos. Se ha demostrado ahora que la proteína PhaG se comportaba como una 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa. Un sistema de E. coli que expresa el gen phaG, el gen phaC1 y el gen alkK produce PHA. Estos resultados no sólo proporcionan nuevos enfoques de ingeniería metabólica para producir PHAs en E. coli u otras bacterias sino que proporcionan varios nuevos enfoques para producir PHAs en otros organismos, por ejemplo, cosechas de plantas.

Los métodos descritos en esta memoria incluyen expresar enzimas que tienen actividad de 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa en los plástidos de las hojas o semillas de cosechas de plantas o en un organismo distinto de una planta tal como bacterias en asociación con, por ejemplo, una acil-CoA-sintetasa o CoA-transferasa, o un gen o genes de PHA-sintasa, en el caso de una sintasa de 2 subunidades, en el peroxisoma, el citosol o los plástidos de plantas superiores. En algunos casos tales como la expresión de plástidos de la tioesterasa y PHA-sintasa, es también útil expresar un gen que tenga una actividad de 3-hidroxiacil-CoA-sintetasa en el plástido. En los casos en que la PHA-sintasa se expresa en el citosol, puede ser opcionalmente útil aumentar la expresión de un gen o genes que codifican una enzima que tiene la actividad catalítica de una (D)-3-hidroxiacil-CoA-sintetasa. En los casos en que la PHA-sintasa está direccionada al peroxisoma, puede ser útil también direccionar una enzima que tenga la...

1. Un organismo transgénico productor de PHA seleccionado de bacterias o plantas, organismo que expresa una PHA-sintasa y expresa adicionalmente un transgén que codifica una enzima que tiene la actividad catalítica de 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, en el cual el organismo comprende adicionalmente uno o más transgenes que codifican enzimas que tienen la actividad catalítica de acil-CoA-sintetasa o acil-CoA-transferasa de tal modo que PHA que comprende (D)-3-hidroxiácidos de longitud de cadena media se acumula por el camino de la biosíntesis de los ácidos grasos.

2. El organismo de la reivindicación 1, en el cual la acil-CoA-sintetasa es 3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.

3. El organismo de la reivindicación 1, en el cual la acil-CoA-sintetasa es alkK.

4. El organismo de la reivindicación 1 ó 2, que expresa adicionalmente un transgén que codifica una PHA-sintasa.

5. El organismo de la reivindicación 1 ó 4, que expresa adicionalmente una actividad de 3-hidroxiacil-CoA-sintetasa heteróloga.

6. El organismo de la reivindicación 1 que expresa una enzima seleccionada del grupo constituido por 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, PHA-sintasa de longitud de cadena media, y acil-CoA-sintasa de 3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media, en donde el organismo es una célula de planta, un tejido de planta, o una planta entera.

7. El organismo de la reivindicación 6, que expresa adicionalmente genes marcadores seleccionables, en donde el organismo es una planta entera.

8. El organismo de la reivindicación 1 que expresa una enzima seleccionada del grupo constituido por 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, una PHA-sintasa que incorpora hidroxiácidos de longitud de cadena media, y acil-CoA-sintetasa de 3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media, en donde el organismo es una bacteria.

9. El organismo de la reivindicación 6, en el cual la expresión del transgén está direccionada a un tejido u orgánulo seleccionado del grupo constituido por semillas, hojas, plástidos, y peroxisomas.

10. El organismo de la reivindicación 8, en el cual la bacteria es E. coli y el PHA se acumula dentro de la bacteria.

11. Un método de manipulación genética de un camino biosintético de PHA en un organismo transgénico seleccionado del grupo constituido por plantas y bacterias, en el cual el organismo expresa una PHA-sintasa, comprendiendo el método proporcionar al organismo uno o más constructos que comprenden un transgén que codifica una enzima que tiene la actividad catalítica de 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, y uno o más transgenes que codifican enzimas que tienen la actividad catalítica de acil-CoA-sintetasa o acil-CoA-transferasa de tal modo que PHA que comprende (D)-3-hidroxiácidos de longitud de cadena media se acumula por el camino de la biosíntesis de los ácidos grasos.

12. El método de la reivindicación 11, en el cual el uno o más constructos comprenden un transgén que codifica una enzima que tiene la actividad catalítica de 3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.

13. El método de la reivindicación 12, en el cual el uno o más constructos comprenden adicionalmente un transgén que codifica una PHA-sintasa.

14. El método de la reivindicación 13, en el cual el organismo es una planta.

15. El método de la reivindicación 13, en el cual el uno o más constructos expresan una enzima seleccionada del grupo constituido por 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, PHA-sintasa de longitud de cadena media, y acil-CoA-sintasa de 3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media, en el cual el organismo es una célula de planta, tejido de planta, o planta entera.

16. El método de la reivindicación 13, en el cual el uno o más constructos expresan una enzima seleccionada del grupo constituido por 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, una PHA-sintasa que incorpora hidroxiácidos de longitud de cadena media, y acil-CoA-sintetasa de 3-hidroxiácido graso de longitud de cadena media, en el cual el organismo es una bacteria.

17. Un método de fabricación de PHA que comprende (D)-3-hidroxiácidos de longitud de cadena media que comprende cultivar un organismo transgénico productor de PHA seleccionado de una planta o bacteria, organismo que expresa una PHA-sintasa y expresa adicionalmente un transgén que codifica una enzima que tiene la actividad catalítica de 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, y uno o más transgenes que codifican enzimas que tienen la actividad catalítica de acil-CoA-sintetasa o acil-CoA-transferasa.

18. El método de la reivindicación 17, en el cual la acil-CoA-sintetasa es 3-hidroxiacil-CoA-sintetasa.

19. El método de la reivindicación 17 ó 18, en el cual el organismo expresa adicionalmente un transgén que codifica una PHA-sintasa.

20. El método de la reivindicación 18, en el cual el organismo expresa una enzima seleccionada del grupo constituido por 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, PHA-sintasa de longitud de cadena media, y acil-CoA-sintasa de 3-hidroxiácidos grasos de longitud de cadena media, en el cual el organismo es una célula de planta, un tejido de planta, o una planta entera.

21. El método de la reivindicación 18, en el cual el organismo expresa una enzima seleccionada del grupo constituido por 3-hidroxiacil-ACP-tioesterasa, una PHA-sintasa que incorpora hidroxiácidos de longitud de cadena media, y acil-CoA-sintasa de 3-hidroxiácidos grasos de longitud de cadena media, en el cual el organismo es una bacteria.

22. El organismo de la reivindicación 8, en el cual la bacteria es E. coli, y en el cual se secretan 3-hidroxiácidos en el medio de cultivo.