Una célula huésped de hongo unicelular o multicelular que es capaz de producir glucoproteínas que comprenden una estructura nuclear de N-glucano triantenario,

en la que las células huésped son genomanipuladas para que produzcan glucoproteínas que tienen un N-glucano GlcNAc2Man3GlcNAc2 y en la que las células huésped además incluyen un ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa IV exógena GnT IVB (Δ104-53) humana fusionado con los nucleótidos 1-108 del gen MNN2 de S. cerevisiae que actúa como péptido de señalización de direccionamiento celular no asociado normalmente con el dominio catalítico, que dirige dicho dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped.

Producción de glucoproteínas modificadas con múltiples estructuras antenarias.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones por los que células huésped eucariotas no humanas, como por ejemplo células de hongos unicelulares y multicelulares, pueden modificarse genéticamente para que produzcan proteínas glucosiladas (glucoproteínas) con patrones de glucosilación similares a los de las glucoproteínas producidas por células animales, especialmente células humanas, que son útiles como agentes terapéuticos en seres humanos o animales.

Antecedentes de la invención

Rutas de glucosilación en seres humanos y eucariotas inferiores

Después de que el ADN se transcribe y traduce a proteína, el procesamiento postraduccional posterior supone la unión de restos de azúcares, un procedimiento conocido como glucosilación. Los diferentes organismos producen diferentes enzimas de glucosilación (glucosiltransferasas y glucosidasas), y tienen diferentes sustratos (azúcares de nucleótidos) disponibles, de forma que los patrones de glucosilación así como la composición de los oligosacáridos individuales, incluso en la misma proteína, serán diferentes dependiendo del sistema huésped en el que se esté expresando la proteína particular. Las bacterias habitualmente no glucosilan las proteínas y, si lo hacen, únicamente de forma muy inespecífica (Moens y Vanderleyden (1997) Arch Microbiol. 168 (3):169-175). Los eucariotas inferiores como por ejemplo los hongos filamentosos y las levaduras añaden principalmente las azúcares manosa y manosilfosfato. El glucano resultante se conoce como glucano de tipo "alto en manosa" o manano. Las células vegetales y las células de insectos (como por ejemplo las células Sf9) glucosilan las proteínas de otra forma distinta adicional. Por el contrario, en los eucariotas superiores como por ejemplo los seres humanos, la cadena lateral del oligosacárido en desarrollo puede recortarse para eliminar diversos restos de manosa y alargarse con restos de azúcares adicionales que habitualmente no se encuentran en los N-glucanos de eucariotas inferiores. Véase, por ejemplo, Bretthauer et al. (1999) Biotechnology and Applied Biochemistry 30:193-200; Martinet, et al. (1998) Biotechnology Letters 20:1171-1177; Weikert, et al. (1999) Nature Biotechnology, 17:1116-1121; M. Malissard, et al. (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications 267:169-173; Jarvis, et al., (1998) Current Opinion in Biotechnology 9:528-533; y Takeuchi (1997) Trends in Glycoscience and Glycotechnology 9:S29-S35.

La síntesis de una estructura de oligosacárido de tipo mamífero se inicia con un conjunto de reacciones secuenciales en cuyo transcurso se añaden y se eliminan restos de azúcares mientras la proteína progresa por la ruta secretora del organismo huésped. Las enzimas que se encuentran a lo largo de la ruta de glucosilación del organismo o célula huésped determinan los patrones de glucosilación resultantes de las proteínas segregadas. Así, el patrón de glucosilación de proteínas resultante expresado en las células huésped de eucariotas inferiores difieren sustancialmente del patrón de glucosilación de las proteínas expresadas en los eucariotas superiores como por ejemplo seres humanos y otros mamíferos (Bretthauer, 1999). La estructura de un N-glucano fúngico típico se muestra en la Figura 1A.

Las etapas tempranas de la glucosilación humana pueden dividirse al menos en dos fases diferentes: (i) los oligosacáridos ligados a lípidos Glc₃Man₉GlcNAc₂ se ensamblan mediante un conjunto de reacciones secuenciales en la membrana del retículo endoplasmático (RE) (Figura 13) y (ii) la transferencia de este oligosacárido desde el ancla lipídica doliquilpirofosfato sobre la proteína sintetizada de novo. El sitio de la transferencia específica se define mediante un resto asparragina (Asn) de la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (SEC. ID. N.º: 1 y 2) donde Xaa puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Gavel y von Heijne (1990) Protein Eng. 3:433-42). Se produce un procesamiento adicional mediante glucosidasas y manosidasas en el RE antes de que la glucoproteína en formación sea transferida al aparato de Golgi cis, donde los restos adicionales de manosa son eliminados por las alfa (α)-1,2-manosidasas específicas del aparato de Golgi. El procesamiento continúa mientras la proteína pasa a través del aparato de Golgi. En el aparato de Golgi medio, un número de enzimas modificadoras, que incluyen N-acetilglucosaminil transferasas (GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV y GnTV), manosidasa II y fucosiltransferasas, añaden y eliminan restos de azúcares específicos. Finalmente, en el aparato de Golgi trans, las galactosiltranferasas (GalT) y sialiltransferasas (ST) producen una estructura de glucoproteína que se libera desde el aparato de Golgi. Es esta estructura, que se caracteriza por estructuras biantenarias, triantenarias y tetraantenarias, que contienen galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina y un alto grado de ácido siálico terminal, la que proporciona a las glucoproteínas sus características humanas. La estructura de un N-glucano humano típico se muestra en la Figura 1B. Véanse también las Figuras 14 y 15 para las etapas del procesamiento de N-glucanos de tipo mamífero.

En todos los eucariotas estudiados hasta la fecha, las glucoproteínas se derivan de un precursor oligosacárido ligado a lípidos común: Gl₃Man₉GlcNAc₂-dolicol-pirofosfato. Dentro del retículo endoplasmático, la síntesis y procesamiento de los oligosacáridos unidos a dolicol pirofosfato son idénticos entre todos los eucariotas conocidos. Sin embargo, el procesamiento posterior del oligosacárido nuclear por las células fúngicas, por ejemplo, las levaduras, difiere significativamente del de los seres humanos al desplazarse por la ruta secretora.

En las levaduras, estas etapas se catalizan mediante manosiltransferasas que residen en el aparato de Golgi, como OChlp, Mntlp y Mnnlp, que secuencialmente añaden azúcares manosa al oligosacárido nuclear. La estructura resultante es indeseable para la producción de proteínas humanoides y por lo tanto es deseable reducir o eliminar la actividad de la manosil transferasa. Los mutantes de S. cerevisiae, deficientes en actividad de manosil transferasa (por ejemplo mutantes de och1 o mnn9) han demostrado que no son letales y presentan un menor contenido en manosa en el oligosacárido de las glucoproteínas de las levaduras. También podrían tener que eliminarse otros enzimas para el procesamiento de oligosacáridos, como por ejemplo manosilfosfato transferasa dependiendo del patrón de glucosilación particular del huésped.

Precursores de nucleótidos con azúcares

Los N-glucanos de las glucoproteínas animales habitualmente incluyen galactosa, fucosa, y ácido siálico terminal. Estas azúcares no se encuentran en las glucoproteínas producidas en levaduras ni en hongos filamentosos. En los seres humanos, se sintetiza todo el abanico de azúcares de nucleótidos (por ejemplo UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina, CMP-ácido N-acetilneuramínico, UDP-galactosa, GDP-fucosa, etc.) en el citosol y se transportan al aparato de Golgi, donde se unen al oligosacárido nuclear mediante glucosiltransferasas. (Sommers y Hirschberg (1981) J. Cell Biol. 91(2):A406-A406; Sommers y Hirschberg (1982) J. Biol. Chem. 257(18):811-817; Perez and Hirschberg (1987) Methods in Enzymology 138:709-715).

Las reacciones de transferencia de glucosilo habitualmente proporcionan un producto secundario que es un nucleósido difosfato o monofosfato. Mientras que los monofosfatos pueden exportarse directamente en un intercambio con las azúcares de nucleósido trifosfato mediante un mecanismo antiporte, los difosfonucleósidos (por ejemplo GDP) tienen que ser escindidos por las fosfatasas (por ejemplo GDPasa) proporcionando nucleósido monofosfatos y fosfato inorgánico antes de ser exportados. Esta reacción es importante para la glucosilación eficaz; por ejemplo, se ha encontrado que la GDPasa de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) es necesaria para la manosilación. Sin embargo, esa GDPasa tiene una actividad un 90% menor sobre UDP (Berninsone et al., 1994 J. (1994) J. Biol. Chem. 269(1):207-211). Los eucariotas inferiores habitualmente carecen de actividad de difosfatasa específica de UDP en el aparato de Golgi dado que no utilizan precursores... [Seguir leyendo]

1. Una célula huésped de hongo unicelular o multicelular que es capaz de producir glucoproteínas que comprenden una estructura nuclear de N-glucano triantenario, en la que las células huésped son genomanipuladas para que produzcan glucoproteínas que tienen un N-glucano GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂ y en la que las células huésped además incluyen un ácido nucleico que codifica el dominio catalítico de la N-acetilglucosaminiltransferasa IV exógena GnT IVB (Δ104-53) humana fusionado con los nucleótidos 1-108 del gen MNN2 de S. cerevisiae que actúa como péptido de señalización de direccionamiento celular no asociado normalmente con el dominio catalítico, que dirige dicho dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped.

2. La célula huésped de la reivindicación 1, en la que la estructura triantenaria producida en dicha célula huésped comprende la ramificación del de oligosacárido GlcNAc β 1,2 - Manα1,6 (GlcNAc β1,4 GlcNAc β 1,2 Manα1,3) Man β1,4 - GlcNAc β1,4 - GlcNAcβ 1,4 - Asn.

3. La célula huésped de hongo unicelular o multicelular de la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha célula huésped además incluye un ácido nucleico que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa exogénea para producir una glucoproteína que tiene una estructura nuclear de N-glucano tetraantenario fusionado a un péptido de señalización de direccionamiento celular no asociado normalmente al dominio catalítico, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped.

4. La célula huésped de hongo unicelular o multicelular de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la célula huésped incluye además un ácido nucleico que codifica un dominio catalítico de N-acetilglucosaminiltransferasa IX exógeno fusionado a un péptido de señalización de direccionamiento celular no asociado normalmente al dominio catalítico, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped para producir la glucoproteína que tiene la estructura nuclear del N-glucano tetraantenario.

5. La célula huésped de la reivindicación 3 ó 4, en la que dichas estructuras tetraantenarias producidas por dicha célula huésped comprenden estructuras de GlcNAc₄Nan₃GlcNAc₂ que pueden sufrir reacciones adicionales por GnT VI.

6. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha célula huésped además comprende un ácido nucleico que codifica una enzima que tiene actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa III.

7. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicha célula huésped es deficiente en una actividad de manosiltransferasa OCH1 y/o en una actividad de manosiltransferasa Dol-P-Man:Man₅GlcNAc₂-PP-Dol.

8. La célula huésped de cualquiera de reivindicaciones 1 a 7, en la que dicha célula huésped está genomanipulada además para que exprese niveles más elevados de actividad del transportador de UDP-GlcNAc para aumentar los niveles de UDP-GlcNAc en la célula.

9. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la célula huésped se selecciona a partir del grupo constituido por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minutia, Ogataea minuta, Pichia Iindneri, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces laetis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, y Neurospora crassa.

10. La célula huésped de la reivindicación 9, en la que la célula huésped es Pichia pastoris.

11. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la glucoproteína es una proteína terapéutica.

12. La célula huésped de la reivindicación 11, en la que la proteína terapéutica se selecciona a partir del grupo constituido por dominios kringle de plasminógeno humano, eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de urea tripsina, proteína que se une a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor liberador de hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular-2, factor inhibidor progenitor mieloide-1, osteoprotegerina, antitripsina α-1, ADNasa II, α-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (proteína de unión a TNF 1), TACI-Ig (activador transmembrana y modulator del calcio e interactor con los ligandos de ciclofilina), FSH (hormona estimulante de folículos), GM-CSF, GLP-1 con o sin FC (proteína glucagonoide 1), agonista del receptor IL-1, sTNRr (fusión de TNF soluble y receptor Fc), ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4-lg).

13. Un procedimiento para producir una glucoproteína que comprende expresar un ácido nucleico que codifica la glucoproteína en una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha glucoproteína comprende N-glucanos que tienen estructuras triantenarias.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha glucoproteína comprende N-glucanos que tienen estructuras tetraantenarias.

16. El procedimiento de cualquiera de reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha glucoproteína además comprende un resto GlcNAc diseccionado.

17. El procedimiento de cualquiera de reivindicaciones 13 a 16, en el que dicha glucoproteína carece de fucosa.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que dicha glucoproteína se selecciona a partir del grupo constituido por dominios kringle de plasminógeno humano, eritropoyetina, citocinas, factores de coagulación, cadena a del receptor de IgE soluble, IgG, fragmentos de IgG, IgM, interleucinas, urocinasa, quimasa, inhibidor de urea tripsina, proteína que se une a IGF, factor de crecimiento epidérmico, factor liberador de hormona del crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina, factor de crecimiento endotelial vascular-2, factor inhibidor progenitor mieloide-1, osteoprotegerina, antitripsina α-1, ADNasa II, α-fetoproteínas, AAT, rhTBP-1 (proteína de unión a TNF 1), TACI-Ig (activador transmembrana y modulator del calcio e interactor con los ligandos de ciclofilina), FSH (hormona estimulante de folículos), GM-CSF, GLP-1 con o sin FC (proteína glucagonoide 1), agonista del receptor IL-1, sTNRr (fusión de TNF soluble y receptor Fc), ATIII, rhTrombina, glucocerebrosidasa y CTLA4-lg (antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4-lg).

19. El procedimiento de cualquiera de reivindicaciones 13 a 18, que además comprende la etapa de aislar la glucoproteína del huésped.

20. Una composición farmacéutica que comprende una composición de glucoproteína producida por una cualquiera de las células huésped de las reivindicaciones 1 a 11, en la que más del 50% molar de las estructuras nucleares de los N-glucanos de las glucoproteínas de dicha composición tienen estructuras triantenarias.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que dichas estructuras triantenarias comprenden al menos tres GlcNAc sobre un oligosacárido Man₃GlcNAc₂.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 20 ó 21, en la que algunas o todas las estructuras triantenarias comprenden la ramificación del oligosacárido GlcNAc β1,2 - Manα1,6 (GlcNAc β1,4 GlcNAc β1,2 Manα1,3) Man β1,4 - GlcNAc β1,4 GlcNAcβ 1,4 - Asn.

23. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en la que más del 50% molar o más de 75% molar de las estructuras nucleares de los N-glucanos están modificadas además por GnTV.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en la que algunas o todas las estructuras modificadas con GnTV comprenden la ramificación del oligosacárido GlcNAc β1,4 GlcNAc β1,2 - Manα1,6 (GlcNAc β1,4 GlcNAc β1,2 Manα1,3) Man β1,4GlcNAc β1,4 - GlcNAcβ1,4 - Asn.

25. Las composiciones farmacéuticas de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en las que dichas glucoproteínas de dicha composición carecen de fucosa.

26. Un vector capaz de expresar en una célula huésped de hongo unicelular o multicelular una enzima que tiene actividad de N-acetilglucosaminiltransferasa IV (GnT IV) que es sustancialmente intracelular, en el que dicha enzima comprende el dominio catalítico de GnT IVB humana (Δ104-53) fusionado al péptido de señalización de direccionamiento celular MNN2 de S. cerevisiae (1-36) no asociado normalmente con el dominio catalítico, que dirige el dominio catalítico al RE o al aparato de Golgi de dicha célula huésped.