Producción de ácido dicarboxílico en levadura recombinante.

Una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima heteróloga que cataliza la conversión de ácido málico a ácido fumárico,

en la que la enzima tiene una identidad de al menos el 70% con SEQ ID NO: 3, en la que la enzima es activa en el citosol con la expresión de la secuencia nucleotídica.

Producción de ácido dicarboxílico en levadura recombinante

La presente invención se refiere a una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, y a un procedimiento para la producción de un ácido dicarboxílico.

Los ácidos dicarboxílicos, tales como ácido fumárico y ácido succínico, son precursores potenciales para numerosos productos químicos. Por ejemplo, el ácido succínico se puede convertir en 1, 4-butanodiol (BDO) , tetrahidrofurano y gamma-butirolactona. Otro producto derivado de ácido succínico es un polímero de poliéster que se prepara enlazando ácido succínico y BDO.

El ácido succínico se produce predominantemente a través de procedimientos petroquímicos mediante hidrogenación de butano. Se considera que estos procedimientos son perjudiciales para el medio ambiente, y costosos. La producción fermentativa de ácido succínico puede ser un procedimiento alternativo atractivo para la producción de ácido succínico, en el que se puede usar un material de alimentación renovable como fuente de carbono.

Se sabe que cierto número de diferentes bacterias, tales como Escherichia coli y las bacterias de la panza Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Bacteroides, Mannheimia o Succinimonas sp., producen ácido succínico. La ingeniería metabólica de estas cepas bacterianas ha mejorado el rendimiento y/o productividad de ácido succínico,

o ha reducido la formación de subproductos.

El documento WO 2007/061590 describe una levadura negativa para piruvato descarboxilasa para la producción de ácido málico y/o ácido succínico, que se transforma con una enzima piruvato carboxilasa o una fosfoenolpiruvato carboxilasa, una enzima malato deshidrogenasa y una proteína transportadora de ácido málico (MAE) .

Pines et al., 1999 Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, p. 393.399, describen que la sobreexpresión de la fumarasa citosólica de S. cerevisiae en levadura no da como resultado acumulación de ácido fumárico, pero parece que potencia la producción de ácido L-málico.

A pesar de las mejoras que se han realizado en la producción fermentativa de ácido succínico, sigue existiendo una necesidad de microorganismos mejorados para la producción fermentativa de ácido succínico.

El objetivo de la presente invención es una levadura alternativa para la producción de un ácido dicarboxílico, tal como ácido fumárico y ácido succínico.

El objetivo se consigue de acuerdo con la invención con una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima heteróloga que cataliza la conversión ácido málico a ácido fumárico. Sorprendentemente, se encontró que se produjo una mayor cantidad de ácido dicarboxílico, tal como ácido fumárico y/o ácido succínico, mediante la levadura recombinante según la presente invención, en comparación con una levadura de tipo salvaje.

Como se usa aquí, una levadura recombinante según la presente invención se define como una célula que contiene, o se transforma o se modifica genéticamente con una secuencia nucleotídica y/o proteína que no aparece de forma natural en la levadura, o contiene una copia o copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico (o proteína) endógena. Una levadura de tipo salvaje se define aquí como la levadura progenitora de la levadura recombinante.

Preferiblemente, la enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico es activa en el citosol tras la expresión de la secuencia nucleotídica que codifica la enzima.

Una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, preferiblemente tiene actividad de fumarasa, preferiblemente la enzima es una fumarasa de E.C. 4.2.1.2.

Una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico puede derivar de cualquier origen adecuado, por ejemplo bacterias, levaduras, hongos, protozoos o plantas. Preferiblemente, la enzima según la presente invención deriva de Rhizopus or y zae.

Se demostró que la expresión de un gen fumR heterólogo de Rhizopus or y zae en Aspergillus niger no dio como resultado la producción de ácido succínico en condiciones limitadas de oxígeno (tesis doctoral, 2006 W.A. de Jongh, Biocentrum Technical University of Denmark) . Sorprendentemente, una levadura que expresa fumarasa heteróloga según la presente invención produjo una mayor cantidad de ácido succínico en condiciones limitadas de oxígeno en comparación con la levadura de tipo salvaje.

El término “homóloga”, cuando se usa para indicar la relación entre una molécula de ácido nucleico o polipéptido (recombinante) dada y un organismo hospedante o célula hospedante dado, se entiende que significa que en la naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido se produce por parte de una célula hospedante o de organismos de la misma especie, preferiblemente de la misma variedad o cepa.

El término “heterólogo”, cuando se usa con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteína, se refiere a un ácido nucleico o proteína que no se produce de forma natural como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en la que está presente, o que se encuentra en una célula o lugar o lugares en el genoma o la secuencia de ADN o ARN que difieren de aquellos en los que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos a la célula en la que se introducen, pero han sido obtenidos a partir de otra célula o han sido producidos por vía sintética o recombinante.

Preferiblemente, la levadura según la presente invención es una levadura que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico, en la que la enzima tiene al menos 70%, 75%, preferiblemente al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:1, o SEC ID NO:3, preferiblemente con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3, preferiblemente la enzima comprende secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3.

La identidad de secuencia se define aquí como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (poliipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos) , según se determina comparando las secuencias. Habitualmente, las secuencias se comparan a lo largo de toda la longitud de las secuencias comparadas. En la técnica, “identidad” significa también el grado de relación de la secuencia entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, según se determina por mediante el emparejamiento entre hebras de dichas secuencias.

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar el mayor emparejamiento entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la identidad son codificados en programas de ordenador públicamente disponibles. Los métodos de programas de ordenador preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen BLASTP y BLASTN, públicamente disponibles de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894) . Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos usando BLASTP son abertura de salto 11, 0, extensión de salto 1, matriz Blosum 62. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos usando BLASTP son abertura de salto 11, 0, extensión de salto 1, matriz completa de ADN (matriz de identidad de ADN) .

Una secuencia nucleotídica que codifica una enzima que cataliza la conversión de ácido málico en ácido fumárico en el citosol según la invención también se puede definir por su capacidad para hibridarse con secuencias nucleotídicas que codifican las enzimas de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en condiciones de hibridación moderadas, o preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas. Condiciones de hibridación rigurosas se definen aquí como condiciones que permiten que una secuencia de ácido nucleico de al menos alrededor de 25, preferiblemente alrededor de 50 nucleótidos, 75 ó 100 y, lo más preferible, de alrededor de 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de alrededor de 65ºC en una disolución que comprende una sal alrededor de 1 M, preferiblemente 6 x SSC (cloruro... [Seguir leyendo]

1. Una levadura recombinante que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una enzima heteróloga que

cataliza la conversión de ácido málico a ácido fumárico, en la que la enzima tiene una identidad de al menos el 70% 5 con SEQ ID NO: 3, en la que la enzima es activa en el citosol con la expresión de la secuencia nucleotídica.

2. Una levadura de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la enzima deriva de Rhizopus or y zae.

3. Una levadura de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la enzima es una fumarasa. 10

4. Una levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que pertenece a uno de los géneros Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, o Zygosaccharomyces.

5. Una levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una Saccharomyces cerevisiae 15 que comprende SEQ ID NO: 4.

6. Un procedimiento para la producción de ácido succínico, que comprende fermentar una levadura de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un medio de fermentación adecuado, en el que se produce el ácido succínico.