Producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos heterólogos usando sistemas de policétido sintasa de AGPI.

Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acil- CoA sintetasa

(ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (AGL) de AGPI de cadena larga en acil- CoA, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que es idéntica en al menos el 75% a una ACoAS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2007/064104.

Solicitante: DSM IP ASSETS B.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: HET OVERLOON 1 6411 TE HEERLEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: METZ,James G, LIPPMEIER,JAMES CASEY, KUNER,JERRY M.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION;... > A01H1/00 (Procedimientos de modificación de los genotipos (A01H 4/00 tiene prioridad))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/04 (Células o tejidos vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/04 (actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1))

PDF original: ES-2527875_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos heterólogos usando sistemas de policétido sintasa de AGPI

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al uso de proteínas auxiliares y dianas para mejorar la producción de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) y particularmente, AGPI de cadena larga (AGPICL), en un organismo huésped que se ha modificado genéticamente con un sistema de tipo PKS para producir tales AGPI (es decir, un sistema de PKS de AGPI o una AGPI sintasa). La presente invención también se refiere a los organismos que se han modificado genéticamente para expresar tales proteínas auxiliares o modificado con respecto a tales dianas, y a métodos de preparación y uso de tales organismos.

Antecedentes de la invención

Se considera que los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) son útiles para aplicaciones nutricionales, aplicaciones farmacéuticas, aplicaciones industriales y otros fines. Sin embargo, el suministro actual de AGPI a partir de fuentes naturales y a partir de síntesis química no es suficiente para las necesidades comerciales. Los aceites vegetales derivados de cosechas de semillas oleaginosas son relativamente baratos y no tienen los problemas de contaminación asociados con los aceites de pescado. Sin embargo, los AGPI encontrados en aceites vegetales desarrollados comercialmente se limitan normalmente a ácido linoleico (dieciocho carbonos con 2 dobles enlaces, en las posiciones delta 9 y 12 - 18:2 delta 9,12) y ácido linolénico (18:3 delta 9,12,15). Se requieren vahas enzimas desaturasa y elongasa separadas para la síntesis de ácidos grasos a partir de ácidos linoleico y linolénico para producir los AGPI más saturados y de cadena más larga. Por tanto, la modificación por ingeniería genética de células huésped vegetales para la expresión de AGPI tales como EPA y ácido docosahexaenoico (DHA) puede requerir la expresión de varias enzimas separadas para lograr la síntesis. Adicionalmente, para la producción de cantidades utilizables de tales AGPI, pueden requerirse esfuerzos de modificación por ingeniería genética adicionales. Por tanto, el descubrimiento de un sistema alternativo para la producción de AGPI, que es un sistema de tipo policétido sintasa, ha proporcionado una alternativa significativa a la modificación por ingeniería genética de plantas u otros organismos (por ejemplo, microorganismos) usando las desaturasas y elongasas de la ruta de síntesis de ácidos grasos "clásica" o "habitual".

Ha habido muchos esfuerzos para producir AGPI en plantas de cosecha de semillas oleaginosas mediante la modificación de los ácidos grasos producidos de manera endógena. La modificación genética de estas plantas con diversos genes individuales para ácido graso elongasas y desaturasas ha producido hojas o semillas que contienen niveles significativos de AGPI tales como EPA, pero que también contienen niveles significativos de AGPI menos insaturados y de cadena más corta (Qi et al., Nature Biotech. 22:739 (24); publicación PCT n.2 WO 4/71467; Abbadi et al., Plant Cell 16:1 (24)); Napier y Sayanova, Proceedings of the Nutrition Society (25), 64:387-393; Robert et al., Functional Plant Biology (25) 32:473-479; o la publicación de solicitud de patente estadounidense 24/172682.

Por tanto, sigue habiendo una necesidad en la técnica para un método para producir eficaz y eficientemente cantidades de lípidos (por ejemplo, triacilglicerol (TAG) y fosfolípido (PL)) enriquecidos en AGPI deseados en plantas de semillas oleaginosas.

Los sistemas de policétido sintasa (PKS) se conocen generalmente en la técnica como complejos enzimáticos relacionados con sistemas de ácido graso sintasa (FAS), pero que a menudo están altamente modificados para producir productos especializados que normalmente muestran poca semejanza con ácidos grasos. Sin embargo, se ha mostrado que existen sistemas de policétido sintasa en bacterias marinas y determinadas microalgas que pueden sintetizar ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) a partir de acetil-CoA y malonil-CoA. Estos sistemas se denominan en el presente documento sistemas de PKS de AGPI, sistemas de tipo PKS para la producción de AGPI o sistemas de AGPI sintasa, todos los cuales se usan de manera intercambiable en el presente documento.

Las rutas de PKS de AGPI para la síntesis de AGPI en Shewanella y otras bacterias marinas, Vibrio marinus, se describen en detalle en la patente estadounidense n.2 6.14.486. Las rutas de PKS de AGPI para la síntesis de AGPI en el traustoquitridio eucariota, Schizochytrium, se describe en detalle en la patente estadounidense n.2 6.566.583. Las rutas de PKS de AGPI para la síntesis de AGPI en eucariotas tales como miembros de Thraustochytriales, incluyendo la descripción adicional de un sistema de PKS de AGPI en Schizochytrium y la identificación de un sistema de PKS de AGPI en Thraustochytrium, incluyendo detalles referentes a usos de estos sistemas, se describen en detalle en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.2 22194641, publicada el 19 de diciembre de 22, y en la publicación PCT n.2 WO 26/135866, publicada el 21 de diciembre de 26. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.2 24235127, publicada el 25 de noviembre de 24, da a conocer la descripción estructural detallada de un sistema de PKS de AGPI en Thraustochytrium, y detalle adicional referente a la producción de ácido eicosapentaenoico (C2:5, co-3) (EPA) y otros AGPI usando tales sistemas. La publicación de solicitud de patente estadounidense n.2 251995, publicada el 12 de mayo de 25,

da a conocer la descripción estructural y funcional de sistemas de PKS de AGPI en Shewanella olleyana y Shewanella japónica, y usos de tales sistemas. Estas solicitudes también dan a conocer la modificación genética de organismos, incluyendo microorganismos y plantas, con los genes que comprenden la ruta de PKS de AGPI y la producción de AGPI por tales organismos. Además, la publicación de patente PCT n.2 WO 5/97982 describe un sistema de PKS de AGPI en Ulkenia, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.2 2514231 describe genes y proteínas PKS de AGPI de Thraustochytrium aureum.

Por consiguiente, se han descrito las estructuras de dominios básicas y las características de secuencia de la familia de enzimas AGPI sintasa, y se ha demostrado que las enzimas AGPI sintasa pueden realizar la síntesis de novo de diversos AGPI (por ejemplo, ácido eicosapentaenoico (EPA; C2:5n-3), ácido docosahexaenoico (DHA; 22:6n-3) y ácido docosapentaenoico (DPAn-6; C22:5n-6). Se ha demostrado que los productos de AGPI pueden acumularse en fosfolípidos (PL) del organismo huésped y, en algunos casos, en los lípidos neutros (por ejemplo, triacilgliceroles (TAG)). Sin embargo, por lo que conocen los presentes inventores, el mecanismo preciso para la transferencia del AGPI de la enzima a esas dianas no se ha definido anteriormente a la presente invención.

Puesto que el mecanismo de transferencia de AGPI a destinos diana en un organismo puede tener implicaciones para aumentar la eficacia de y/o mejorar la producción de AGPI en un organismo que se ha modificado genéticamente para producir tales AGPI, hay una necesidad en la técnica de información referente a este mecanismo. Por consiguiente, también hay una necesidad en la técnica de métodos de producción de AGPI mejorados, incluyendo en plantas y microorganismos que se han modificado genéticamente para producir tales AGPI, que se aprovechen del conocimiento de tal mecanismo.

Sumario de la invención

Una realización de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una acil- CoA sintetasa (ACoAS) que cataliza la conversión de ácidos grasos libres (AGL) de AGPI de cadena larga en acil- CoA, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que es idéntica en al menos el 75% a una ACoAS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que es idéntica en al menos el 85% a una ACoAS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 2, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que es idéntica en al menos el 95% a una ACoAS que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico codifica para una acil-CoA sintetasa (ACoAS) que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de ácido nucleico es SEQ ID NO: 82.

6. Proteína aislada codificada por la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.

8. Célula huésped recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante según la reivindicación 7.

9. Célula huésped recombinante según la reivindicación 8, en la que la célula huésped es un microorganismo o una célula vegetal.

1. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente, en donde el microorganismo o la planta se ha modificado genéticamente para expresar la molécula de ácido nucleico aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

11. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 1, en donde el microorganismo o la planta expresa una AGPI sintasa que produce al menos un ácido graso poliinsaturado (AGPI) y una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa).

12. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 11, en donde el microorganismo o la planta se transforma con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda acil-CoA sintetasa (ACoAS) o un homólogo de la misma de un organismo que expresa de manera endógena una AGPI sintasa.

13. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 11, en donde el microorganismo o la planta se transforma con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda acil-CoA sintetasa (ACoAS) o un homólogo de la misma de Crypthecodinium cohnii, en donde la ACoAS u homólogo de la misma cataliza la conversión de ácidos grasos libres (AGL) de AGPI de cadena larga en acil-CoA.

14. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 11, en donde el microorganismo o la planta se transforma con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda acil-CoA sintetasa (ACoAS) o un homólogo de la misma de un microorganismo de Thraustochytriales, en el que la ACoAS u homólogo de la misma cataliza la conversión de ácidos grasos libres (AGL) de AGPI de cadena larga en acil-CoA.

15. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 11, en donde el microorganismo o la planta se transforma con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una segunda acil-CoA sintetasa (ACoAS) o un homólogo de la misma de Schizochytríum, en donde la ACoAS u homólogo de la misma cataliza la conversión de ácidos grasos libres (AGL) de AGPI de cadena larga en acil-CoA.

16. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 11, en donde el microorganismo o la planta contiene una modificación genética adicional para delecionar o inactivar una ácido graso sintasa (FAS) expresada por el microorganismo o la planta.

17. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde el microorganismo o la planta contiene una modificación genética adicional para reducir la competición por malonil CoA con la AGPI sintasa o para aumentar el nivel de malonil CoA en el organismo.

18. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en donde el microorganismo o la planta contiene una modificación genética adicional para expresar una o más proteínas heterólogas a partir de un organismo que produce de manera endógena AGPI, en donde la proteína utiliza AGPI-CoA como sustratos en la formación de fosfolípidos (PL) o triacilgliceroles (TAG).

19. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 18, en donde la proteína es una DAGAT o una LPAAT.

2. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 18, en donde el microorganismo o la planta se transforma con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de un traustoquitridio o un laberintúlido que utiliza AGPI- CoA como sustratos en la formación de fosfolípidos (PL) o triacilgliceroles (TAG).

21. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según la reivindicación 18, en donde el microorganismo o la planta se transforma con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína de Schizochytrium que utiliza AGPI-CoA como sustratos en la formación de fosfolípidos (PL) o triacilgliceroles (TAG).

22. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en donde la AGPI sintasa comprende al menos un dominio funcional de una AGPI sintasa de un traustoquitridio o un laberintúlido.

23. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en donde la AGPI sintasa comprende al menos un dominio funcional de una AGPI sintasa de un microorganismo de Thraustochytriales.

24. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en donde la AGPI sintasa comprende al menos un dominio funcional de una AGPI sintasa de un organismo seleccionado del grupo que consiste en: Schizochytrium, Thraustochytrium, Uikenia y Labyrinthula.

25. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en donde la AGPI sintasa comprende al menos un dominio funcional de una AGPI sintasa de Schizochytrium.

26. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en donde la AGPI sintasa comprende al menos un dominio funcional de una AGPI sintasa de un organismo seleccionado del grupo que consiste en Schizochytrium sp., n.2 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) 2888, Thraustochytrium 23B, n.2 de la ATCC 2892, y un mutante de cualquiera de dichos microorganismos.

27. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21, en donde la AGPI sintasa comprende al menos un dominio funcional de una AGPI sintasa de una bacteria marina.

28. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 27, en donde el microorganismo o la planta produce al menos un ácido graso poliinsaturado (AGPI) seleccionado del grupo que consiste en: EPA (C2:5, n-3), DHA (C22:6, n-3), DPA (C22:5, n-6 o n-3), ARA (C2:4, n-6), GLA (C18:3, n-6) y/o SDA (C18:4, n-3)).

29. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 27, en donde el microorganismo o la planta produce DHA y DPAn-6 o en donde el microorganismo o la planta produce ARA.

3. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 29, en donde el microorganismo o la planta es un microorganismo.

31. Microorganismo modificado genéticamente o planta modificada genéticamente según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 27, en donde el microorganismo o la planta es una planta o una célula vegetal.

32. Semilla obtenida de la planta según la reivindicación 31.

33. Producto alimenticio que contiene la semilla según la reivindicación 32.

34. Procedimiento para transformar un organismo para que exprese AGPI, que comprende transformar un organismo con moléculas de ácido nucleico que codifican para una AGPI sintasa, con una molécula de ácido

nucleico que codifica para una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) y con al menos una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

35. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que el organismo contiene una modificación genética para delecionar o inactivar una ácido graso sintasa (FAS) expresada por el organismo.

36. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que el organismo contiene una modificación genética para reducir la competición por malonil CoA con la AGPI sintasa o para aumentar el nivel de malonil CoA en el organismo.

37. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que el organismo es una planta.

38. Procedimiento según la reivindicación 34, en el que el organismo es un microorganismo.

39. Método para producir un aceite que comprende al menos una AGPI, que comprende recuperar un aceite de un organismo modificado genéticamente para que exprese una molécula de ácido nucleico que codifica para una AGPI

sintasa, una molécula de ácido nucleico que codifica para una fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) y al menos una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.