Proceso para la producción en continuo de lovastatina. La presente invención consiste en la producción de lovastatina,

a partir de cultivos de Aspergillus terreus en forma de pellets, mediante un proceso de fermentación en continuo en un biorreactor de tipo columna de burbujeo operando de forma análoga a un biorreactor de lecho fluidizado (BLF) con un cultivo en tres fases, gas, líquido y sólido.

La producción de lovastatina está regulada mediante un mecanismo de inhibición por producto, dando lugar al cese de la síntesis cuando la concentración alcanza un determinado valor.

El proceso permite la obtención en continuo de un caldo de fermentación libre de biomasa conteniendo éste la lovastatina, lo cual facilita las posteriores etapas de extracción y purificación. La operación en continuo da lugar a que parte de la lovastatina generada abandone el biorreactor de lecho fluidizado, disminuyendo de esta forma los efectos de la inhibición por producto

Proceso para la producción en continuo de lovastatina.

Sector de la técnica

La presente invención se encuadra en el sector farmacéutico y químico, más concretamente en el relativo a la producción de lovastatina mediante fermentaciones del microhongo filamentoso Aspergillus terreus.

Estado de la técnica

En el año 1978 en los laboratorios de investigación de Merck, Alberts y sus colaboradores descubrieron un potente inhibidor de la hidroximetilglutaril coenzima A reductasa obtenido a partir de fermentaciones del microhongo filamentoso Aspergillus terreus (Alberts y cols., 1980). Lo llamaron mevinolina, posteriormente, la USAN (United States Adopted Names) estableció el nombre oficial como lovastatina. La lovastatina es generada a través de la ruta de síntesis de los policétidos, su fórmula molecular es C₂₄H₃₆O₅ y su estructura se presenta en la figura 1. Fue la primera estatina desarrollada para uso clínico y fue aprobada por la US FDA (United States Food and Drug Administration) para el tratamiento de la hipercolesterolemia el 31 de Agosto de 1987 (Tobert, 2003).

La lovastatina es un fármaco perteneciente a la familia de las estatinas que inhibe la HMG-CoA reductasa, enzima implicada en la síntesis del colesterol, es por ello que la lovastatina está prescrita en el tratamiento de la hipercolesterolemia para la disminución de los niveles de colesterol en sangre (Alberts y otros., Am. J. Cardiol., 62: 10J-15J, 1988).

La lovastatina es un metabolito secundario cuya producción industrial se lleva a cabo mediante fermentaciones de microhongos filamentosos tales como Aspergillus terreus (US 4231938) o Monascus ruber (US 4323648) realizadas en reactores de tanque agitado operando en modo discontinuo.

Endo y otros, (J. Antibiot. 29: 1346-1348, 1976 y FEBS 72: 323-326, 1976) describen un proceso de producción y purificación de mevastatina a partir de Penicillin citrinum (NRRL 8082). Después de esto, la lovastatina fue obtenida a partir de cultivos de Monascus ruber (Negishi y otros, Hakko Kogaku Kaishi, 64: 509-512, 1986) y, en 1989, un proceso industrial para su producción fue establecido usando Aspergillus terreus (ATCC 20542) que produjo aproximadamente 180 mg de lovastatina/l, siendo el glicerol la fuente de carbono en un cultivo alimentado en lotes (Buckland y otros, en: "Novel microbial product for Medicine and Agriculture" por A. L. Demain y otros., 161-169, Elsevier, 1989).

La patente GB 2046737 presenta un proceso de producción en discontinuo a partir de fermentaciones de cepas del género Monascus, mas concretamente Monascus ruber 1005, cultivado entre 7 y 40°C, en un medio de cultivo consistente en una disolución acuosa de glucosa, peptona, licor de maíz y cloruro amónico. La fermentación fue llevada a cabo durante 10 días en condiciones aeróbicas, obteniéndose finalmente 87 mg. de lovastatina de cinco litros de caldo cultivo.

La patente alemana 4402591 describe la síntesis de lovastatina por microorganismos del género Pleurotuss, como por ejemplo, P. ostreatus, P. sapidus y P. saca, en fermentaciones llevadas a cabo a una temperatura comprendida entre 25 y 35°C durante 7 y 14 días.

La patente US 4294926 describe la síntesis de lovastatina preferiblemente a partir de fermentaciones del microhongos filamentoso Aspergillus terreus ATCC 20541 y ATCC 20542 a una temperatura entre 20 y 37°C en un medio de cultivo líquido que contiene fuentes de carbono tales como carbohidratos (glucosa, fructosa, maltosa), fuentes de nitrógeno tales como hidrolizados de levadura, hidrolizados de caseina o licor de maíz y sales minerales como por ejemplo, carbonato cálcico, sulfato de magnesio, cobalto, hierro y sales de manganeso. Procedimientos similares han sido descritos en US 4420491, 4342767, 4319039 y 4294846 en las que las fermentaciones fueron llevadas a cabo durante 3 y 5 días en medios de cultivo que contenían entre 1 y 6% de carbohidratos y entre 0,2 y 6% de fuentes de nitrógeno.

La patente canadiense de número 2129416 presenta la preparación de lovastatina y mevastatina con un microorganismo del género Coniothyrium, más concretamente Coniothyrium fuckelii ATCC 74227 cultivado en un medio que contiene entre el 3 y el 15% de glucosa, entre el 0,5 y el 4% de peptona, entre el 0,5 y el 5% de amilasa, entre el 0,2 y el 1% de sulfato amónico, entre el 0,01 y el 0,1% de sulfato magnésico, entre el 0,05 y el 0,2% de antiespumante, entre el 0,2 y el 1,5% de L-isoleucina y entre el 0,2 y el 1,5% de L-ácido aspartico, en un rango de pH entre 5 y 6. De acuerdo con los ejemplos, la concentración del principio activo en el caldo de cultivo estuvo entre 19 y 430 mg/L.

La patente húngara de número HU 208997 presenta una aplicación de la cepa Aspergillus obscurus depositada bajo el número NCAIM(P)F 001189. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en un medio de cultivo que contiene extracto de levadura y/o peptona y/o caseína como fuente de nitrógeno y glucosa y/o maltosa o sacarosa como fuente de carbono. Al final del cultivo a escala de laboratorio, el caldo de cultivo contuvo entre 400-850 mg/L.

Las patentes americanas de números 6197560 y 6500651 proponen un sistema de producción consistente en el cultivo en modo fed-batch de un acepa del hongo filamentoso Aspergillus obscurus en un reactor de tipo tanque agitado que se alimenta de forma discontinua con diferentes disoluciones de nutrientes con el fin de alcanzar un estado estacionario de crecimiento, llevando a cabo el cosechado del cultivo también de forma discontinua.

La patente de número WO9837220-A1 propone un sistema de producción consistente en el cultivo de microorganismos para la producción de lovastatina en un reactor que se alimenta de forma continua o intermitente con un medio de cultivo que contiene únicamente una fuente de nitrógeno asimilable para controlar el crecimiento del microorganismo.

Tal y como se puede comprobar en las referencias citadas, la mayor parte del trabajo desarrollado acerca de la síntesis de lovastatina ha estado enfocado a la obtención de nuevos microorganismos sobre-productores de lovastatina y a la mejora de los procesos de extracción y purificación, en detrimento del desarrollo de métodos de cultivo que aumenten la productividad y reduzcan los costes de operación. Los métodos de cultivos empleados en las referencias citadas se centran en el uso de reactores de tipo tanque agitado operando en modo discontinuo, en modo fed-batch y en modo continuo pero alimentando el reactor con medio que contiene únicamente fuente de nitrógeno asimilable.

La síntesis de lovastatina mediante cultivos de Aspergillus terreus está regulada mediante un mecanismo enzimático de inhibición por producto, que produce el cese de la síntesis de lovastatina en los cultivos que se realizan de forma discontinua cuando la concentración de lovastatina alcanza un determinado valor (Casas López y cols. 2004. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(1):48 -50)

La presente invención consiste en la producción de lovastatina, a partir de cultivos de Aspergillus terreus creciendo este en forma de pellets, mediante un proceso de fermentación en continuo en un biorreactor de tipo columna de burbujeo operando de forma análoga a un biorreactor de lecho fluidizado (BLF) con un cultivo en tres fases, gas, líquido y sólido, según la clasificación E-III-a de L. S. Fan (1989) (L. S. Fan, 1989. Gas-Liquid-Solid Fluidization Engineering. Butterworths Series in Chemical Engineering).

Trabajos previos al estudio objeto de patente han sido publicados demostrando la viabilidad del uso del reactor de tipo lecho fluidizado para la producción de lovastatina a partir de cultivos de Aspergillus terreus. Una aplicación para producción en semi-continuo de lovastatina ha sido publicada (Rodríguez Porcel y colaboradores, Journal of Chemical Technology and Biotechology 82: 58-64 (2007)) aunque con importantes diferencias con el proceso objeto de patente. En dicha publicación los autores abogan por un proceso en tres fases, una primera fase en discontinuo, una segunda fase en modo fed-batch y una tercera fase en semicontinuo. En la presente patente se opta por una fase de crecimiento en discontinuo y una segunda fase de producción en continuo facilitando la operación del proceso completo. Como medio de dilución optan por utilizar un medio de cultivo con fuente de...

1. Proceso de producción en continuo de lovastatina a partir del cultivo del microorganismo Aspergillus terreus en un biorreactor de lecho fluidizado mediante un proceso en al menos dos etapas, una primera etapa en modo discontinuo, fase de crecimiento y una segunda etapa en modo continuo, fase de producción.

2. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en la reivindicación 1 en el que se controle la concentración de oxígeno disuelto mediante aplicación de un ciclo cerrado para el gas e inyección directa de oxígeno cuando el nivel del mismo se encuentre por debajo del fijado, que estará entre el 300% y el 450% respecto de la saturación con aire.

3. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1 y 2 en el que el control de oxígeno disuelto se realice durante los 7 primeros días de cultivo y en adelante, preferiblemente se utilizará control de oxígeno disuelto durante todo el cultivo.

4. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1, 2 y 3 que se realiza a una temperatura comprendida entre 26 y 30°C.

5. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1-4 en el que la primera etapa tenga una duración comprendida entre 2 y 5 días.

6. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1-5 en el que el medio de cultivo para la primera etapa contenga: fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales minerales y biotina.

7. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1-6 en el que la segunda etapa se realice en modo continuo respecto de la fase líquida, caldo de cultivo; en modo discontinuo respecto de la fase sólida, biomasa; a una velocidad de dilución comprendida entre 0,13 y 0,52 d^-1.

8. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1-7 en el que la retirada del caldo de cultivo se realiza por gravedad a través de un rebosadero situado en la parte superior del reactor y provisto de una malla que permita la salida del caldo de cultivo que contiene la lovastatina y evite la salida de biomasa.

9. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1-8 en el que el medio de dilución empleado contenga sales minerales, tales como: KH₂PO₄, NaCl, MgSO₄, ZnSO₄ y Fe(NO₃)₃.

10. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1-9 en el que el medio de dilución empleado contenga elementos traza, tales como: Na₂B₄O₇, MnCl₂, Na₂MoO₄, y CuSO₄.

11. Proceso de producción en continuo de lovastatina definido en las reivindicaciones 1-10 en el que el medio de dilución empleado contenga biotina.