Proceso para producir linfocitos citotóxicos.

Un método para preparar un linfocito citotóxico o una preparación de linfocitos citotóxicos en donde dicho método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de inducción,

mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13.

Proceso para producir linfocitos citotóxicos

Campo técnico La invención se refiere a un método para preparar un linfocito citotóxico, que es útil en el campo médico.

Antecedentes técnicos Un cuerpo vivo está protegido de sustancias exógenas principalmente mediante una respuesta inmune, y se ha establecido un sistema inmunitario por varias células y los factores solubles producidos por las mismas. Entre ellas, los leucocitos, en especial los linfocitos, desempeñan un papel clave. Los linfocitos se clasifican en dos tipos principales, linfocito B (al que se puede denominar de aquí en adelante como célula B) y linfocito T (al que se puede denominar de aquí en adelante como célula T) , ambos reconocen de forma específica un antígeno y actúan sobre el antígeno para proteger el cuerpo vivo.

Las células T se subclasifican en células T cooperadoras que tienen el marcador CD (grupo de diferenciación) 4 (de aquí en adelante denominadas TH) , principalmente implicadas en asistir en la producción de anticuerpos e inducción de varias respuestas inmunitarias, y células T citotóxicas que tienen el marcador CD8 (TC: linfocito T citotóxico, también denominada célula T citolítica y que se puede denominar de aquí en adelante como LTC) , que muestran principalmente una actividad citotóxica. El LTC, que desempeña el papel más importante en reconocer, destruir y eliminar células tumorales, células infectadas por virus o similares, no produce un anticuerpo que reaccione específicamente con un antígeno, como en la célula B, pero directamente reconoce y actúa sobre antígenos (péptidos antigénicos) de una célula diana que se asocia con las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad [MHC, que también se puede denominar como antígeno leucocitario humano (HLA) en seres humanos] de clase I que existen en la superficie de la membrana de la célula diana. En este punto, el receptor de la célula T (de aquí en adelante denominado TCR) que existe en la superficie de la membrana de los LTC específicamente reconoce los péptidos antigénicos y las moléculas de MHC de clase I anteriormente mencionados, y determina si el péptido antigénico deriva de sí mismo o es extraño. La célula diana que se ha determinado que es extraña específicamente se destruye y elimina después por los LTC.

En los últimos años, se ha reconsiderado una terapia que causaría una carga física más pesada en un paciente, tal como farmacoterapia o radioterapia, y ha aumentado el interés en una inmunoterapia con una carga física más ligera en un paciente. En especial, se ha remarcado la eficacia de la inmunoterapia adoptiva en la se inducen in vitro LTC capaces de reaccionar específicamente con un antígeno de interés a partir de linfocitos derivados de un ser humano que tiene una función inmunitaria normal, o se expande el linfocito sin inducción, y después se transfiere a un paciente. Por ejemplo, se ha sugerido que la inmunoterapia adoptiva en un modelo animal es una terapia eficaz para infección por virus y tumores [escrito por Greenberg, P. D., Advances in Immunology, publicado en 1992; Reusser P., et al., Blood, 78 (5) , 1373-1380 (1991) ]. En esta terapia, es importante mantener o aumentar el número de células en un estado en el que se mantenga o aumente la actividad citotóxica específica de antígeno del LTC.

En la inmunoterapia adoptiva como se describe anteriormente, es necesario administrar linfocitos citotóxicos en el número de células de una cantidad determinada o mayor para obtener un efecto terapéutico. En otras palabras, se puede decir que es un problema principal obtener el número anterior de células in vitro en un corto periodo de tiempo.

Para mantener y aumentar una actividad citotóxica específica de antígeno del LTC, en general se ha empleado un método de estimulación repetida con un antígeno de interés cuando se induce una respuesta específica a un antígeno para LTC. Sin embargo, en este método el número de LTC finalmente obtenido normalmente puede disminuir, de modo que no se puede obtener un número suficiente de células.

Como método para preparar una célula T que sea eficaz para el tratamiento de una enfermedad, se conoce, por ejemplo, inmunoterapia adoptiva que usa linfocitos infiltrantes en tumor (TIL) inducidos con IL-2 a una concentración alta [N. Engl. J. Med., 316, 1310-1321 (1986) ; Rosenberg S. A. et al, N. Engl. J. Med., 319 (25) , 1676-1680 (1988) ; Ho M. et al., Blood, 81 (8) , 2093-2101 (1993) ].

A continuación, respecto a la preparación del LTC específico de antígeno, se ha descrito un método para aislar y expandir un clon de LTC específico de CMV usando fibroblastos infectados con auto-CMV e IL-2 [Riddell S. A. et al.,

J. Immunol., 146 (8) , 2795-2804 (1991) ] o usando un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Acm anti-CD3) e IL-2 [Riddell

S. A. et al., J. Immunol. Methods, 128 (2) , 189-201 (1990) ].

Además, el documento WO 96/06929 divulga un método REM (método de expansión rápida) . Este método REM es un método para expandir una población primaria de células T que contiene LTC específicos de antígeno y TH en un periodo de tiempo corto. En otras palabras, este método se caracteriza en que se puede suministrar una gran cantidad de células T mediante la proliferación de clones individuales de células T y en que el número de LTC específicos de antígeno aumenta usando un anticuerpo anti-CD3, IL-2 y PBMC (células mononucleares de sangre periférica) hechas deficientes en la capacidad de proliferación mediante irradiación, y células infectadas con virus de Epstein-Barr (de aquí en adelante simplemente denominadas células infectadas con EBV) .

Además, el documento WO 97/32970 divulga un método REM modificado, en donde el método es un método que usa como célula alimentadora una cepa de células de mamífero indiferenciadas que expresa un componente que estimula células T que es distinguible de las PBMC para reducir la cantidad de PMBC usadas.

La célula citolítica activada por linfoquinas (célula LAK) es una población de células funcionales que tiene actividad citotóxica, que se obtiene añadiendo IL-2 a sangre periférica (leucocitos de sangre periférica) , sangre de cordón umbilical, líquido tisular o similares que contiene linfocitos, y cultivando las células in vitro durante varios días. Durante el cultivo, la proliferación de la célula LAK se acelera además añadiendo un anticuerpo anti-CD3 a la misma y cultivando la célula. La célula LAK obtenida de esta manera tiene una actividad citotóxica no específica hacia varias células cancerosas y otras dianas. La célula LAK también se usa en la inmunoterapia adoptiva de la misma manera que el LTC mencionado anteriormente.

Como se ha descrito anteriormente, la utilización de IL-2 es esencial en el paso de obtener un linfocito citotóxico, por ejemplo, LTC, célula LAK, TIL o similar. La célula se activa adicionalmente por la unión de IL-2 al receptor de interleuquina-2 (IL-2R) en la superficie de una célula. Además, se conoce IL-2R como un marcador de activación para un linfocito. Desde estos puntos de vista, es importante mejorar la expresión de IL-2R en la superficie celular. Además, en la inducción del LTC, es importante mejorar una eficacia para inducir una célula precursora de LTC sometida a estimulación por un antígeno como LTC, es decir, mejorar una proporción (relación) de la célula CD8 positiva en un grupo de células después de la inducción.

La fibronectina es una glicoproteína gigantesca que tiene un peso molecular de 250 mil, que existe en la sangre animal, en la superficie de una célula cultivada o en la matriz extracelular de un tejido, y se sabe que tiene varias funciones. Una estructura de dominios de la misma se divide en siete partes (de aquí en adelante referido a la figura 1) , en donde tres tipos de secuencias similares están contenidas en una secuencia de aminoácidos de la misma, las repeticiones de cada una de estas secuencias constituyen la secuencia entera. Los tres tipos de secuencias similares se denominan tipo I, tipo II y tipo III. Entre ellas, el tipo III está constituida por de 71 a 96 residuos de aminoácidos, en donde la relación de coincidencia de estos residuos de aminoácidos es del 17 al 40%. En la fibronectina, hay catorce secuencias de tipo III, entre las cuales la secuencia 8ª, 9ª o 10ª (cada una se denomina de aquí en adelante III-8, III-9 o III-10) está contenida en un dominio de unión a células, y la secuencia 12ª, 13ª o 14ª (cada una se denomina de aquí en adelante III-12, III-13 o III-14) está contenida en un dominio de unión a heparina. Además, una región a unión a VLA (antígeno de activación muy tardía) -5 está contenida en III-10 y su secuencia... [Seguir leyendo]

1. Un método para preparar un linfocito citotóxico o una preparación de linfocitos citotóxicos en donde dicho método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13.

2. El método según la reivindicación 1, en donde el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13 está inmovilizado en una fase sólida.

3. El método según la reivindicación 2, en donde la fase sólida es un equipo de cultivo celular o un soporte de cultivo celular.

4. El método según la reivindicación 3, en donde el equipo de cultivo celular es una placa de petri, una botella

o una bolsa y el soporte de cultivo celular es bolas, una membrana o un portaobjetos de vidrio.

5. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico se lleva a cabo en un medio que contiene el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13.

6. El método según la reivindicación 1 que comprende llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia del polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13 en un equipo de cultivo celular que contiene un medio, en donde el método satisface cualquiera de las condiciones de:

(a) una relación del número de células al inicio del cultivo respecto a un área de cultivo en el equipo de cultivo celular que es de 1 célula/cm2 a 5 x 105 células/cm2; y

(b) una concentración de células en un medio al inicio del cultivo que es de 1 célula/ml a 5 x 105 células/ml.

7. El método según la reivindicación 6, en donde el método excluye un paso de dilución o un paso de intercambio del equipo de cultivo celular.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además el paso de transducir un gen exógeno en un linfocito citotóxico.

9. El método según la reivindicación 8, en donde el gen exógeno se transduce usando retrovirus, adenovirus, virus adenoasociado o virus simio.

10. Un método in vitro para aumentar la expresión del receptor de interlequina-2 de una célula, para mejorar una relación de células CD8 positivas en una población de linfocitos citotóxicos o para mejorar o mantener la actividad citotóxica en un linfocito citotóxico caracterizado en que el método comprende el paso de llevar a cabo al menos uno de inducción, mantenimiento y expansión de un linfocito citotóxico en presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13.