Proceso para la producción de vainillina.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO MICROBIOLOGICO PARA LA PRODUCCION DE VAINILLINA,

QUE COMPRENDE EL CULTIVO EN UN CALDO NUTRITIVO DE UNA BACTERIA QUE PERTENECE AL ORDEN ACTINOMYCETALES, PREFERENTEMENTE A LA FAMILIA STREPTOMYCETACEAE, LA ADICION DEL SUSTRATO ACIDO FERULICO, EN EL QUE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO EN EL CALDO NUTRITIVO ES ENTRE APROXIMADAMENTE 5 GL -1 Y APROXIMADAMENTE 40 GL -1 EN EL CALDO DE FERMENTACION, PRODUCIENDO VAINILLINA COMO PRODUCTO DE REACCION PRINCIPAL DE LA BIOTRANSFORMACION DEL ACIDO FERULICO Y SEPARANDO LA BIOMASA DEL CALDO DE FERMENTACION Y EXTRAYENDO LA VAINILLINA Y, SI ASI SE DESEA, EL SUBPRODUCTO GUAYACOL DEL CALDO DE FERMENTACION.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E98110765.

Solicitante: GIVAUDAN SA.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: CHEMIN DE LA PARFUMERIE 5 1214 VERNIER-GENÉVE SUIZA.

Inventor/es: MUHEIM, ANDREAS, MULLER, BRUNO, MUNCH, THOMAS, WETLI, MARKUS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A23L1/23
  • C11B9/00 QUIMICA; METALURGIA.C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS.C11B PRODUCCION, ej. POR PRENSADO DE MATERIAS PRIMAS O POR EXTRACCION DE MATERIAS RESIDUALES, REFINO O CONSERVACION DE GRASAS, SUSTANCIAS GRASAS, p. ej. LANOLINA, ACEITES GRASOS O CERAS; ACEITES ESENCIALES; PERFUMES (aceites secantes C09F). › Aceites esenciales; Perfumes.
  • C12P7/22 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › aromáticos.
  • C12P7/24 C12P 7/00 […] › que contienen un grupo carbonilo.
  • C12R1/01 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Bacterias o actinomicetos.
  • C12R1/465 C12R 1/00 […] › Streptomyces.

PDF original: ES-2258290_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Proceso para la producción de vainillina.

La presente invención se refiere a un proceso microbiológico para la producción de vainillina a partir de ácido ferúlico. Según este proceso, un cultivo, preferiblemente un cultivo sumergido, de cualquier bacteria del orden de los Actinomycetales, preferiblemente de la familia Streptomycetaceae, se incuba con el ácido ferúlico sustrato para producir de manera fermentativa vainillina. La vainillina producto se recupera del caldo de fermentación mediante un método de extracción diseñado que permite también la separación y recuperación de subproductos de fermentación de valor, para obtener la vainillina producto analítica y sensorialmente purificada y, en particular el subproducto guayacol.

En la utilización de compuestos aromatizantes, es cada vez más importante que los compuestos aromatizantes se puedan designar como naturales. En línea con las regulaciones de Europa y EE.UU., esto significa que el compuesto se debe obtener mediante procesos físicos, enzimáticos o microbiológicos y únicamente a partir de materiales de origen vegetal o animal. De este modo, durante la última década varias actividades de investigación se han centrado en la utilización de fuentes de materias primas renovables, baratas y naturales para la producción fermentativa de vainillina. Sin embargo, hasta el momento en las publicaciones y patentes muy raramente se describen rendimientos volumétricos comercialmente atractivos.

El guayacol es una molécula fenólica de tipo empireumática que contribuye de forma significativa al aroma característico de los extractos de vainilla. De este modo, habitualmente se utiliza en combinación con vainillina para aromas de tipo vainillina. Sin embargo, hasta el momento no se ha descrito la producción fermentativa de guayacol natural.

En los últimos diez años se han presentado varias solicitudes de patente en referencia a la producción microbiana o enzimática de vainillina. En general, un precursor adecuado se transforma en vainillina mediante un microorganismo o una enzima. Algunos precursores sugeridos son eugenol, isoeugenol, ácido ferúlico, curcumina y resinas de benjuí siam. Habitualmente, los rendimientos de transformación son extremadamente bajos. Algunos ejemplos son, por ejemplo, Haarman y Reimer (EP 0 405 197 A1) que reivindica una producción de 18 mgl-1 partiendo de 0,2 gl-1 de eugenol utilizando los microorganismos Serratia, Klebsiella o Enterobacter. Además, esta transformación dura 13 días. Pernod-Ricard (EP 453 368 A) reivindica 46 mgl-1 de vainillina obtenida a partir de ácido ferúlico por fermentación con Pycnoporus durante 6 días. En esta línea también, Kraft General Foods (Estados Unidos 5.128.253), que reivindica 210 mgl-1 de vainillina a partir de ácido ferúlico en 54 días. Para obtener este título se tuvo que añadir un agente reductor, ya que de otro modo no tendría lugar la formación de vainillina y únicamente se formaría ácido vainíllico. La solicitud de patente internacional WO 960 857 A describe un proceso para la obtención de ácido vainíllico mediante la bioconversión de ácido ferúlico. Takasago (JP 227980/1993) preparó mutantes de cepas de Pseudomonas que se bloquean en la ruta de degradación de la vainillina. De este modo, a partir de 1 gl-1 de ácido ferúlico se pudieron obtener 0,28 gl-1 de vainillina. Recientemente, Haarman y Reimer (EP 0 761 817 A2) han publicado hasta el momento la única solicitud que describe rendimientos volumétricos de vainillina económicamente atractivos en un proceso de fermentación. Los autores identificaron dos cepas del género Amycolatopsis que son capaces de acumular vainillina hasta una concentración de 11,5 gl-1 en el caldo de fermentación tras la adición de ácido ferúlico.

En conclusión, se puede afirmar que en los sistemas microbianos no se forman fácilmente cantidades elevadas de vainillina. Esto se debe principalmente a la toxicidad celular de la vainillina, que a concentraciones por encima de 1 gl-1 evita el crecimiento de los microorganismos productores de vainillina. Habitualmente, en los sistemas microbianos, se observa el correspondiente alcohol o ácido y no la vainillina. Este efecto tóxico de la vainillina se superó mediante la utilización de enzimas (Quest, EP 0 542 348 A2). El tratamiento de isoeugenol con lipoxigenasa dio lugar a 10-15 gl-1 de vainillina con un rendimiento del 10-15%. Se obtuvieron concentraciones mucho más bajas cuando se utilizó eugenol (0,3-0,5 gl-1 con un rendimiento del 0,3-0,5%) y no se describe ningún cambio para el ácido ferúlico. Desde el punto de vista económico, el método que emplea lipoxigenasa es poco atractivo.

Otra medida para evitar la toxicidad de este compuesto es la producción microbiana de coniferialdehído, que forma vainillina tras un tratamiento térmico, véase BASF (Offenlegungsschrift, DE 3604874 A1). Similar es también el sistema celular inmovilizado tal como se describe en la reciente solicitud de patente de Orsan (WO 96/34971), en la que la vainillina se acumula hasta una concentración de 1 gl-1. Un posible beneficio económico de la utilización de biomasa inmovilizada se proporciona mediante el reciclado del biocatalizador.

Muchos artículos se refieren a las rutas metabólicas respectivas a partir de eugenol, isoeugenol o ácido ferúlico: en general, se cree que la vainillina es un compuesto intermedio en la ruta de degradación de estos compuestos. Se pueden citar dos publicaciones que muestran la participación de la vainillina en la degradación del ácido ferúlico. Toms y Wood, Biochemistry 9 (1970) 337-43, cultivaron Pseudomonas sp. sobre ácido ferúlico y elucidaron la ruta de degradación. A pesar de que no se observó vainillina en el sobrenadante del cultivo, se evidenció que la vainillina es un compuesto intermedio, ya que se pudo detectar ácido vainíllico. A partir del ácido ferúlico, se obtuvo vainillina en cultivos de Streptomyces setonii (Sutherland y otros, Can. J. Microbiol. 29 (1983) 1253-57). No se indicó la cantidad, excepto que sólo se observaron trazas cuando se repitió el experimento.

El ácido ferúlico como sustrato para biotransformaciones está disponible de forma abundante a partir de diferentes fuentes naturales. El ácido está presente normalmente en forma de glucósido en materiales vegetales, tales como madera, melaza de remolacha azucarera, salvado de maíz, arroz y varios tipos de gramíneas. Se puede aislar de los correspondientes glicósidos en estos productos mediante métodos de hidrólisis conocidos, por ejemplo, utilizando enzimas, y se puede utilizar como material crudo o material purificado. Una fuente británica (GB 2301103 A1) describe, por ejemplo, la ruptura enzimática del ácido ferúlico que contiene un material vegetal mediante una esterasa de ácido ferúlico, para obtener el ácido libre.

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

El presente proceso nuevo y microbiológicamente de alto rendimiento para la producción de vainillina comprende, en primer lugar, el cultivo en un caldo de nutrientes de un microorganismo del género Streptomyces (orden de los Actinomycetales, familia Streptomycetaceae), preferiblemente la bacteria Streptomyces setonii, en el que, preferiblemente, el periodo de cultivo es de, aproximadamente, 5-40 horas y dura, hasta que la fuente de carbono de glucosa (casi) se consume, añadiendo seguidamente el ácido ferúlico sustrato en el intervalo de, aproximadamente, 5-40 gl-1 de caldo de fermentación, de manera continua o discontinua. Tras un periodo de incubación (biotransformación) aproximado de, aproximadamente, 5-50 horas, se completa la conversión del sustrato en vainillina y varios subproductos. El ácido ferúlico se consume y la vainillina se acumula hasta, aproximadamente, 8-16 gl-1 en el caldo de fermentación. Algunos subproductos habituales de la biotransformación del ácido ferúlico son alcohol vainíllico, ácido vainíllico, guayacol, para-vinilguayacol y 2-metoxi-4-etil-fenol.

La posterior recuperación del producto consiste en la eliminación de la biomasa, seguida convenientemente de una extracción en dos etapas con un disolvente orgánico apropiado, preferiblemente metil-tert-butiléter. Se lleva a cabo una primera extracción a un pH superior a, aproximadamente 9, preferiblemente a un pH de 10 a, aproximadamente, 11 en la fase acuosa para extraer de forma selectiva los subproductos,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proceso para la fabricación de vainillina, que comprende:

a) cultivar en un medio apropiado una bacteria que pertenece al género Streptomyces para formar un caldo de fermentación;
b) añadir el sustrato de ácido ferúlico al caldo de fermentación para obtener una concentración de ácido ferúlico desde, aproximadamente, 5 gl-1 hasta, aproximadamente, 40 gl-1, produciendo vainillina como producto principal de la reacción de la biotransformación de ácido ferúlico, separando la biomasa del caldo de fermentación, y
c) extraer la vainillina, y si se desea, el subproducto guayacol del caldo de fermentación.

2. Proceso, según la reivindicación 1, en el que el cultivo en la etapa a) se realiza en un medio apropiado durante 5 a 40 horas para formar un caldo de fermentación; y posteriormente, el pH de dicho caldo de fermentación se varía hasta, aproximadamente, 8,5; y la biotransformación en b) dura de 5 a 50 horas.

3. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que en la etapa b) se forma un caldo de fermentación que tiene una concentración de ácido ferúlico de 15 a 30 gl-1.

4. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que en la etapa b) se forma un caldo de fermentación que tiene una concentración de ácido ferúlico de 20 a 25 gl-1.

5. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el ácido ferúlico se añade después de la finalización de la fase de crecimiento.

6. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el medio de cultivo comprende glucosa, preferiblemente a una concentración de 5-50 gl-1, más preferiblemente 20-35 gl-1.

7. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el medio de cultivo comprende extracto de levadura, preferiblemente a una concentración de hasta 20 gl-1, más preferiblemente de 5 a 10 gl-1.

8. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el medio de cultivo comprende iones magnesio, preferiblemente a una concentración de 0,1 a 5 gl-1, más preferiblemente de 0,5 a 1 gl-1.

9. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la etapa a) se lleva a cabo a un pH de 7 a 9.

10. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el proceso se lleva a cabo de 30 a 45ºC.

11. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el proceso se lleva a cabo con aireación.

12. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el proceso comprende agitación.

13. Proceso, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la biotransformación dura de 10 a 30 horas, más preferiblemente 15-25 horas.

14. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa c) el guayacol se extrae en primer lugar mediante el incremento del pH del caldo de fermentación hasta por encima de 9 y mediante la utilización de un disolvente orgánico.

15. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que después de la biotransformación el pH del caldo de fermentación se varía posteriormente hasta un valor de, aproximadamente, 7, y la vainillina se extrae mediante un disolvente orgánico.

16. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el metil-tert-butiléter es el disolvente de extracción.

17. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, la bacteria pertenece a Streptomyces setonii.

18. Proceso, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la bacteria es Streptomyces setonii ATCC 39116.



 

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