Procesamiento enzimático de anticuerpos.

Método para producir una inmunoglobulina o polipéptido que comprende por lo menos el dominio CH2 y el dominio CH3 de una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa con una glucoestructura definida, que comprende las etapas siguientes:

- proporcionar un eluido de columna de cromatografía de afinidad que contiene la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina,

- incubar el eluido de columna de cromatografía de afinidad con una α-galactosidasas de origen vegetal que escinde los residuos terminales de galactosa unidos mediante enlace

(α1,3)-glucosídico en el extremo no reductor de la glucoestructura en el dominio CH2 de la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina,

- aplicar el eluido de columna de cromatografía de afinidad incubado a un material de cromatografía con proteína A y recuperar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina a partir del material de cromatografía con proteína A y producir de esta manera una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina con glucoestructura definida.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/004622.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: REUSCH,DIETMAR, HABERGER,MARKUS, JUNG,CHRISTINE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/06 (del suero)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/40 (actúan sobre los enlaces alfa-galactosa-glicósido, p. ej. alfa-galactosidasa)

PDF original: ES-2538819_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procesamiento enzimático de anticuerpos

La presente invención se refiere a un método para el procesamiento enzimático posterior de ¡nmunoglobulinas producidos recombinantemente. En mayor detalle, la presente invención se refiere a un método para la modificación del contenido de galactosa unido mediante enlace (a1,3)glucosídico de las ¡nmunoglobulinas de longitud completa o partes Fe de inmunoglobulina tras una cromatografía de afinidad mediante un tratamiento enzimático.

Antecedentes de la invención

Los polipéptidos obtenidos de células eucarióticas se producen en forma de polipéptidos glucosilados. Las glucoestructuras se unen al esqueleto de aminoácidos en forma de modificación enzimática post-traduccional.

Las glucosiltransferasas se reconocen como una familia funcional de aproximadamente 25 a 3 enzimas intracelulares unidos a membrana diferentes que participan en la biosíntesis coordinada de las glucoestructuras de los polipéptidos, entre ellos glucoproteínas, proteoglicanos y glucolípidos. Las glucosiltransferasas se clasifican en grupos basándose en su especificidad de donación de monosacáridos de nucleótido. Por ejemplo, las galactosiltransferasas son el subgrupo de glucosiltransferasas que utilizan UDP-galactosa como el donante de monosacáridos activado, mientras que las sialiltransferasas utilizan CMP-ácido siálico y las fucosiltransferasas utilizan GDP-fucosa (Shaper N.L. et al., J. Mamm. Gland Biol. Neopl. 3:315-324, 1998).

La modificación de alfa-galactosil-epítopos en diversas células de mamífero resulta de particular interés, ya que hasta el 1% de los anticuerpos igG circulantes en el ser humano interactúa con dicho residuo oligosacárido. Este anticuerpo natural, denominado "anti-Gal", se ha encontrado anteriormente que se une a Gal(a1,3)Gal((31,4)GlcNAc- R terminal en glucolípidos bioquímicamente definidos (Galili U. et al., J. Exp. Med. 162:573-582, 1985; Galili U. et al., J. Exp. Med. 165:693-74, 1987). La medición de la unión de la lectina IB4 de Bandeiraea (Griffonia) simplicifolia marcada radioactivamente a las diversas células nucleadas sugiere que las células que se unen a anti-Gal expresan entre 1® y 3,5x17 epítopos alfa-galactosilo, la mayoría de los cuales, basándose en la especificidad anti-Gal, aparentemente presentan la estructura Gal(a1,3)Gal((31,4)GlcNAc-R. La ausencia de estos epítopos de las células humanas resulta de la actividad reducida del enzima (a1,3)galactosiltransferasa (Galili U. et al., J. Biol. Chem. 263:17755-17762, 1988).

La síntesis del epítopo Gal(a1,3) en el aparato de Golgi de las células de origen murino (Cummings R.D. y Mattox S.A., J. Biol. Chem. 263:511-519, 1988; Blake D.A. y Goldstein I.J., J. Biol. Chem. 256:5387-5393, 1981; Elices M.J., Blake D.A. y Goldstein I.J., J. Biol. Chem. 261:664-672, 1986), origen leporino (Basu M. y Basu S., J. Biol. Chem. 248:17-176, 1973; Betteridge A. y Watkins W.M., Eur. J. Biochem. 132:29-35, 1983), origen porcino y origen bovino (Blanken W.M. y Van den Eijnden D.H., J. Biol. Chem. 26:12927-12934, 1985) se ha demostrado que se encuentra catalizada por el enzima (a1,3)galactosiltransferasa.

En los polipéptidos destinados a la aplicación en el ser humano, la presencia de residuos terminales de galactosa unidos mediante enlace (a1,3)glucosídico debe minimizarse ya que esta glucoestructura inducirá una respuesta por parte del sistema inmunológico humano. Lo anterior puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el desarrollo laborioso de líneas celulares para la producción recombinante del polipéptido terapéutico que no introducen residuos terminales de galactosa unidos mediante enlace (a1,3)-glucosídico en las glucoestructuras del polipéptido terapéutico. Con el método cromatográfico utilizado generalmente en el procesamiento posterior del polipéptido en bruto, no pueden eliminarse las glucoestructuras que contienen Gal(a1,3).

En la patente EP n° 255 153, se informa de un procedimiento para producir una a-galactosidasa capaz de reducir el contenido de galactosa de los galactomananos mediante la escisión de las unidades alfa-D-galactopiranosilo unidas en enlace 1,6 a una cadena principal de unidades beta-D-manopiranosilo unidas en enalce 1,4. Se informa de un método para el examen clínico basado en las estructuras de oligosacáridos unidos a inmunoglobulina G en la patente EP n° 698 793. En la patente EP n° 1 878 747 se informa de anticuerpos glucomanipulados. Se informa del marcado selectivo de glicanos de inmunoglobulina en el documento n° WO 27/71347. En el documento n° WO 1997/1664 se informa de métodos y composiciones para la reducción del rechazo del xenotrasplante. En el documento n° WO 27/24743 se informa de preparaciones de anticuerpos con glucoformas sustancialmente homogéneas y no sialiladas, tales como G y G2, que se preparan mediante tratamiento enzimático, la expresión bajo determinadas condiciones, la utilización de células huésped particulares y el contacto con suero.

En el documento n° WO 28/57634 se informa de polipéptidos con propiedades antiinflamatorias incrementadas y citotóxicas reducidas y métodos relacionados. En el documento n° WO 27/24743 se informa de preparaciones de anticuerpos resistentes a la proteólisis.

Descripción resumida de la invención

Se ha encontrado que una (a1,3)galactos¡dasa de origen vegetal, por ejemplo de granos de café verde (EC

3.2.1.22) , puede utilizarse para eliminar selectivamente los residuos terminales de galactosa unidos mediante enlace (a1,3)-glucosid¡co del oligosacárldo en el aminoácido Asn297 a un dominio CH2 de inmunoglobullna. Se ha observado que las (a1,3)galactosldasas de origen no vegetal presentan una reactividad lateral de (p1,4)galactos¡dasa y/o que eran menos reactivos o nada reactivas con oligosacárldos tri- o tetra-antenarlos.

De esta manera, en la presente memoria se Informa de un método para producir una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobullna con una glucoestructura definida, que comprende las etapas siguientes en el orden siguiente:

proporcionar un eluido de columna de cromatografía de afinidad que contiene la inmunoglobullna o fragmento

de inmunoglobulina,

incubar el eluido de columna de cromatografía de afinidad con un enzima que escinde los residuos terminales de monosacárido de la glucoestructura en el dominio CH2 de la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina,

aplicar el eluido incubado de cromatografía de afinidad a un material de cromatografía con proteína A bajo condiciones adecuadas para la unión de la inmunoglobulina o fragmento de inmunogloublina al material de cromatografía con proteína A y recuperar la inmunoglobulina o fragmento de inmuoglobulina del material de cromatografía con proteína A y producir de esta manera una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina con una glucoestructura definida.

En una realización, el enzima, que escinde el residuo monosacárido en el extremo no reductor de la glucoestructura en el dominio CH2 de la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina, es de origen vegetal. En una realización, el enzima, que escinde el residuo monosacárido en el extremo no reductor de la glucoestructura en el dominio CH2 de la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina, se selecciona de entre a-D-galactósido galactohidrolasa (EC

3.2.1.22) o melibiasa. En otra realización, el enzima es (a1,3)galactosidasa de granos de café verde (EC 3.2.1.22). En otra realización, el residuo monosacárido terminal de la glucoestructura en el dominio CH2 de la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina es un residuo galactosa unido mediante enlace (a1,3).

En una realización, la incubación del eluido de columna de cromatografía de afinidad con un enzima, que escinde el residuo monosacárido... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para producir una inmunoglobulina o polipéptido que comprende por lo menos el dominio CH2 y el dominio CH3 de una cadena pesada de Inmunoglobulina de longitud completa con una glucoestructura definida, que comprende las etapas siguientes:

- proporcionar un eluldo de columna de cromatografía de afinidad que contiene la inmunoglobulina o fragmento de Inmunoglobulina,

- Incubar el eluldo de columna de cromatografía de afinidad con una a-galactosidasas de origen vegetal que escinde los residuos terminales de galactosa unidos mediante enlace (a1,3)-glucosídico en el extremo no reductor de la glucoestructura en el dominio CH2 de la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina,

- aplicar el eluido de columna de cromatografía de afinidad incubado a un material de cromatografía con proteína A y recuperar la inmunoglobulina o fragmento de Inmunoglobulina a partir del material de cromatografía con proteína A y producir de esta manera una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina con glucoestructura definida.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que el enzima, que escinde el residuo monosacárldo en el extremo no reductor de la glucoestructura en el dominio CH2 de la Inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina, es la (a1,3)-galactosidasa (EC 3.2.1.22) procedente de granos de café verde.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que la incubación del eluido de columna de cromatografía de afinidad con un enzima, que escinde el residuo monosacárldo en el extremo no reductor de la glucoestructura en el dominio CH2 de la Inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina, comprende las etapas siguientes:

- incubar el eluldo de columna de cromatografía de afinidad con una (a1,3)-glucosidasa,

- obtener una muestra de la mezcla de incubación,

- o bien

+ aplicar la muestra a perlas de sefarosa recubiertas de proteína A y seguidamente lavar las perlas,

- recuperar la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina de las perlas de sefarosa con proteína A,

+ ajustar las condiciones del tampón para el digerido de glucosidasa/sialidasa, y

+ incubar la inmunoglobulina o fragmentos de inmunoglobulina con una glucosidasa/sialidasa para escindir todos los N-gilcanos, o

+ aplicar la muestra a perlas magnéticas recubiertas de proteína A y seguidamente lavar las perlas,

+ Incubar las perlas con una glucosidasa y recuperar los oligosacáridos escindidos, y + purificar los oligosacáridos escindidos mediante cromatografía de intercambio catiónico,

- determinar el tipo y cantidad de residuo monosacárldo en el extremo no reductor de la glucoestructura en los oligosacáridos escindidos, mediante espectrometría de masas,

- continuar la Incubación hasta que todos los residuos monosacáridos en el extremo no reductor de la glucoestructuras que pueden ser escindidos por el enzima han sido escindidos.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además las etapas siguientes como primeras etapas:

- proporcionar una célula que comprende un ácido nucleico codificante de la Inmunoglobulina o fragmento de Inmunoglobulina, - cultivar la célula, - recuperar la Inmunoglobulina o fragmento de Inmunoglobulina a partir de la célula o del medio de cultivo, - aplicar la Inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina a un material de cromatografía con proteína A y recuperar la inmunoglobulina a partir del material de cromatografía con proteína A.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa siguiente como etapa final:

- purificar la Inmunoglobulina o fragmento de Inmunoglobulina producido con una glucoestructura definida mediante una a tres etapas de cromatografía.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, caracterizado por que la célula es una célula de mamífero.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado por que la célula de mamífero es una célula de hámster, una célula murina, una célula de conejo, una célula de oveja o una célula de hibridoma de las mismas.

8. Método según la reivindicación 6 o 7, caracterizado por que la célula es una célula CHO, una célula NS, una célula BHK o una célula SP2/.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos aminoácidos 18 a 364 de SEC ID n° 2.

1. Utilización de una (a,3)galactosidasa procedente granos de café verde (EC 3.2.1.22) para escindir los residuos

terminales de galactosa unidos mediante enlace (a,3)-glucosídico al aminoácido asparagina del dominio CH2 de una inmunoglobulina o fragmento de inmunoglobulina producido recombinantemente.