Procedimientos de replicación de virus de influenza en cultivo celular y virus de influenza obtenibles por el procedimiento.

SE DESCRIBEN NUEVOS PROCESOS PARA LA REPLICACION EN CULTIVO CELULAR DE VIRUS DE LA GRIPE Y VACUNAS Y COMPOSICIONES DIAGNOSTICAS QUE CONTIENEN LOS VIRUS DE LA GRIPE QUE PUEDEN OBTENERSE A TRAVES DEL PROCESO O SUS CONSTITUYENTES.

Procedimiento de replicación de virus de influenza en un cultivo celular y virus de influenza obtenibles por el procedimiento.

La presente invención se refiere a procedimientos para la replicación de virus de influenza en cultivo de células a temperaturas reducidas, y a los virus de influenza obtenibles por el procedimiento descrito y a las vacunas que puedan contener virus de este tipo o constituyentes de los mismos.

Todas las vacunas para la influenza que han sido usadas desde los años 40 hasta el presente como vacunas permitidas para el tratamiento de seres humanos y animales están constituidas por una o más cepas del virus que han sido repicadas en huevos embrionados de gallina. Éstos virus son aislados del fluido alantoideo de los huevos de las gallinas infectadas y sus antígenos son usados como vacuna, como partículas de virus intactas o como partículas de virus desintegradas por detergentes y/o solventes -así llamadas vacunas fraccionadas- o como proteínas definidas del virus aisladas -así llamadas vacunas de subunidad. En todas las vacunas permitidas, los virus son inactivados por procedimientos conocidos por las personas expertas en la técnica. Aún la replicación de virus vivos atenuados, los que son evaluados en vacunas experimentales, se lleva a cabo en huevos embrionados de gallina.

El uso de huevos embrionados de gallina, para la producción de vacunas demanda mucho tiempo, trabajo resulta costoso. Los huevos de gallineros de gallinas sanas, controladas por veterinarios, deben ser incubados antes de la infección, los huevos deben ser seleccionados en relación a los embriones vivos, dado que sólo estos huevos son adecuados para la replicación del virus. Tras la infección, los huevos son incubados nuevamente, habitualmente durante 2 a 3 días. Los embriones aún vivos en este momento, son matados con frío y se obtiene el fluido alantoideo de cada huevo individualmente por aspiración. Mediante procedimientos laboriosos de purificación se separan sustancias de los huevos de las gallinas que llevan a efectos indeseados de las vacunas, de los virus, y éstos son concentrados. Como los huevos no son estériles (libres de patógenos), es necesario también remover y/o inactivar pirógenos y todos los patógenos posiblemente presentes. Para aumentar el rendimiento de virus, la replicación de los virus de influenza en huevos de gallina, ésta es llevada a cabo por regla general a temperaturas reducidas (alrededor de 34ºC). Aún los virus que pueden provocar enfermedades respiratorias pueden ser replicados en cultivo celular. También aquí, en algunos casos se usan temperaturas reducidas (alrededor de 33ºC), las que sin embargo no afectan la calidad de la vacuna obtenida, sólo favorecen la replicación.

Los virus de otras vacunas, como por ejemplo el virus de la rabia, paperas, sarampión y rubéola, polio y meningoencefalitis (FSME) pueden ser replicados en cultivos celulares. Como los cultivos celulares originados de bancos de células evaluados están libres de patógenos, en contraste con los huevos de gallina, son un sistema definido de replicación que (teóricamente) está disponible en cantidades casi ilimitadas, hacen posible la replicación de virus de manera económica bajo ciertas circunstancias, aún en el caso de los virus de influenza. Es posible conseguir una producción económica de vacunas además por el hecho de que el aislamiento y purificación desde un medio estéril de un cultivo celular definido parece ser más simple que el realizado desde el fluido alantoideo, con su alto contenido proteico.

El aislamiento y replicación de virus de influenza en huevos lleva a una selección de ciertos fenotipos, la mayoría de los cuales difieren del aislamiento clínico. En contraste con esto, en el aislamiento y replicación de virus en cultivos celulares no ocurre ninguna selección dependiente de las etapas (Oxford, J.S. y col., J. Gen. Virology 72 (1.991), 185-189; Robertson, J.S. y col., J. Gen. Virology 74 (1.993) 2.047-2.051). Por lo tanto, la replicación de virus en cultivos celulares es también de preferencia frente a aquella en huevos en relación a este aspecto, para obtener vacunas efectivas. Es sabido que los virus de influenza pueden ser replicados en cultivos celulares. Frente a las células embrionadas de gallina y células de hámster (BHK21-F y HKCC), se ha descrito que las células MDBK, y en particular MDCK son apropiadas para la replicación in vitro de virus de la influenza (Kilbourne, E. D., en: Influenza, páginas 89-110, Plenum Medical Book Company - New York and London, 1.987). Un requisito previo para una infección exitosa es el agregado de proteasas al medio de infección, de preferencia tripsina o serino proteasas similares, ya que estas proteasas fraccionan extracelularmente al precursor de hemaglutinina [HA₀] dando lugar a hemaglutinina activa [HA₁ y HA₂]. Solamente la hemaglutinina fraccionada lleva a la adsorción de los virus de influenza en las células con la subsecuente asimilación del virus dentro de la célula (Tobita, K. y col., Med. Microbiol. Immunol., 162 (1.975), 9-14; Lazarowitz, S.G. & Choppin, P.W., Virology, 68 (1.975) 426-439) y de este modo a un posterior ciclo de replicación del virus en el cultivo celular.

La patente US 4.500.513 describe la replicación de virus de influenza en cultivos celulares de células de crecimiento adherente. Después de la proliferación celular, el medio nutritivo es eliminado y se añade medio nutritivo fresco a las células, y la infección de las células con virus de influenza tiene lugar simultáneamente o apenas después. A un tiempo determinado después de la infección se agrega proteasa (por ejemplo tripsina) con el objeto de obtener una replicación viral óptima. Los virus son recolectados, purificados y procesados para obtener vacunas inactivadas o atenuadas. La replicación de manera económica del virus de la influenza como un requisito previo para la producción de vacunas no puede ser cumplida, de cualquier manera, usando la metodología descrita en la mencionada patente, como el cambio de medio, la infección subsecuente, así como la adición de tripsina, la que es llevada a cabo más tarde, requiere que los recipientes de cultivo celular sean abiertos en varias oportunidades lo que resulta una tarea muy laboriosa. Además, el peligro de contaminación del cultivo celular por microorganismos y virus indeseables aumenta con cada manipulación de los recipientes de cultivo. Una alternativa más productiva en relación al costo es la proliferación celular en sistemas fermentadores conocidos por las personas expertas en la técnica, las células de crecimiento adherente en microportadores. El suero necesario para el crecimiento de las células en los microportadores (usualmente suero fetal de bovino), de cualquier manera, contiene inhibidores de tripsina, de manera tal que aún con este método de producción es necesario un cambio del medio por medio libre de suero para lograr el fraccionamiento de la hemaglutinina de influenza por la tripsina y de esta manera una replicación de virus adecuadamente alta. De este modo esta metodología también requiere la apertura de los recipientes de cultivo varias veces y así trae consigo el peligro aumentado de contaminación. En la patente US 4.500.513, la replicación viral se lleva a cabo a 34-37ºC. De manera similar, Mancini & Yano [Rev. Farm. Bioquím. Univ. S.Paulo (1.993) 29: 89-95] describen un procedimiento de cultivo celular para influenza en el que el virus es replicado a 35ºC. Estos autores usaron células MDCK cultivadas en un medio Eagle suplementado con suero fetal de bovino y neomicina. La tripsina fue agregada a las células cultivadas después de la infección con el virus de influenza.

El objetivo de la presente invención es crear procedimientos disponibles que hagan posible la replicación del virus de influenza en cultivo celular simple y económica y que permita obtener vacunas altamente eficaces.

Este objetivo se logra con la provisión de las formas de realización indicadas en las reivindicaciones de patente.

La invención de esta manera, se refiere a un procedimiento para la replicación de virus de influenza en cultivo celular, cuyas células, las que pueden ser infectadas por el virus de influenza son cultivadas en cultivo celular, las células son infectadas con virus de influenza y luego de la infección cultivadas a temperatura en el intervalo de 30 a 36ºC para la replicación viral. Antes o durante la infección con el virus de influenza, se agrega una proteasa al cultivo celular. Mayores... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la replicación de virus de influenza en cultivo celular, en el que las células que puedan ser infectadas por los virus de influenza son cultivadas en cultivo celular, las células son infectadas con virus de influenza y luego de la infección son cultivadas a una temperatura en el intervalo de 30ºC a 36ºC para la replicación viral, caracterizado porque se agrega una proteasa a las células cultivadas antes o durante la infección con los virus de influenza.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células son cultivadas con virus de influenza a una temperatura en el intervalo de 32ºC a 34ºC después de la infección para la replicación viral.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que las células son cultivadas con virus de influenza a 33ºC después de la infección para la replicación viral.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las células son células de vertebrado.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que las células de vertebrado son células de ave.

6. El procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células de ave son células embrionadas de gallina.

7. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que las células de vertebrado son células de mamífero.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que las células de mamífero son células de hámster, bovino, mono o perro.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células de mamífero son células BHK21-F, células HKCC, células VERO, o células MDCK.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células que pueden ser infectadas por virus de influenza crecen de manera adherente o en suspensión.

11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que las células son cultivadas en un medio libre de suero.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la proteasa es una serino proteasa.

13. El procedimiento según la reivindicación 12, en el que la serino proteasa es tripsina.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la recolección y el aislamiento de los virus de influenza tiene lugar 2 a 10 días después de la infección.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que la recolección y el aislamiento de los virus de influenza tiene lugar 2 a 7 días después de la infección.

16. Un virus de influenza obtenible por un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Una vacuna que contiene virus de influenza según la reivindicación 16.

18. Una vacuna según la reivindicación 17, en combinación con sustancias que incrementen la respuesta inmune.

19. Una vacuna según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en la que el virus de influenza esté presente como partículas virales intactas, como virus atenuado o como partículas virales desintegradas.

20. Una vacuna que contiene constituyentes de un virus de influenza según la reivindicación 16.

21. Una vacuna según la reivindicación 20, en combinación con sustancias que incrementen la respuesta inmune.

22. Una vacuna según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, que contiene proteínas aisladas del virus de influenza.

23. Una composición diagnóstica, que contiene virus de influenza según la reivindicación 16 o constituyentes de dichos virus de influenza.