Procedimientos de producción de proteínas usando compuestos antisenescencia.

Un procedimiento de producción de una proteína de fusión TNFR en cultivo celular que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica la proteína de fusión TNFR, expresándosedicho gen en condiciones de cultivo celular, en un medio de cultivo celular que comprende un compuestoantisenescencia, en el que el compuesto antisenescencia está seleccionado del grupo que consiste encarnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, anserina y beta alanina y combinaciones de los mismos y en el queel compuesto antisenescencia está presente en el medio de cultivo celular a una concentración de entreaproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM; y

mantener el cultivo en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la expresión de la proteína; enel que el cultivo celular muestra una característica de cultivo celular mejorada que difiere de una característicade cultivo celular correspondiente que se observaría en condiciones de otro modo idénticas en un medio deotro modo idéntico que carece del compuesto antisenescencia; en el que la característica de cultivo mejoradaestá seleccionada del grupo que consiste en: título aumentado, productividad específica celular aumentada,acumulación de agregados de alto peso molecular reducida, acumulación de especies ácidas reducida ycombinaciones de los mismos.

Procedimientos de producción de proteínas usando compuestos antisenescencia Referencia cruzada a solicitudes relacionadas La presente solicitud está en trámite junto con, comparte al menos un inventor común con, y reivindica beneficio de prioridad respecto de, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos número 60/913.382, presentada el 23 de abril de 2007.

Antecedentes de la invención La presente divulgación se refiere, en general, a la producción de proteínas en cultivos de células de mamífero. Particularmente, la presente divulgación se refiere a cultivar células de mamífero en presencia de un compuesto antisenescencia, por ejemplo carnosina, para mantener la viabilidad y aumentar la productividad con calidad superior. El cultivo de células ha producido muchos productos proteicos. Estos productos, tales como anticuerpos monoclonales producidos por hibridoma, pueden usarse para terapia, investigación u otras aplicaciones. Se usan con frecuencia células animales, especialmente células de mamífero, para producir proteínas. Desafortunadamente, el uso de células animales provoca que el procedimiento de producción consuma tiempo y sea costoso.

Añadir un agente químico a un medio de cultivo celular puede aumentar la productividad celular induciendo que las células produzcan un producto, aumentando de este modo el rendimiento global. El agente óptimo para usar varía dependiendo de varios factores, incluyendo el producto proteico deseado y el tipo celular. Factores similares también afectan a la cantidad del agente seleccionado añadido y cuándo se añade el agente al medio de cultivo celular. Son ejemplos de agentes ácidos alcanoicos o sales, derivados de urea, o dimetilsulfóxido (DMSO) . Los agentes químicos, tales como butirato sódico pueden tener diversos efectos en la producción proteica. La adición de un agente puede aumentar la productividad específica de las células, pero también tiene efectos citotóxicos y puede inhibir el crecimiento y la viabilidad celular.

A medida que las células producen una proteína, típicamente, la proteína se secreta al medio de cultivo celular. La proteína específica, sin embargo, no es la única materia en el medio; también se encuentran con frecuencia en el medio agregados de alto peso molecular, especies ácidas y otros materiales, que pueden hacer el procedimiento de purificación más laborioso y costoso. Están disponibles técnicas y procedimientos para mejorar la calidad del producto, que permiten purificación proteica más eficaz; incluyendo, entre otros, alterar las condiciones del biorreactor o usar una línea celular diferente. Sin embargo, sigue existiendo no obstante la necesidad en el campo de técnicas y procedimientos de producción proteica que conduzcan a procedimientos de purificación mejorados.

Por lo tanto, lo que se necesita es un agente químico que se añada al medio de cultivo celular que pueda potenciar la expresión de una proteína de interés manteniendo a la vez alta viabilidad celular. Lo que se necesita además es un agente que aumente la calidad del producto de la proteína reduciendo la cantidad de agregados de alto peso molecular y especies ácidas en el medio de cultivo celular.

Sumario de la invención En ciertas realizaciones, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para producción potenciada de un producto proteico. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona procedimientos para cultivar células huésped que expresan una proteína de interés en un medio que comprende un compuesto antisenescencia de modo que se potencie la producción global de la proteína de interés. En ciertas realizaciones, dicho compuesto antisenescencia comprende carnosina.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones que potencian la producción de una proteína de interés. Puede producirse cualquiera de una diversidad de proteínas de acuerdo con los procedimientos y composiciones de la presente invención. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se usan procedimientos y composiciones de la presente invención para producir un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se usan procedimientos y composiciones de la presente invención para producir un receptor, opcionalmente ligado con uno o más restos proteicos adicionales. Por ejemplo, pueden usarse procedimientos y composiciones de la presente invención para producir una proteína de fusión TNFR.

En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona un medio de cultivo celular que comprende un compuesto antisenescencia que potencia la producción de una proteína de interés expresada en una célula huésped en el que dicho compuesto de senescencia se selecciona del grupo que consiste en carnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, anserina y beta alanina. En ciertas realizaciones, dicho compuesto antisenescencia comprende carnosina. En ciertas realizaciones, se combinan células huésped manipuladas genéticamente con un medio de inóculo para formar un medio de cultivo celular, que se cultiva en un biorreactor. Durante un ciclo de producción del producto proteico deseado, las condiciones del biorreactor pueden alterarse y/o pueden añadirse complementos para aumentar la productividad y/o mantener la viabilidad. Los complementos pueden incluir un medio de alimentación y/o uno o más aditivos tales como, en la presente divulgación, carnosina y/u otros compuestos antisenescencia seleccionados de acetilcarnosina, homocarnosina, antiserina y beta alanina.

Las células huésped de mamífero, por ejemplo, células de ovario de hámster Chino (CHO) , pueden experimentar una reducción de la viabilidad cerca del final de un ciclo de producción en un biorreactor. Se ha descubierto que la adición de un agente antisenescencia tal como carnosina y análogos de la misma, a un medio de cultivo celular ayuda a mantener un mayor número de células viables y viabilidad celular hasta que se recoja la proteína.

Además, pueden usarse procedimientos para aumentar la productividad, tales como alterar la temperatura después de la fase de crecimiento y/o durante la fase de producción del ciclo de producción de acuerdo con la presente invención. Para proporcionar solamente un ejemplo, durante la producción de un producto proteico, específicamente el anticuerpo para factor de diferenciación de crecimiento 8 (GDF-8) , la temperatura se modificó hacia abajo para ayudar a iniciar y aumentar la productividad. En ciertas realizaciones, la adición de un compuesto antisenescencia tal como carnosina ayuda a aumentar la productividad del cultivo celular. En ciertas realizaciones, un compuesto antisenescencia seleccionado del grupo que consiste en carnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, antiserina y beta alanina puede añadirse antes, durante y/o después de dicho cambio de temperatura.

También se ha descubierto que la adición de un compuesto antisenescencia tal como carnosina a un medio de cultivo celular aumenta la calidad global del producto proteico. Durante la producción de la proteína, hay en el medio de cultivo celular agregados de alto peso molecular, junto con otras especies no deseadas. La adición de carnosina reduce la cantidad de agregados moleculares altos y aumenta la calidad del producto.

La concentración de compuesto antisenescencia (por ejemplo, carnosina) añadido al medio de cultivo celular puede variar dependiendo de muchos factores del procedimiento, incluyendo, por ejemplo, el tipo celular, el producto deseado y las condiciones del biorreactor, entre otros. Además, la carnosina puede sustituirse con sus análogos; acetilcarnosina, homocarnosina, anserina y beta alanina. En ciertas realizaciones, se proporciona carnosina en combinación con uno o más compuestos antisenescencia. En ciertas realizaciones, la concentración de agente antisenescencia (por ejemplo, carnosina) en un medio de cultivo celular es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 100 mM. En ciertas realizaciones, la concentración es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 40 mM. En ciertas realizaciones, la concentración es de aproximadamente 20 mM.

Puede usarse cualquier procedimiento de cultivo adecuado y medio de inóculo para cultivar las células en el procedimiento de producción proteica. Puede usarse tanto suero como medio sin suero. Además, pueden usarse procedimientos de cultivo para cultivar las células según sea apropiado para el tipo celular y el producto proteico específicos. Dichos procedimientos se conocen y se entienden por los expertos en la materia de cultivo celular.

Otras características y ventajas de la divulgación resultarán evidentes a partir de la descripción siguiente y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos Figura 1a. Efecto de Carnosina... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una proteína de fusión TNFR en cultivo celular que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica la proteína de fusión TNFR, expresándose dicho gen en condiciones de cultivo celular, en un medio de cultivo celular que comprende un compuesto antisenescencia, en el que el compuesto antisenescencia está seleccionado del grupo que consiste en carnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, anserina y beta alanina y combinaciones de los mismos y en el que el compuesto antisenescencia está presente en el medio de cultivo celular a una concentración de entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM; y mantener el cultivo en condiciones y durante un tiempo suficientes para permitir la expresión de la proteína; en el que el cultivo celular muestra una característica de cultivo celular mejorada que difiere de una característica de cultivo celular correspondiente que se observaría en condiciones de otro modo idénticas en un medio de otro modo idéntico que carece del compuesto antisenescencia; en el que la característica de cultivo mejorada está seleccionada del grupo que consiste en: título aumentado, productividad específica celular aumentada, acumulación de agregados de alto peso molecular reducida, acumulación de especies ácidas reducida y combinaciones de los mismos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el compuesto antisenescencia comprende carnosina.

3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que se proporciona adicionalmente al cultivo celular componentes complementarios.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que se proporcionan componentes complementarios en un medio de alimentación.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 o 4, en el que los componentes complementarios están seleccionados del grupo que consiste en hormonas y/u otros factores de crecimiento, iones particulares (tales como sodio, cloruro, calcio, magnesio y fosfato) , tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, oligoelementos (compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales muy bajas) , aminoácidos, lípidos, glucosa u otra fuente de energía y combinaciones de los mismos.

6. Un procedimiento de producción de una proteína de fusión TNFR que comprende las etapas de:

cultivar células de mamífero que contienen un gen que codifica la proteína de fusión TNFR en un medio de cultivo celular, expresándose dicho gen en condiciones de cultivo celular, a una primera temperatura o intervalo de temperaturas propicias para el crecimiento celular durante una fase de crecimiento; cambiando la temperatura o intervalo de temperaturas del medio de cultivo celular a una segunda temperatura o intervalo de temperaturas propicias para la producción de proteínas; cultivar las células huésped en el medio de cultivo celular a la segunda temperatura o intervalo de temperaturas a través de una fase de transición y en una fase de producción; en el que un compuesto antisenescencia se añade al cultivo celular y de modo que el cultivo celular muestre una característica de cultivo celular mejorada que difiere de una característica de cultivo celular correspondiente que se observaría en condiciones de otro modo idénticas en un medio de otro modo idéntico que carece del compuesto antisenescencia, en el que el compuesto antisenescencia está seleccionado del grupo que consiste en carnosina, acetilcarnosina, homocarnosina, anserina y beta alanina y combinaciones de los mismos; en el que el compuesto antisenescencia está presente en el medio de cultivo celular a una concentración de entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM; y en el que la característica de cultivo celular mejorada está seleccionada del grupo que consiste en: título aumentado, productividad específica de célula aumentada, acumulación de agregados de alto peso molecular reducida, acumulación de especies ácidas reducida y combinaciones de los mismos.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el compuesto antisenescencia se añade al medio de cultivo celular al comienzo del procedimiento de cultivo celular.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que el compuesto antisenescencia se añade al medio de cultivo celular durante la fase de crecimiento.

9. El procedimiento de la reivindicación 6, 7 u 8, en el que el compuesto antisenescencia se añade al medio de cultivo celular durante la fase de transición.

10. El procedimiento de la reivindicación 6-9, en el que el compuesto antisenescencia se añade al medio de cultivo celular durante la fase de producción.

11. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el compuesto antisenescencia comprende carnosina.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el cultivo celular se proporciona adicionalmente con componentes complementarios.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que los componentes complementarios se proporcionan en un medio de alimentación.

14. El procedimiento de la reivindicación 12 o 13, en el que los componentes complementarios están seleccionados del grupo que consiste en hormonas y/u otros factores de crecimiento, particularmente iones (tales como sodio,

cloruro, calcio, magnesio y fosfato) , tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, oligoelementos (compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales muy bajas) , aminoácidos, lípidos, glucosa u otra fuente de energía y combinaciones de los mismos.

15. El procedimiento de la reivindicación 12, 13 o 14, en el que los componentes complementarios incluyen un compuesto antisenescencia.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de fusión TNFR producida es heteróloga para las células de mamífero.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células de mamífero son células CHO.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de fusión TNFR 15 comprende un TNFR-Fc.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el TNFR-Fc es etanercept.

20. Un procedimiento de preparación de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además la etapa de aislar la proteína del medio de cultivo celular.

21. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la proteína se purifica o procesa adicionalmente 20 para formulación.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la proteína se formula en una composición farmacéutica.

23. Un procedimiento de preparación de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los agregados de alto peso molecular comprenden proteína mal plegada.

Figura 1 a. Efecto de Carnosina en Picos Ácidos para MYO-29.

Figura 1b. Efecto de Carnosina en Agregados de Alto Peso Molecular

Figura 1c. Efecto de Adiciones de Carnosina en Días Diferentes en Picos Ácidos

Figura 1d. Efecto de Adiciones de Carnosina en Días Diferentes en Agregados de Alto Peso Molecular

Figura 2a. Efecto de Carnosina en la Densidad Celular Viable Diaria.

Figura 2b. Efecto de Carnosina en la Viabilidad Celular Diaria

Figura 2c. Efecto de Carnosina en el Título Diario.

Figura 2d. Efecto de Carnosina en la Productividad Celular Específica Acumulada

Figura 2e. Efecto de Carnosina en Agregados de Alto Peso Molecular

Figura 3a. Efecto de Diferentes Concentraciones de Carnosina en la Densidad Celular Viable

Figura 3b. Efecto de Diferentes Concentraciones de Carnosina en la Viabilidad Celular Diaria

Figura 3c. Efecto de Diferentes Concentraciones de Carnosina en el Título Diario

Figura 3d. Efecto de Diferentes Concentraciones de Carnosina en la Productividad Celular Específica Acumulada

Figura 3e. Efecto de Diferentes Concentraciones de Carnosina en los Agregados de Alto Peso Molecular

Figura 4. Perfiles de Densidad Celular Viable de una Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que Produce Proteína de Fusión TNFR Recombinante Cultivada en Medios que Contienen o Carecen de Carnosina

Figura 5. Perfiles de Viabilidad Celular de una Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que Produce Proteína de Fusión TNFR Recombinante en Medios que Contienen o Carecen de Carnosina

Figura 6. Efecto de Carnosina en el Porcentaje de Proteína de Fusión TNFR Agregada/Mal Plegada

Figura 7. Efecto de Carnosina en el Porcentaje de Agregados de Alto Peso Molecular (HMW) Producidos por una Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que Produce Proteína de Fusión TNFR Recombinante.

Figura 8. Perfiles de Título de Producto de una Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que Produce Proteína de Fusión TNFR Recombinante Cultivada en Medios que Contienen o Carecen de Carnosina

Figura 9. Perfiles de Productividad Celular Específica de una Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) que produce Proteína de Fusión TNFR Recombinante Cultivada en Medios que Contienen o Carecen de Carnosina Figura 10. Perfiles de Sialilación Total, Expresados como un Porcentaje del Material de Referencia, de Proteína de Fusión TNFR Recombinante producida por una Línea Celular de Ovario de Hámster Chino (CHO) Cultivada en Medios que Contienen o Carecen de Carnosina