Procedimiento para obtener el derivado sintético de lignano hinoquinina,

que comprende las etapas siguientes: a) reacción de la cubebina con PCC en diclorometano seco, en una atmósfera inerte (N 2), durante 24 horas, a una temperatura de aproximadamente -6ºC bajo agitación constante; b) análisis cromatográfico para el seguimiento de la reacción; c) aislamiento de la hinoquinina (6) mediante: 1) vertido del medio de reacción en una columna cromatográfica (bajo vacío) con placa sinterizada nº 2 que contiene MgSO 4 monohidratado y proporcionando filtración al vacío, 2) sometimiento de la muestra a una columna cromatográfica con gel de sílice 60 y el sistema de gradientes de solventes siguiente: 100% de hexano, hexano:acetato de etilo 8:2, hexano:acetato de etilo 7:3, hexano:acetato de etilo 6:4, 100% de acetato de etilo y 100% de metanol; d) transferencia de la fase orgánica a un matraz de recolección, seguido de la purificación en cromatografía circular preparativa [CCP] (CROMATOTRON)

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a procedimientos para obtener derivados semisintéticos de la cubebina, especialmente hinoquinina y 6,6'-dinitrohinoquinina, que se utilizan para preparar fármacos destinados a proporcionar una actividad por lo menos cinco veces superior a la observada para la violeta de genciana y para otros compuestos utilizados hasta el momento para el tratamiento sanguíneo y la profilaxis de la enfermedad de Chagas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La utilización de plantas medicinales con fines terapéuticos se remonta al inicio de la civilización, en función de las necesidades humanas, cuando se inició un largo camino de manipulación, adaptación y modificación de los recursos naturales para su propio beneficio. Todavía en la actualidad, una gran parte de la población, especialmente personas de bajos ingresos, utiliza este antiguo arte como el recurso principal para el mantenimiento y el alivio de enfermedades.

En este contexto, la etnofarmacología actúa como herramienta muy importante en el estudio y la investigación de nuevos fármacos de origen vegetal, debido a que la diversidad molecular del reino vegetal todavía se considera ilimitada, a pesar de los avances científicos. Además, debido a que los productos procedentes de dichos organismos son muy similares a los del metabolismo de los mamíferos, estos productos naturales con frecuencia muestran diversas propiedades biológicas por la posible acción sobre receptores en el interior del organismo de los mamíferos.

Con los avances tecnológicos, algunos estudios más exhaustivos han demostrado a los investigadores y a la industria farmacéutica que resulta necesario sintetizar sustancias bioactivas, con productos naturales como sus materias primas. Se han utilizado numerosas clases de diferentes productos naturales para sintetizar nuevos fármacos. A título de ejemplo, existen derivados de terpeno utilizados como materias primas para la síntesis de artemisina, un derivado de sesquiterpeno con importantes actividades antipalúdicas. La clase de los lignanos, en la que se incluye la cubebina, se considera muy importante debido a que, aparte de las actividades ya mencionadas, presenta actividades antitumorales y antivíricas. En un estudio de Yang de 1996, se evaluó la actividad anti-VIH in vitro de lignanos aislados de la especie Trachelospermum gracilipes (Apocynacea), y los resultados han demostrado que la replicación vírica resultaba inhibida en las células H9 infectadas.

La enfermedad de Chagas fue definida en el continente americano en 1909. El agente causante de la enfermedad es Trypanosoma cruzi y afecta a más de 18 millones de personas en este continente, provocando aproximadamente 400.000 muertes cada año. En Brasil, un estudio realizado en la ciudad de Londrina (Parana) en 1995 presentó una estadística que mostraba que 834 niños de 7 a 14 años de edad mostraba serología positiva para la enfermedad de Chagas. Por lo tanto, todavía resulta necesario investigar para identificar agentes que muestren actividad tripanocida. En el continente americano, la incidencia de la infección humana por T. cruzi se estima en 16 a 18 millones de casos. Sin embargo, 90 millones más, es decir, 25% de la población del continente, presentan riesgo de resultar infectados. Entre los 211 millones de habitantes en la parte sur del continente americano, 11 millones de personas se encuentran infectadas y aproximadamente 54 millones presentan un riesgo de infección, representando de esta manera el 31% de la población. Según la Organización Mundial de la Salud, cada año mueren más de 50.000 personas debido a la enfermedad de Chagas.

Un estudio con personas de más de 74 años de edad en la región de Ribeirao Preto, estado de Sao Paulo, ha dado a conocer que 13% de las enfermedades cardíacas son una consecuencia de la “enfermedad de Chagas”.

La solución principal para evitar la enfermedad consiste todavía en combatir la triatomina, mientras que la contaminación por trasfusión sanguínea puede evitarse mediante el ensayo serológico del donante o mediante la adición de violeta de genciana a la sangre infectada.

Una importante revisión de los principios activos naturales que presentaban actividad tripanocida fue publicado en 1996. En esta revisión bibliográfica se incluyen diversas clases de metabolitos secundarios, pero no se incluye ningún metabolito de entre los lignanos. Sin embargo, un documento publicado recientemente por el grupo de los presentes inventores, titulado “Evaluation of the Trypanocidal Activity of Lignans Isolated from the Leaves of Zanthoxylum naranjillo”, de Basto, Albuquerque y Silva, en Planta Medica 65:541-544, 1999, ha observado que diversos lignanos dibencilbutirolactónicos muestran actividad tripanocida significativa, resultando la evaluación de los derivados de la cubebina prometedora contra la enfermedad de Chagas.

Durante la investigación realizada, se descubrió que los lignanos aislados a partir de Zanthoxylum naranjillo, tales como el metilpluviatólido y la cubebina, así como los derivados semisintéticos hinoquinina, o-acetil-cubebina, ometil-cubebina, 6,6'-dinitrohinoquinina yo-dimetiletilamina-cubebina, presentan actividad antiChagas.

Respecto a la cubebina, sólo se ha encontrado una patente relacionada con la actividad profiláctica y terapéutica en enfermedades renales (patente JP nº 01180824-A; clasificación internacional: A61K-031/36, C07D407/14), de 18 de julio de 1989.

**(Ver fórmula)**

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Según la exposición anterior, el objetivo de la invención tal como se propone en la presente memoria consiste en obtener los derivados semisintéticos cubebina, hinoquinina y 6,6'-dinitrohinoquinina, por medio de procedimientos descritos en la presente memoria, que se utilizarán para la preparación de fármacos que proporcionan una actividad por lo menos cinco veces más elevada que la observada con la violeta de genciana y otros compuestos utilizados hasta el momento presente para el tratamiento sanguíneo y la profilaxis de la enfermedad de Chagas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS

La figura 1 representa un diagrama de flujo del procedimiento para obtener lignanos a partir de Zanthoxylum naranjillo y Piper cubeba.

10 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Tal como se puede observar a partir de la figura 1, el procedimiento para obtener cubebina (1), lignano, con la fórmula estructural:

**(Ver fórmula)**

y el metilpluviatólido de lignano (2) con la fórmula estructural:

**(Ver fórmula)**

15 a partir de Zanthoxylum naranjillo incluye las etapas siguientes: a) recolección y secado al horno de hojas de Zanthoxylum naranjillo a una temperatura de entre 35ºC y 55ºC, b) trituración de hojas de Zanthoxylum naranjillo en un triturador de cuchillas, c) maceración de los polvos obtenidos a partir de hojas de Zanthoxylum naranjillo y extracción exhaustiva con 20 hexano a 25ºC durante aproximadamente cinco días, d) preparación del extracto grueso mediante filtración del producto de maceración y concentración del mismo bajo presión reducida a la temperatura de 30ºC hasta la eliminación completa del solvente, e) purificación repetida del extracto grueso obtenido a partir de hojas de Zanthoxylum naranjillo en una columna cromatográfica de gel de sílice y elución con un sistema de solventes partiendo de hexano, AcOEt (AcOEt) y 25 etanol en proporciones crecientes, suministrando 210 partes cromatográficas de 500 ml cada una,

**(Ver fórmula)**

f) obtención y aislamiento de cubebina (1) y metilpluviatólido (2) a partir de las partes cromatográficas mediante cristalización (hexano/acetona (Me2CO, 4:1) o cromatografía preparativa en capa fina (hexano/Me2CO, 4:1),

g) identificación realizada mediante análisis de datos de resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C, [α]D, masa, IV.

Este procedimiento ha permitido obtener cubebina (1) y metilpluviatólido (2).

De manera similar, el procedimiento para obtener cubebina a partir de Piper cubeba, cuyo diagrama de flujo también se ha representado mediante la figura 1, incluye las etapas siguientes:

a) trituración de semillas de Piper cubeba en un triturador de cuchillas,

b) maceración de los polvos obtenidos a partir de semillas de Piper cubeba y extracción exhaustiva con etanol al 90% durante ciclos de 72 horas,

c) preparación del extracto grueso mediante la filtración... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para obtener el derivado sintético de lignano hinoquinina, que comprende las etapas siguientes:

a) reacción de la cubebina con PCC en diclorometano seco, en una atmósfera inerte (N2), durante 24 horas, a5 una temperatura de aproximadamente -6ºC bajo agitación constante;

b) análisis cromatográfico para el seguimiento de la reacción;

c) aislamiento de la hinoquinina (6) mediante: 1) vertido del medio de reacción en una columna cromatográfica (bajo vacío) con placa sinterizada nº 2 que contiene MgSO4 monohidratado y proporcionando filtración al vacío, 2) sometimiento de la muestra a una columna cromatográfica con gel de sílice 60 y el sistema de gradientes de solventes siguiente: 100% de hexano, hexano:acetato de etilo 8:2, hexano:acetato de etilo 7:3, hexano:acetato de etilo 6:4, 100% de acetato de etilo y 100% de metanol;

d) transferencia de la fase orgánica a un matraz de recolección, seguido de la purificación en cromatografía circular preparativa [CCP] (CROMATOTRON)

**(Ver fórmula)**

15 2. Procedimiento para obtener el derivado sintético de lignano 6,6'-dinitrohinoquinina, utilizando la hinoquinina según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

a) reacción de la hinoquinina con ácido nítrico en cloroformo a -6ºC con agitación constante durante dos horas, seguido de la adición de una solución saturada de Na2CO3;

b) análisis cromatográfico para el seguimiento de la reacción; c) aislamiento de 6,6'-dinitrohinoquinina (7) mediante: 1) extracción del medio de reacción con cloroformo y la evaporación posterior bajo presión reducida; 2) recristalización en metanol;

d) transferencia de la fase orgánica a un matraz de recolección, seguido de la purificación en cromatografía circular preparativa [CCP] (CROMATOTRON).

**(Ver fórmula)**

3. Fármaco para la profilaxis de la enfermedad de Chagas que contiene los derivados sintéticos de lignano según la reivindicación 1 ó 2.