PROCEDIMIENTOS PARA PURIFICAR PROTEINAS ALTAMENTE ANIONICAS.
Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de ADN/histona,
que comprende los pasos de:
(a) purificación de la cromatografía de intercambio iónico de la proteína diana;
(b) cargar la muestra purificada de cromatografía de intercambio iónico que contiene la proteína a través en una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, de modo que la muestra sea capturada en la columna; y
(c) lavar la columna,
caracterizado porque el paso de lavado utiliza una solución que comprende:
- aproximadamente un 5% de isopropanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico,
- aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico,
- aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 4 M de NaCl
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06006739.
Solicitante: GENETICS INSTITITE, LLC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 87 CAMBRIDGE PARK DRIVE,CAMBRIDGE, MA 02140.
Inventor/es: COFFMAN, JONATHAN, L., FOSTER, WILLIAM, BARRY, GERMAIN, BONNIE, J., SUN, SHUJUN, ROBINSON, JEFFREY, J.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 27 de Marzo de 2001.
Fecha Concesión Europea: 24 de Marzo de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K1/18 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › Cromatografía de intercambio iónico.
- C07K1/20 C07K 1/00 […] › Cromatografía de partición, fase inversa o hidrófoba.
- C07K1/36 C07K 1/00 […] › por una combinación de varios procesos de diferentes tipos.
- C07K14/705Z
Clasificación PCT:
- C07K1/20 C07K 1/00 […] › Cromatografía de partición, fase inversa o hidrófoba.
- C07K14/705 C07K […] › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Procedimientos para purificar proteínas altamente aniónicas.
Antecedentes de la invención
La purificación de proteínas diana se suele dificultar por la deficiente extracción del ADN debido a las interacciones ADN/proteína. Dichas interacciones son más problemáticas en la purificación de proteínas diana altamente aniónicas, por ejemplo, proteínas sulfatadas.
La patente WO 95/22389 A1 describe un procedimiento para purificar anticuerpos mediante cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de interacción hidrofóbica, donde el ADN se elimina mediante la cromatografía de interacción hidrofóbica.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento para aislar y purificar proteínas diana altamente aniónicas, por ejemplo, proteínas sulfatadas. Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa neta. Las proteínas sulfatadas son proteínas en las que la carga negativa neta se debe a por lo menos un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína diana se refiere a la sustitución de al menos un (1) residuo sulfatado. La sulfatación de una proteína diana se refiere a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo (-OH) con -SO4H en o entre los aminoácidos contenidos dentro de la proteína diana. En una forma de realización preferida, la proteína sulfatada tiene al menos un (1) grupo de sulfatos. Las proteínas sulfatadas que contienen al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más grupos de sulfatos son abarcadas también por los procedimientos actuales, por ejemplo, seis grupos de sulfatos sobre las tirosinas N-terminal según se materializa en PSGL-1 (ligando de P-selectina glicoproteína-1).
La invención proporciona un procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de ADN/histona, que comprende los pasos de:
caracterizado porque el paso de lavado utiliza una solución que comprende:
En un aspecto, el procedimiento para purificar proteínas diana altamente aniónicas comprende las etapas de cromatografía de intercambio iónico bajo condiciones apropiadas para la purificación de las proteínas diana. Por ejemplo, el procedimiento dado a conocer consiste en: (1) poner en contacto la muestra con un sustrato capaz de unir, de forma reversible, las moléculas cargadas, de tal modo que las proteínas diana queden ligadas con el sustrato (2); lavar el sustrato con una primera solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo que una pluralidad de impurezas proteináceas y no proteináceas en la muestra no queden ligadas o se eliminen por lavado de sustrato, mientras que las proteínas diana altamente aniónicas permanecen ligadas; (3) eluir la muestra con una primera solución de elución en la que dicha primera solución de elución comprende una solución salina con una alta concentración molar y (4) recoger la muestra eluída, que contenga las proteínas diana aniónicas purificadas.
En una realización, el pH de la primera solución de lavado es aproximadamente 4,0 a 8,0. En otra forma de realización, el pH aproximado de la primera solución de lavado es 6,5.
En una forma de realización preferida, la proteína diana altamente aniónica es una proteína sulfatada y las impurezas incluyen una forma sulfatada de la proteína diana.
En otro aspecto, la muestra eluída a partir de la purificación de la cromatografía de intercambio iónico, que contiene las proteínas diana purificadas, se purifica todavía más. Esta purificación adicional las etapas de cromatografía de interacción hidrofóbica, bajo condiciones apropiadas para la purificación de las proteínas diana altamente aniónicas. Por ejemplo, esta purificación adicional proporciona las etapas de: (1) pasar la muestra eluída que contenga las proteínas diana a través de una columna de cromatografía de interacción hidrofóbica, de modo que la muestra eluída sea capturada en la columna; (2) lavar la columna con una segunda solución de lavado bajo condiciones apropiadas, de modo que se disocien los complejos de ADN/histona contenidos en la muestra; caracterizado porque la segunda solución de lavado se seleccionar del grupo compuestos de (a) una solución que comprende aproximadamente un 5% de isopropanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico, (b) una solución de aproximadamente un 5% de etanol y aproximadamente 1,2 M de sulfato amónico, y (c) una solución de aproximadamente un 5% de etanol y 4 M de NaCl, (3) eluir la muestra con una segunda solución de elución, y (4) recoger la muestra eluída, que contiene las proteínas diana altamente aniónicas purificadas.
En otro aspecto, las proteínas diana tienen al menos una (1) sulfatación. Las proteínas diana aniónicas que tienen al menos dos (2), tres (3), cuatro (4), cinco (5), seis (6) o más sulfataciones son también dadas a conocer; por ejemplo, proteínas PSGL-1. Las proteínas aniónicas capaces de purificarse por los procedimientos dados a conocer pueden ser proteínas que se presentan de forma natural o proteínas recombinantes.
En una forma de realización preferida, el procedimiento de purificación dado a conocer proporciona proteínas diana altamente aniónicas purificadas al menos un 99,9% puras de proteínas contaminantes.
En otra forma de realización dada a conocer, el procedimiento de purificación de la invención elimina al menos un 95% o 2,5 log10 valor de reducción logarítmica (LRV) del ADN contaminante desde las proteínas diana altamente aniónicas.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1-3 ilustran los procedimientos de purificación que se describen en la presente, es decir, procesos I-III tal como se describe en los Ejemplos.
Todas las figuras y ejemplos son esencialmente sólo a efectos de ilustración.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos procedimientos para purificar proteínas diana altamente aniónicas, por ejemplo, proteínas sulfatadas (p.e., PSGL-1). Las proteínas aniónicas son proteínas que tienen una carga negativa neta. Las proteínas sulfatadas son proteínas aniónicas en las que la carga negativa es debida al menos a una, o más preferentemente, cinco (5) o más sulfataciones, por ejemplo, al menos seis (6) sulfataciones. Las sulfataciones en una proteína diana se refieren a la sustitución de al menos un grupo hidroxilo (-OH) con --SO4H en o entre aminoácidos contenidos dentro de la proteína diana. Las sulfataciones pueden ocurrir, por ejemplo, en las tirosinas de N-terminal, según se materializa en PSGL-1.
En una forma de realización preferida, la proteína sulfatada es PSGL-1, por ejemplo, PSGL-1 que comprende el conjunto de aminoácidos dado a conocer en la patente de los Estados Unidos Nº 5.827.817. La secuencia completa de aminoácidos de la proteína PSGL-1 (por ejemplo, el péptido maduro más la secuencia líder) está caracterizada por la secuencia de aminoácidos dada a conocer en la patente de los Estados Unidos 5.827.817, desde el aminoácido 1 al aminoácido 402 y aquí dada a conocer como ID SEQ Nº 1. El análisis de la hidrofobicidad y su comparación con los modelos de segmentación conocidos predicen una secuencia de señales de 20 a 22 aminoácidos, por ejemplo, aminoácidos 1 a 20 o aminoácidos 1 a 22 de PSGL-1. PSGL-1 contiene un sitio de segmentación (-Arg-Asp-Arg-Arg-) de PACE (enzima de conversión de aminoácidos básicos pareados) en los residuos de aminoácidos 38-41. La proteína PSGL-1 madura está caracterizada por la secuencia de aminoácidos establecida en SED ID Nº 1 desde el aminoácido 42 al aminoácido 402. Una forma soluble de la proteína de ligandos de P-selectina está caracterizada por los aminoácidos 21 a 310 de la secuencia...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para purificar una proteína diana altamente aniónica en una muestra de una serie de complejos de ADN/histona, que comprende los pasos de:
caracterizado porque el paso de lavado utiliza una solución que comprende:
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína es hipersulfatada.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína es PSGL-1.
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