Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas.
Un procedimiento de conferir resistencia fúngica a una planta,
en el que el procedimiento comprendetransformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo el polinucleótidoheterólogo:
(a) una secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen depatogenicidad fúngica; y
(b) una secuencia sentido sustancialmente complementaria a la secuencia antisentido;
en el que un transcrito de la secuencia antisentido y un transcrito de la secuencia sentido pueden hibridarse paraformar una región bicatenaria; en el que las secuencias antisentido y sentido tienen cada una al menosaproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en el que la planta es más resistente a un hongo que expresa el gende patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/038330.
Solicitante: VENGANZA INC.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 893 NORTH WARSON ROAD ST. LOUIS, MO 63141 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: NIBLETT,CHARLES L.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/82 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.
PDF original: ES-2444001_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimientos y materiales para conferir resistencia a plagas y patógenos de plantas [0001]
CAMPO DE LA INVENCIÓN ............................................................................................................. 4 RESUMEN DE LA INVENCIÓN ........................................................................................................ 6 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ...................................................................................... 7
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS............................................................................... 8 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA DIVULGACIÓN E INVENCIÓN............................................. 11
Definiciones .......................................................................................................................... 11 Homología de genes de patogenicidad de la plaga.............................................................. 15
Vectores ............................................................................................................................... 17 Plantas huésped................................................................................................................... 17 Tipos de células huésped..................................................................................................... 18 Plagas .................................................................................................................................. 19 Tabla 1 Plagas – Bacterias .................................................................................................. 19
Tabla 2 Plagas – Mildius ...................................................................................................... 20 Tabla 3 Plagas - Nematodos parasíticos.............................................................................. 22 Tabla 4 Plagas – Fúngicos ................................................................................................... 23 Tabla 5 Plagas – Royas ....................................................................................................... 23 Genes de patogenicidad de la plaga.................................................................................... 24
Tabla 6 Plagas, genes de patogenicidad de plagas y plantas huésped............................... 25 Secuencias sentido (y antisentido) ....................................................................................... 25 Procedimientos de transformación ....................................................................................... 26 Ruta de polinización............................................................................................................. 27 Tecnología de Agrobacterium .............................................................................................. 27
Bombardeo con microproyectiles ......................................................................................... 28 Electroporación .................................................................................................................... 30 Vectores virales.................................................................................................................... 30 Genes marcadores............................................................................................................... 31 Marcadores de selección ..................................................................................................... 31
Marcadores cribables........................................................................................................... 32 Naturaleza de las cadenas de genes marcadores ............................................................... 33 Tabla 7 Polinucleótidos heterólogos..................................................................................... 34 Elementos promotores y reguladores................................................................................... 36 Terminador ........................................................................................................................... 37
Regeneración y propagación de plantas.............................................................................. 37 Apilamiento de genes........................................................................................................... 38 Despatogénesis.................................................................................................................... 39 Ejemplos .............................................................................................................................. 40 Ejemplo 1. Estrategia de clonación ................................................................................. 40
Ejemplo 2. Construcción del plásmido intermedio pVZA1 ............................................. 40 Ejemplo 3. Construcción de los plásmidos pVZA2, pVZA3, pVZA100, pVZA200, pVZA300 y pVZA400 plásmidos ........................................................................................ 40 Ejemplo 4. Procedimientos de transformación ............................................................... 42 Ejemplo 5. Transformación de tabaco con pVZA100 y regeneración............................ 42
Ejemplo 6. Transformación fúngica y protocolos de selección ..................................... 42 Ejemplo 7. Transformación de maíz, sojas y patata........................................................ 43 Ejemplo 8. Extracción de ADN y de ARN de tejidos de planta y fúngicos y protocolos de PCR y RT/PCR ............................................................................................ 43 Ejemplo 9. Detección de ARNip en tejidos de planta y fúngicos ................................... 44
Ejemplo 10. Tinción de GUS de tejidos de planta y fúngicos ........................................ 44 Ejemplo 11. Pruebas de inoculación de plantas con hongos ........................................ 45 Ejemplo 12. Caracterización molecular de plantas de tabaco resistentes a P. nicotianae .................................................................................................................... 45 Tabla 8. Detección y expresión de genes en plantas de tabaco transgénicas y naturales ...................................................................................................... 46 Ejemplo 13. Transformación fúngica y caracterización.................................................. 46 Tabla 9. Detección y expresión de genes en Phytophthora nicotianae transgénica y natural............................................................................................................ 47 5 Ejemplo 14. Demonstración del silenciamiento de genes en tabaco por detección de ARNip ............................................................................................................................. 48 Ejemplo 15. Secuencias de cutinasa de Phytophthora altamente homólogas útiles en el presente documento....................................................................................... 49 Tabla 10. Las secuencias de nucleótidos de los genes cutinasa de 25 cepas aisladas 10 que comprenden 9 especies de Phytophthora..................................................................... 49
Ejemplo 16. La resistencia intergenérica en tabaco se confirió por el silenciamiento del gen de P. nicotianae a una enfermedad producida por una Peronospora tabacina........................................................................................................ 55 Tabla 11. Reacciones de diferentes genotipos de tabaco a una epidemia natural de 15 moho azul del tabaco producida por Peronospora tabacina en el invernadero.................... 55
Tabla 12. Relación taxonómica entre Phytophthora nicotianae y Peronospora tabacina ....................................................................................................... 56
Ejemplo 17. Sojas transformadas y hechas resistentes con construcciones de silenciamiento de genes de Phytophthora . ............................................................... 56 20 Ejemplo 18 Patatas transformadas y hechas resistentes a Phytophthora infestans .. 57 Ejemplo 19. Sojas se hacen resistentes a podredumbre parda del tallo ARN de (Phialophora gregata) ........................................................................................................ 57 Ejemplo 20. Sojas se hacen resistentes a podredumbre parda del tallo (marcador de ADN de genotipo B de Phialophora gregata) .............................................................. 57 25 Ejemplo 21. Sojas se hacen resistentes a podredumbre del tallo y de la raíz (cutinasa de Phytophthora... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento de conferir resistencia fúngica a una planta, en el que el procedimiento comprende transformar una célula de planta huésped con un polinucleótido heterólogo, comprendiendo el polinucleótido heterólogo:
(a) una secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad fúngica; y
(b) una secuencia sentido sustancialmente complementaria a la secuencia antisentido;
en el que un transcrito de la secuencia antisentido y un transcrito de la secuencia sentido pueden hibridarse para formar una región bicatenaria; en el que las secuencias antisentido y sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en el que la planta es más resistente a un hongo que expresa el gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además un único promotor operativamente ligado a las secuencias antisentido y sentido.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el gen de patogenicidad fúngica está seleccionado del grupo que consiste en un gen cutinasa, un gen ARN ribosómico y un gen elicitina.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa.
5. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen ARN ribosómico.
6. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o Fusarium solani.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o Fusarium solani.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la secuencia antisentido tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad de al menos dos hongos de diferentes especies, y en el que la planta es más resistente a los al menos dos hongos que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido heterólogo comprende además:
(c) una segunda secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un segundo gen de patogenicidad fúngica;
(d) una segunda secuencia sentido sustancialmente complementaria a la segunda secuencia antisentido;
en el que el segundo gen de patogenicidad fúngica es diferente del primer gen de patogenicidad fúngica; y en el que un transcrito de la segunda secuencia antisentido y un transcrito de la segunda secuencia sentido pueden hibridarse para formar una segunda región bicatenaria; en el que las segundas secuencias antisentido y las segundas secuencias sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en el que la planta es más resistente a un hongo que expresa el primer o segundo gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a una subespecie diferente.
13. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a una especie diferente.
14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a un género diferente.
15. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a una familia diferente.
16. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la planta es más resistente a al menos dos hongos, en el que cada uno de los al menos dos hongos pertenece a un orden diferente.
17. Una planta transgénica que comprende un polinucleótido heterólogo que comprende:
(a) una secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad fúngica seleccionado del grupo que consiste en gen cutinasa, gen ARN ribosómico, gen adhesina y gen elicitina; y
(b) una secuencia sentido sustancialmente complementaria a la secuencia antisentido;
en la que un transcrito de la secuencia antisentido y un transcrito de la secuencia sentido pueden hibridarse para formar una región bicatenaria; en la que las secuencias antisentido y sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en la que la planta es más resistente a un hongo que expresa el gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
18. La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen ARN ribosómico.
19. La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa.
20. La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
21. La planta transgénica según la reivindicación 20, en la que el gen de patogenicidad fúngica es un gen cutinasa o un gen ARN ribosómico seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o Fusarium solani.
22. La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora gossypii, Phakopsora meibomiae, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium subglutinans, Fusarium monoliforme, Fusarium avenaceum, Fusarium graminearum, Fusarium acuminatum, Fusarium equiseti, Fusarium pallidoroseum, Fusarium poae, Fusarium roseum, Fusarium cyanogena, (Fusarium episphaeria, Fusarium merismoides o Fusarium tricinctum.
23. La planta transgénica según la reivindicación 22, en la que el hongo está seleccionado de Phakopsora pachyrhizi o (Fusarium solani.
24. La planta transgénica según la reivindicación 17, en la que la secuencia antisentido tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un gen de patogenicidad de al menos dos hongos de diferentes especies, y en la que la planta es más resistente a los al menos dos hongos que la misma planta que carece del
polinucleótido heterólogo.
25. Una planta transgénica según la reivindicación 17, en la que el polinucleótido heterólogo comprende además:
(c) una segunda secuencia antisentido que tiene al menos aproximadamente el 80 % de homología con un segundo gen de patogenicidad fúngica seleccionado del grupo que consiste en gen cutinasa, gen ARN ribosómico, gen adhesina y gen elicitina;
en el que el segundo gen de patogenicidad fúngica es diferentes del primer gen de patogenicidad fúngica; y 15
(d) una segunda secuencia sentido sustancialmente complementaria a la segunda secuencia antisentido;
en el que un transcrito de la segunda secuencia antisentido y un transcrito de la segunda secuencia sentido pueden hibridarse para formar una segunda región bicatenaria; en la que las segundas secuencias antisentido y las segundas secuencias sentido tienen cada una al menos aproximadamente 19 nucleótidos de longitud; y en la que la planta es más resistente a un hongo que expresa el primera o segundo gen de patogenicidad fúngica que la misma planta que carece del polinucleótido heterólogo.
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