Procedimientos de generación de señal y localización de señal para mejorar la legibilidad de señal en bioensayos basados en fase sólida.

Un dispositivo de ensayo para la detección de un material diana en una muestra de fluido, comprendiendo dicho dispositivo:

un sistema de detección de sustrato en fase sólida que comprende medios para el transporte de la muestra de fluido desde un sitio de aplicación de la muestra a un sitio de detección

(18);

un marcador no catalítico, dispuesto en una posición (14) alejada de dicho sitio de detección, conjugado con una molécula de afinidad específica para el material diana, comprendiendo dicho marcador no catalítico una pluralidad de moléculas precursoras de la señal, pudiéndose convertir dichas moléculas precursoras señal en una pluralidad de moléculas de generación de señal detectable, y

un medio portador (24) que comprende un disolvente para la disolución del marcador no catalítico y un espesante para producir la localización de la señal generada por dicha pluralidad de moléculas de generación de señal detectable en dicho sitio de detección que indica la presencia y / o cantidad de dicho material diana, disolviéndose dicho espesante en fase líquida en forma de una mezcla coloidal que forma una estructura interna que proporciona las propiedades del medio portador resultantes que varían desde las de un fluido de alta viscosidad a las de un gel; en el que dicho dispositivo de ensayo es una tira de ensayo de flujo lateral que comprende además una tapa ópticamente transparente (26) cargada con dicho medio portador (24) para su colocación sobre la tira de ensayo después de la finalización de una reacción de detección de material diana, y en el que dicho medio portador está adaptado para ser puesto en contacto con dichas moléculas de señal, al menos, en dicho sitio de detección.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2010/001152.

Solicitante: Supernova Diagnostics, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 20271 Goldenrod Lane, Suite 2028 Germantown, Maryland 20876 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: RENNEBERG, REINHARD, MAK,WING CHEUNG, WONG,LING WAI, CHAN,PUI YEE CANGEL, SIN,KING KEUNG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/543 (con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos)

PDF original: ES-2511052_T3.pdf

 

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Ilustración 1 de Procedimientos de generación de señal y localización de señal para mejorar la legibilidad de señal en bioensayos basados en fase sólida.
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Ilustración 4 de Procedimientos de generación de señal y localización de señal para mejorar la legibilidad de señal en bioensayos basados en fase sólida.
Procedimientos de generación de señal y localización de señal para mejorar la legibilidad de señal en bioensayos basados en fase sólida.

Fragmento de la descripción:

Procedimientos de generación de señal y localización de señal para mejorar la legibilidad de señal en bioensayos basados en fase sólida

Descripción

La presente invención se refiere a ensayos para analitos, por ejemplo, antígenos, en una muestra líquida tal como un fluido corporal. Más particularmente, la invención se refiere a un dispositivo de ensayo de flujo lateral para la detección de un analito en un fluido corporal tal como orina, sangre, suero, plasma, saliva o una solución de extracción de heces usando un conjugado que comprende material detectable como se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención también es aplicable a situaciones no clínicas, tales como ensayos de alimentos y agua para detectar la presencia de contaminantes, o en el sector veterinario o militar.

La invención usa un medio portador para llevar a diferentes reactivos para la generación de señal y la localización de señal en el ensayo. El medio portador comprende:

(i) Disolvente (por ejemplo, solución acuosa que incluye tampón, solución salina, agua, disolvente orgánico, por ejemplo, alcoholes tales como etanol, propanol; éteres tales como tetrahidrofurano (THF), y disolventes apróticos polares tales como dimetil sulfóxido (DMSO);

(ii) Espesante, que se disuelve en el disolvente como una mezcla coloidal que forma una estructura interna que proporciona las propiedades del medio portador resultantes que varían desde las de un fluido de alta viscosidad a un gel. Los medios portadores tipo gel tienen la apariencia de un sólido, mientras que están compuestos en su mayoría por el disolvente. Los ejemplos incluyen polímeros tales como poliacrilamida y poliisobutileno; polisacáridos tales como almidones, celulosa, alginatos obtenidos a partir de algas pardas, agar, carragenina, pectina; gomas naturales tales como goma de algarroba y goma guar; proteínas tales como colágeno, albúmina y gelatina.

En algunas realizaciones, el medio portador puede también incluir un reactivo de desarrollo de señal que es un material que convierte las moléculas precursoras de señal a un estado en el que se genera una señal detectable. En otras realizaciones, un reactivo de desarrollo de señal no es necesario porque la pluralidad de moléculas precursoras de señal se convierte a una pluralidad de moléculas de señal detectables por medios físicos tales como el cambio en la temperatura, cambio de pH, sonicación, irradiación de luz o calentamiento por microondas.

Las funciones del medio portador son:

(i) Impedir la difusión de las moléculas de señal, lo que lleva a la acumulación de señal.

(ii) Mejorar la legibilidad de la señal (nitidez, prolongación del tiempo de retención de la señal) en la plataforma de fase sólida, y por lo tanto potenciar la sensibilidad.

En algunas realizaciones, cuando la conversión de la pluralidad de moléculas precursoras de señal a una pluralidad de moléculas que generan señal detectable se produce por medios químicos o bioquímicos, el medio portador tiene una tercera función:

(iii) Generar una señal por medio de la conversión de una pluralidad de moléculas precursoras de señal a una pluralidad de moléculas que generan señal detectable.

Para los ensayos que usan detección de luz visible, el medio portador es sustancialmente ópticamente transparente.

Se han usado muchos tipos de ensayos diana - receptor para detectar la presencia de diversas sustancias diana en fluidos corporales tales como orina, sangre, suero, plasma, saliva o soluciones de extracción de heces. Estos ensayos implican típicamente reacciones antígeno anticuerpo, conjugados sintéticos con marcas metálicas radiactivas, enzimáticas, fluorescentes, luminiscentes, quimioluminiscentes, o visualmente observables, y usan cámaras de reacción especialmente diseñadas. En todos estos ensayos, hay un receptor, por ejemplo, un anticuerpo, que es específico para la diana seleccionada, por ejemplo, el antígeno, y un medio para detectar la presencia, y, a menudo la cantidad, del producto de reacción diana-receptor. Muchas pruebas actuales están diseñadas para proporcionar una determinación semi-cuantitativa o cuantitativa pero, en muchas circunstancias, todo lo que se requiere es una detección cualitativa que proporcione una indicación positiva o negativa de la presencia de la especie diana. Ejemplos de tales ensayos cualitativos incluyen la determinación de sangre, la mayoría de los tipos de análisis de orina y la muy importante prueba de sangre oculta en heces como un ensayo de evaluación del carcinoma colorrectal. Para estas pruebas, se prefieren los indicios visualmente observables, tales como la acumulación de partículas de color, por ejemplo, partículas de oro, la presencia de aglutinación o un cambio de color.

Sin embargo, los ensayos cualitativos deben ser muy sensibles debido a la frecuente concentración pequeña de la diana de interés en el fluido de ensayo. Se han desarrollado ensayos sándwich y otros procedimientos de detección sensibles que usan soles de metal u otros tipos de partículas de color. Sin embargo, estas técnicas no han resuelto todos los problemas encontrados en los procedimientos de detección rápida y se están buscando constantemente mejoras adicionales.

A modo de ejemplo, en ensayos sándwich de flujo lateral, con frecuencia se usa oro coloidal en forma de marcador de un primer anticuerpo (1), mientras que el otro anticuerpo (2) se fija en un sitio de detección bien definido en una membrana tal como una membrana de nitrocelulosa. Si el analito en cuestión está presente en una muestra, entonces el analito reacciona con el anticuerpo marcado de oro (1) y migra al anticuerpo unido a la membrana de nitrocelulosa (2). Allí se forma un sándwich y estos complejos de sándwich se recogen después y se concentraron en el sitio de detección. Este sitio se puede hacer más visible en cierta medida (amplificada) por reacción adicional con iones de plata.

Sin embargo, la sensibilidad analítica no es excepcional y esta tecnología no es fácilmente aplicable a ciertos ensayos, por ejemplo, para la determinación de la hormona estimulante de la tiroides (TSH), antígeno prostático específico (PSA), troponina I o troponina T en el intervalo de concentración baja, pero muy importante para el diagnóstico.

Por lo tanto, con el fin de hacer estos ensayos más eficaces, se usan otros marcadores (denominados "moléculas precursoras de amplificación de la señal") que pueden ser amplificados al final de la reacción de determinación, por ejemplo al final de la formación del sándwich: anticuerpo (2)f¡j- analito {anticuerpo (1) -marcador}.

Si el marcador de amplificación es una microcápsula que contiene diacetato de fluoresceína cristalina (FDA), que está constituida por millones de moléculas de FDA, entonces la amplificación se efectúa después de la reacción de determinación desintegrando la microcápsula e hidrolizando las moléculas de FDA no fluorescentes a moléculas de fluoresceína fluorescentes. Esta amplificación está bien probada y se describe en la patente europea concedida EP 139867.

Normalmente, la reacción de amplificación se lleva a cabo en una solución del reactivo de liberación. Esto lleva a una ligera disminución de la sensibilidad analítica del ideal por el factor de dilución - las moléculas de fluoresceína liberadas se vuelven diluidas en el volumen de reacción del reactivo de liberación.

Desafortunadamente, en determinadas circunstancias, el beneficio de la amplificación se puede compensar o incluso superar por la desventaja de la disipación de la señal. Por ejemplo, si la detección o determinación se realiza sobre una membrana, por ejemplo, en una tira de ensayo de flujo lateral, la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un dispositivo de ensayo para la detección de un material diana en una muestra de fluido, comprendiendo dicho dispositivo:

un sistema de detección de sustrato en fase sólida que comprende medios para el transporte de la muestra de fluido desde un sitio de aplicación de la muestra a un sitio de detección (18);

un marcador no catalítico, dispuesto en una posición (14) alejada de dicho sitio de detección, conjugado con una molécula de afinidad específica para el material diana, comprendiendo dicho marcador no catalítico una pluralidad de moléculas precursoras de la señal, pudiéndose convertir dichas moléculas precursoras señal en una pluralidad de moléculas de generación de señal detectable,

y

un medio portador (24) que comprende un disolvente para la disolución del marcador no catalítico y un espesante para producir la localización de la señal generada por dicha pluralidad de moléculas de generación de señal detectable en dicho sitio de detección que indica la presencia y / o cantidad de dicho material diana, disolviéndose dicho espesante en fase líquida en forma de una mezcla coloidal que forma una estructura interna que proporciona las propiedades del medio portador resultantes que varían desde las de un fluido de alta viscosidad a las de un gel;

en el que dicho dispositivo de ensayo es una tira de ensayo de flujo lateral que comprende además una tapa ópticamente transparente (26) cargada con dicho medio portador (24) para su colocación sobre la tira de ensayo después de la finalización de una reacción de detección de material diana, y en el que dicho medio portador está adaptado para ser puesto en contacto con dichas moléculas de señal, al menos, en dicho sitio de detección.

2. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la tapa ópticamente transparente (26) está articulada a un laminado trasero (1) para sostener los componentes porosos del dispositivo.

3. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además una capa protectora amovible que recubre el medio portador.

4. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que el sustrato en fase sólida es seleccionado entre una membrana porosa, incluyendo nitrocelulosa o nylon; o una superficie plana no porosa, incluyendo el vidrio, poliestireno, metal o carbono.

5. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que dicha molécula de afinidad es seleccionada entre los grupos que consisten en:

(a) péptidos o proteínas seleccionadas del grupo que consiste en anticuerpos, anticuerpos modificados genéticamente, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, receptores, antígenos, lectinas, avidinas, oligopéptidos, lipoproteínas, glicoproteínas, hormonas peptídicas y alérgenos;

(b) ácidos nucleicos seleccionados de entre el grupo que consiste en ADN, ARN, oligonucleótidos y aptámeros;

(c) carbohidratos seleccionados del grupo que consiste en mono., oligo, y polisacáridos, glicolípidos y proteo- polisacáridos; o

(d) ligandos de bajo peso molecular seleccionados del grupo que consiste en biotina, esteroides, hormonas, cofactores, activadores, inhibidores, fármacos, alérgenos o haptenos.

6. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende además un reactivo de desarrollo de señal contenido en dicho medio portador para la conversión de dicha pluralidad de moléculas precursoras de señal a dicha pluralidad de moléculas generadoras de señal detectable.

7. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 6, en el que dicha reactivo de desarrollo de señal es una base o esterasa.

8. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que dichas moléculas precursoras de señal son seleccionadas del grupo que consiste en fluoróforos, luminóforos, cromóforos, grupos prostéticos, o sustancias redox activas seleccionadas entre mediadores redox, sustancias electrodo activas, proteínas bioluminogénicas y fluorogénicas, colorantes visibles, colorantes fluorescentes, materiales bioluminiscentes o quimioluminiscentes, materiales electroquímicamente activos, o materiales magnéticos.

9. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 8, en el que las moléculas precursoras de señal son fluoróforos seleccionados del grupo que consiste en fluoresceínas, diacetato de fluoresceína (FDA),

isotiocianato de diacetato de fluoresceína (isotiocianato de FDA), diacetato de fluoresceína maleimida (FDA maleimida), cianinas, carbocianinas, rodaminas, xantenos, sustancias fluorescentes basadas en colorantes diazo y moléculas aromáticas y heteroaromáticas fluorescentes pequeñas.

1. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 9, en el que dichas moléculas precursoras de 5 señal son seleccionadas entre diacetato de fluoresceína (FDA), isotiocianato de diacetato de fluoresceína

(isotiocianato de FDA) y diacetato de fluoresceína maleimida (FDA maleimida) y que comprende además un reactivo de desarrollo de señal para el diacetato de fluoresceína (FDA), isotiocianato de diacetato de fluoresceína (isotiocianato de FDA) y diacetato de fluoresceína maleimida (FDA maleimida).

11. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 8, en el que las moléculas precursoras de 1 señal son diacetato de fluoresceína cristalina (FDA), y en el que el medio portador comprende un disolvente para

FDA, un reactivo de desarrollo de señal y un espesante.

12. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 11, en el que el medio portador comprende dimetil sulfóxido, hidróxido de sodio acuoso y Polisorbato 2.

13. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en la reivindicación 8, en el que las moléculas precursoras de 15 señal son cromóforos seleccionados del grupo que consiste en cianina, pirazolona, antraquinona, carbocianina,

rodamina, xanteno, carotenoides y diazo y monoazo, oxazina, indigoide, o sustancias colorantes basadas en riboflavina.

14. Un dispositivo de ensayo como se reivindica en cualquier reivindicación precedente, en el que la proporción de espesante en el medio portador varía del ,5% al 5% en peso en base al peso total del medio portador.