Procedimiento para fabricar proteínas recombinantes utilizando uno o más inhibidores de la apoptosis,

que comprende las etapas de:

(a)provisión de un vector que comprende un gen que codifica una proteína de interés;

(b)provisión de una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO);

(c)transformación o transfección de la célula huésped con el vector de la etapa (a);

(d)provisión de los medios de cultivo celular;

(e)provisión de una cantidad de inhibidor de caspasa z-VAD-fmk;

(f)mezclar el inhibidor de caspasa en los medios de cultivo celular;

(g)cultivo de la célula huésped transformada o transfectada en el medio de cultivo celular bajo las condiciones suficientes para la expresión de la proteína de interés; y, opcionalmente

(f)recuperación o purificación de la proteína de interés de la célula huésped y/o del medio de cultivo celular

Procedimientos de fabricación de proteínas recombinantes utilizando inhibidores de la apoptosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la mejora en los procedimientos de fabricación de proteínas recombinantes utilizando uno o más inhibidores de la apoptosis.

Antecedentes de la invención

Se cree que el control del número de células en los mamíferos viene determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, en ocasiones denominada muerte celular necrótica, se caracteriza normalmente por ser una forma patológica de muerte celular producida como resultado de algún tipo de trauma o de lesión celular. Por otra parte, existe otra forma, la forma "fisiológica" de muerte celular, que suele producirse de una manera ordenada o controlada. Esta forma ordenada o controlada de muerte celular se denomina, a menudo, "apoptosis" [ver, por ejemplo, Barr et al., Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller et al., Science, 267:1445-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica se produce de manera natural en numerosos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario y la selección clonal en el sistema inmunológico [Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)].

El control del número de células en un cultivo celular y en los biorreactores también es un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Existen datos en la literatura que indican que la muerte celular que se produce en los biorreactores puede ser un proceso apoptótico [Suzuki E., et al., Cytotechnology, 23:55-59 (1997); Al-Rubeai, M. y Singh R.P, Curr. Opin. Biotech, 9:152-156 (1998)]. Se ha descrito que el proceso apoptótico puede estar inducido por una deficiencia de nutrientes [Franek F. y Chládkova-Srámková K., Cytotechnology, 18:113-117 (1995); Mercille S. y Massie B., Biotechnol. Bioeng., 44:1140-1154 (1994); Singh R.F., et al., Biotechnol. Bioeng., 44:720-726 (1994)], deficiencia sérica [Singh R.P., et al., Biotechnol. Bioeng., 44:720-726 (1994); Zanghi A., et al., Biotech. Bioeng., 64:108-119 (1999)] o por otros parámetros controlables del cultivo celular en biorreactores, aunque no se trata de un proceso totalmente controlado debido a la mecánica de los biorreactores, a una falta de total comprensión de los parámetros necesarios para el cultivo, o por otras causas indeterminadas.

Tal como se entiende actualmente, el programa de la apoptosis o muerte celular contiene, al menos, tres elementos importantes: los activadores, los inhibidores y los efectores; en C. elegans, estos elementos están codificados, respectivamente, por tres genes, Ced-4, Ced-9 y Ced-3 [Steller, Science, 267:1445 (1995); Chinnaiyan et al., Science, 275:1122-1126 (1997); Wang et al., Cell, 90:1-20 (1997)]. Dos de los miembros de la familia de TNFR, TNFR1 y Fas/Apol (CD95), pueden activar la muerte celular apoptótica [Chinnaiyan y Dixit, Current Biology, 6:555-562 (1996); Fraser y Evan, Cell; 85:781-784 (1996)]. TNFR1 también es conocido por mediar la activación del factor de transcripción, NF-KB [Tartaglia et al., Cell, 74:845-853 (1993); Hsu et al., Cell, 84:299-308 (1996)]. Además de cierta homología ECD, estos dos receptores comparten homología en su dominio intracelular (ICD) en una interfase de oligomerización conocida como el dominio de muerte [Tartaglia et al., supra; Nagata, Cell, 88:355 (1997)]. Los dominios de muerte también se encuentran en diversas proteínas de metazoos que regulan la apoptosis, a saber, la proteína Drosophila, Reaper, y las proteínas de mamíferos denominadas FADD/MORT1, TRADD, y RIP [Cleaveland y Ihle, Cell, 81:479-482 (1995)].

Durante la unión del ligando y la agregación del receptor, se cree que TNFR1 y CD95 reclutan la proteína FADD para que entre a formar parte de un complejo de señalización inductor de la muerte. Supuestamente, CD95 se une directamente a FADD, mientras que TNFR1 se une a FADD indirectamente a través de TRADD [Chinnaiyan et al., Cell, 81:505-512 (1995); Boldin et al., J. Biol. Chem., 270:387-391 (1995); Hsu et al., supra; Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem., 271:4961-4965 (1996)]. Se ha descrito que FADD actúa como una proteína adaptadora que recluta la proteasa relacionada con Ced3, MACH-alfa/FLICE (caspasa 8), para que entre a formar parte de un complejo de señalización de muerte [Boldin et al., Cell, 85:803-815 (1996); Muzio et al., Cell, 85:817-827 (1996)]. MACH-alfa/FLICE parece ser el desencadenante que activa una cascada de proteasas apoptóticas, incluyendo la enzima conversora de interleucina-1beta (ICE) y la CPP32/Yama, que pueden ejecutar algunos aspectos críticos del programa de muerte celular [Fraser y Evan, supra].

Recientemente se ha revelado que la muerte celular programada implica la actividad de miembros de una familia de proteasas de cisteína relacionadas con el gen de muerte celular de C. elegans, Ced-3, y con la enzima conversora de IL-1 de mamífero, ICE. La actividad de las proteasas ICE y CPP32/Yama puede inhibirse por el producto del gen del virus de vaccinia, crmA [Ray et al., Cell, 69:597-604 (1992); Tewari et al., Cell, 81:801-809 (1995)]. Estudios recientes muestran que CrmA puede inhibir la muerte celular inducida por TNFR1 y CD95 [Enari et al., Nature, 375:78-81 (1995); Tewari et al., J. Biol. Chem., 270:3255-3260 (1995)].

Como se muestra en la revisión recientemente realizada por Tewari et al., TNFR1, TNFR2 y CD40 modulan la expresión de citoquinas proinflamatorias y coestimulatorias, de receptores de citoquinas, y de moléculas de adhesión celular mediante la activación del factor de transcripción, NF-KB [Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6:39-44 (1996)]. NF-KB es el prototipo de una familia de factores de transcripción diméricos cuyas subunidades contienen regiones Rel convervadas [Verma et al., Genes Develop., 9:2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14:649-681 (1996)]. En su forma latente, NF-KB forma un complejo con miembros de la familia de inhibidores de IKB; durante la inactivación de la IKB como respuesta a determinados estímulos, el NF-KB liberado se transloca al núcleo, en donde se une a secuencias específicas de ADN y activa la transcripción del gen.

Para revisiones recientes de dichas rutas de señalización, ver, por ejemplo, Ashkenazi et al., Science, 281:1305-1308 (1998); Nagata, Cell, 88:355-365 (1997).

Hasta la fecha se han publicado informes conflictivos en lo referente a los efectos de los inhibidores de caspasas y a la expresión de genes anti-apoptóticos en células recombinantes cultivadas. Por ejemplo, Murray et al., Biotech. Bioeng., 51:298-304 (1996) describen que la sobreexpresión de bcl-2 en células de mieloma NSO no afecta a la fase de decadencia característica de las células cultivadas. Otras investigaciones han encontrado, por el contrario, que bcl-2 puede ser efectivo en la prevención de la muerte de algunas líneas celulares bajo condiciones de cultivo celular [ver, por ejemplo, Itoh et al., Biotechnol. Bioeng., 48:118-122 (1995); Mastrangelo et al., TIBTECH, 16:88-95 (1998); Simpson et al., Biotechnol. Bioeng., 54:1-16 (1997); Singh et al., Biotechnol. Bioeng., 52:166-175 (1996)]. Goswami et al., Biotechnol. Bioeng., 62:632-640 (1999) publican que han observado que el inhibidor de caspasa, z-VAD-fmk, no es capaz de ampliar de forma significativa la vida de un cultivo libre de suero de células CHO. WO 98 35986A describe un procedimiento para fabricar una proteína recombinante (receptor TRAIL) utilizando un inhibidor de caspasa, z-VAD-fmk, en células huésped CV-1/EBNA.

Descripción de la invención

La presente invención se basa en los descubrimientos de los Solicitantes que, utilizando uno o más inhibidores de la apoptosis en cultivos de células recombinantes y en la producción de proteínas, pueden reducir de forma significativa la apoptosis en el cultivo celular...

1. Procedimiento para fabricar proteínas recombinantes utilizando uno o más inhibidores de la apoptosis, que comprende las etapas de:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células huésped son cultivadas bajo condiciones para la expresión transitoria de la proteína de interés.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la proteína de interés comprende una proteína que es capaz de inducir la apoptosis en una célula de mamífero o de no mamífero.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho medio de cultivo celular es un medio libre de suero.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que, tras la etapa (g), la célula o células huésped y/o el medio de cultivo celular se congelan y posteriormente se descongelan.